CN105209596A - 用于鲍鱼水产养殖的益生菌的生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用新型生物加工技术来生产鲍鱼益生微生物的工艺和培养基。目前并不存在用于生产鲍鱼益生菌的商业上可行的生物工艺。本发明促进了如下的鲍鱼益生菌的生物生产：从细菌益生菌Vibrio？midae、或酵母益生菌汉逊德巴利酵母或者它们的组合的小体积低温培养物生产益生菌产物。本发明描述了接种程序、发酵工艺、生物质收集以及将生物质制成可掺入到鲍鱼饲料中的液体产品或干燥产品。

Description

用于鲍鱼水产养殖的益生菌的生产
背景技术
本发明涉及利用新型生物加工技术来生产用于鲍鱼水产养殖的益生微生物的工艺和培养基。
目前并不存在生产鲍鱼益生菌的生物工艺。本发明促进了如下的鲍鱼益生菌的生物生产：从细菌益生菌Vibriomidae、或酵母益生菌汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)或者它们的组合的小体积低温培养物生产益生菌产物。本发明描述了培养基、接种程序、发酵工艺、生物质收集以及将生物质配制成可掺入到鲍鱼饲料中的液体产品和/或干燥产品。
鲍鱼(鲍科(Haliotidae))是全球性地分布于沿海的温带和热带水域的海洋古腹足类(vestigastropod)软体动物(Degnan等，2006)。鲍科由约56个种组成，全部种均属于鲍属(Haliotis)。鲍鱼是世界上最有价值的海产品品种之一(Reddy-Lopata等，2006)，在其已开发利用多年的远东地区具有相当大的需求量(Francis等，2007)。通常对鲍鱼的需求远超过其供应，由于非法采集和偷猎，给天然鲍鱼的存量造成巨大压力。某些大型鲍鱼的肉被许多人认为是理想的食品，并被认为是世界上最昂贵的蛋白产品之一。这种高价值促进了密集型鲍鱼水产养殖的发展和优化(Park等，2007)。然而，鲍鱼水产养殖受到诸如水质差、此类海洋软体动物固有的缓慢的生长速度和疾病等因素的挑战。
鲍鱼水产养殖的成功依赖于适当的营养和疾病的消除(Naidoo等，2006)。该问题的传统解决方案是在鲍鱼的水产养殖中使用抗微生物药物，然而该方式会导致抗生素耐药性细菌的发展(Schwarz等，2001)，对环境和鲍鱼养殖造成负面影响，同时造成消费者的抵制。Macey和Coyne(2006)提出补充有益生菌的饲料改善了鲍鱼的免疫系统和生长。
鲍鱼具有极其缓慢的生长速度，需要花费近四年来达到市场可接受的尺寸。因此，迫切需要研究加快鲍鱼的生长速度并提高其疾病耐受性的方法。
对于鲍鱼养殖业面临的挑战，可选的方式是使用益生微生物。由于对环境友好型水产养殖需求的增加，该技术变得普及。益生菌是活的微生物，在以适当量给予时赋予宿主以保健效应。它们显示出控制疾病、改善消化以及提高养殖品种的免疫力和整体生长。
Macey和Coyne(2006)从作为鲍鱼的南非鲍(Haliotismidae)的胃肠道中分离出Vibriomidae和汉逊德巴利酵母，并对益生菌活性、特别是提高鲍鱼生长速度的能力进行了评价。Macey和Coyne(2005)进行的研究显示，对鲍鱼饲料补充这些益生微生物产生改善的生长速度。益生微生物能够分解存在于天然海藻(鲍鱼食料)中的复杂多糖和蛋白并且能够增高消化效率，由此改善鲍鱼的生长速度(Coyne等，2004)。这些微生物提高了鲍鱼肠内的一些活性，如噬菌作用活性、蛋白酶活性和淀粉酶活性。
目前的技术描述了天然存在的细菌和酵母在水产养殖中作为益生菌的用途。在这方面，现有技术公开了来自弧菌科(vibrionaceae)的细菌在对虾(Ruangpan等，1998)和褐虾(Austin等，1995)的水产养殖中作为益生菌的用途。Nair等，1985；Carraturo等，2006和Castro等，2006报道了从海洋环境中分离的其它弧菌种也显示出益生菌效果。
南非专利2004/06777以及Macey和Coyne(2005，2006)进行的工作描述了Vibriomidae和汉逊德巴利酵母在鲍鱼的水产养殖中作为益生菌的用途。该工作的主要部分中，在22℃下于海洋肉汤(MB)中培养Vibriomidae，在22℃下于酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤(YPD)培养基中培养汉逊德巴利酵母。Macey和Coyne进行的工作并未研究最佳培养条件、细胞培养物浓度，并未测量培养物的光密度和/或测量生物质的生产。对Macey和Coyne使用的工艺和生产培养基与本发明的工艺和生产培养基进行的比较性评价表明，与现有技术中关于Vibriomidae和汉逊德巴利酵母的描述相比，本发明人能够将Vibriomidae和汉逊德巴利酵母的细胞产率显著提高多个数量级(参见实施例3)。
汉逊德巴利酵母通常用作工业酵母。之前对该酵母进行的研究一般并未关注将其作为全细胞生物催化剂的用途，而是关注该酵母在代谢产物(如甘油和木糖)生产中用途(Adler和Gustafsson，1980；Parajo等，1997)。
然而，现有技术将汉逊德巴利酵母描述为水生物种(例如，鲈鱼(Tovar等，2002)和虹鳟鱼(Andlid等，1995))的微生物群中的一员。在这些研究中，同样在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤(YPD)中培养汉逊德巴利酵母，并且这些研究均未对最佳培养条件、细胞培养浓度、光密度或生物质生产进行研究。
本申请文件描述了用于培养Vibriomidae和汉逊德巴利酵母的新型高产率生物工艺以及Vibriomidae和汉逊德巴利酵母在水产养殖中的用途。该领域中此前的工作并没有提供用于鲍鱼益生菌的大规模生产的工艺。
发明内容
本发明提供了用于生产益生菌饲料组合物的新型工艺，其中，所述益生菌饲料组合物包含Vibriomidae的活的培养物和/或汉逊德巴利酵母细胞的活的培养物和/或所述活的培养物的组合。
根据本发明的第一方面，提供了用于培养益生菌的生长培养基，所述益生菌用于生产鲍鱼的益生菌组合物和益生菌饲料。
在本发明的一个实施方式中，生长培养基是细菌生长培养基，所述细菌生长培养基包含：柠檬酸、H3PO4、约0g/l-约4g/l(NH4)2SO4、Ca(NO3)2、MnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、KCl、约20g/l-约40g/lNaCl、MgCl2·6H2O、约42g/l-约255g/l玉米浆、约1g/l-约40g/l转化的高级糖蜜(invertedhightestmolasses)、以及约0.5ml/l-约5ml/l消泡剂；该生长培养基的pH为约5-约8。优选的是，细菌生长培养基包含约1g/l柠檬酸、约2·5ml/lH3PO4、约0·4g/lCa(NO3)2、约0·040g/lMnSO4·7H2O、约0·032g/lFeSO4·7H2O、约1g/lKCl、约30g/lNaCl、约2.3g/lMgCl2·6H2O、约54.4g/l玉米浆、约24g/l转化的高级糖蜜、以及约1ml/l消泡剂；其中，该生长培养基的pH维持在约6.5。与海洋肉汤(MB)培养基相比，该细菌生长培养基支持显著更高的Vibriomidae的细胞产率(g/l/h)。
在本发明的另一实施方式中，生长培养基是酵母生长培养基，所述酵母生长培养基包含：柠檬酸、H3PO4、约18g/l-约30g/l(NH4)2SO4、MgSO4·7H2SO4、CaCl2·2H2O、约0g/l-约40g/lNaCl、KH2PO4、约8g/l-约212g/l玉米浆、约1g/l-约40g/l转化的高级糖蜜、以及约0.5ml/l-约5ml/l消泡剂；该生长培养基的pH为约4-约7。优选的是，酵母生长培养基包含约2.5g/l柠檬酸、约16.3ml/lH3PO4、约30g/l(NH4)2SO4、约8.2g/lMgSO4·7H2SO4、约0.8g/lCaCl2·2H2O、约0.1g/lNaCl、约11.3g/lKH2PO4、约204g/l玉米浆、约10g/l葡萄糖、以及约1ml/l消泡剂；其中，该生长培养基的pH维持在约5.6。与酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖(YPD)培养基相比，该酵母生长培养基支持显著更高的汉逊德巴利酵母的细胞产率(g/l/h)。
根据本发明的第二方面，提供了用于生产益生菌组合物的工艺，其中，所述工艺包括如下步骤：(i)通过将活的Vibriomidae细胞和/或活的汉逊德巴利酵母细胞的培养物接种至接种物培养基，制备预发酵培养物；(ii)将预发酵培养物接种至反应器中含有的生长培养基；(iii)在Vibriomidae细胞和/或汉逊德巴利酵母细胞的生长期期间，控制生长培养基的pH、温度、气流量、氧饱和度以及背压；(iv)在对数生长中期和稳定生长期之间，当细胞处于稳定形式且活细胞的浓度为2×108个细胞/ml至1×1011个细胞/ml时，收集Vibriomidae细胞；或者，在对数生长中期和对数生长晚期之间，当活细胞的浓度为4×107个细胞/ml至2×1010个细胞/ml时，收集汉逊德巴利酵母细胞；以及(v)通过将收集的Vibriomidae细胞和/或汉逊德巴利酵母细胞重悬于缓冲液中，生产液体产品。
本申请文件中描述的分离的Vibriomidae于2013年7月1月保藏在BelgianCoordinatedCollectionsofMicroorganisms(BCCM)，保藏编号为LMGP-27727。同样，本申请文件描述的分离的汉逊德巴利酵母培养物于2013年7月1日保藏，保藏编号为MUCL54982。
所述工艺可进一步包括如下步骤：(vi)将液体产品与载体、稳定剂或填料进行混合，以形成生物质糊状物；以及(vii)将生物质糊状物进行干燥，以生产干燥产品。
本发明的工艺可为间歇工艺或间歇补料工艺。优选的是，对于Vibriomidae而言，所述工艺为间歇工艺；对于汉逊德巴利酵母而言，所述工艺为间歇补料工艺。
在本发明的优选实施方式中，进入用于间歇补料工艺或间歇工艺的反应器中的气流量为0.5v/v/m-2.0v/v/m。优选的是，进入反应器中的气流量为1v/v/m。
在本发明进一步优选的实施方式中，发酵培养基中的溶解氧优选处于20％-100％的饱和度。更优选的是，溶解氧维持在30％的饱和度。
在本发明进一步优选的实施方式中，反应器中的背压优选为0-250kPa。更优选的是，反应器中的背压为50kPa。
优选将Vibriomidae细胞在20℃-34℃的温度下于培养基中进行培养。最优选将Vibriomidae细胞在30℃的温度下进行培养。另一方面，优选将汉逊德巴利酵母细胞在16℃-34℃的温度下于培养基中进行培养。最优选将汉逊德巴利酵母细胞在24℃的温度下进行培养。
Vibriomidae的培养基的pH优选为5.0-8.0，最优选该pH为6.5。汉逊德巴利酵母的培养基的pH优选为4.0-7.0，最优选该pH为5.6。
应理解的是，本发明工艺中使用的生长培养基包含用于Vibriomidae和/或汉逊德巴利酵母细胞生长的营养物。所述营养物选自于由无机盐、碳源、氮源、维生素、微量元素、消泡剂和上述物质的混合物所组成的组。此外，应理解的是，接种物培养基包含用于本发明工艺中使用的益生菌的生长的营养物，所述营养物选自于由如下物质所组成的组：无机盐、碳源、氮源、维生素、微量元素和上述物质的混合物。
在本发明的一个实施方式中，通过离心或过滤从生长培养基中收集益生微生物。在优选的实施方式中，通过垂直管离心收集益生微生物。
在本发明的优选实施方式中，将益生微生物Vibriomidae重悬于磷酸盐缓冲液中，从而生成液体产品。类似地，将益生微生物汉逊德巴利酵母重悬于磷酸盐缓冲液中，从而生成液体产品；优选磷酸盐缓冲液包含约4m/m％-20m/m％海藻糖、优选12.5m/m％海藻糖；该缓冲液的pH为约4-6，优选该pH为4.5。
在本发明进一步优选的实施方式中，将液体产品与载体进行组合以形成混合产品，所述载体选自于由微晶纤维素、海藻糖、蔗糖和脱脂奶或它们的组合所组成的组。在另一优选的实施方式中，将生物质糊状物挤出并干燥，从而形成干燥产品。
通常在30℃-70℃的温度下对与载体组合的Vibriomidae液体产品进行挤出，然而优选在45℃的温度下进行挤出。通常在30℃-50℃的温度下对与载体组合的汉逊德巴利酵母液体产品进行挤出，然而优选在45℃的温度下进行挤出。
根据本发明的第三方面，提供了用于鲍鱼水产养殖的、包含根据本发明的工艺制造的液体产品或干燥产品的益生菌组合物，所述液体产品或干燥产品包含Vibriomidae细胞和/或汉逊德巴利酵母细胞和/或二者的组合。
在本发明的优选实施方式中，将根据本发明工艺制得的液体产品或干燥产品配制成鲍鱼饲料。另外，可通过在饲料挤出前进行预混合、真空注入预制备的鲍鱼饲料中或对已有饲料进行表面涂覆(topcoating)，将液体产品或干燥产品与鲍鱼饲料组合。
通常在30℃-70℃的温度下对与鲍鱼饲料组合的Vibriomidae液体产品或干燥产品进行挤出，然而优选在45℃的温度下进行挤出。通常在30℃-70℃的温度下对与鲍鱼饲料组合的汉逊德巴利酵母液体产品或干燥产品进行挤出，然而优选在45℃的温度下进行挤出。
本发明又一方面提供了用于鲍鱼的益生菌组合物，所述益生菌组合物包含本发明的Vibriomidae益生菌组合物和汉逊德巴利酵母益生菌组合物与鲍鱼饲料的组合。
附图说明
现仅以示例的方式，参照附图对本发明的非限定性实施方式进行描述。
图1a：在2L的BraunB生物反应器中、于一系列的温度条件下(10℃-40℃)培养Vibriomidae期间获得的细胞产率(CFU/ml/h)数据。
图1b：在2L的BraunB生物反应器中、于一系列的温度条件下(10℃-40℃)培养汉逊德巴利酵母期间获得的细胞产率(CFU/ml/h)数据。
图2a：在2L的BraunB生物反应器中、于一系列的pH条件下(5.0-8.0)培养Vibriomidae期间获得的细胞产率(CFU/ml/h)数据。
图2b：在2L的BraunB生物反应器中、于一系列的pH条件下(4.0-7.0)培养汉逊德巴利酵母期间获得的细胞产率(CFU/ml/h)数据。
图3a：在15L的BraunC生物反应器中、于包含多种浓度的CSL的发酵培养基中培养生物体期间测得的Vibriomidae的细胞产率。
图3b：在15L的BraunC生物反应器中、于包含多种浓度的CSL的发酵培养基中培养生物体期间测得的汉逊德巴利酵母的细胞产率。
图4a：在15L的BraunC生物反应器中、于包含多种浓度的TSAI的发酵培养基中培养生物体期间测得的Vibriomidae的细胞产率。
图4b：在15L的BraunC生物反应器中、于包含多种浓度的TSAI的发酵培养基中培养生物体期间测得的汉逊德巴利酵母的细胞产率。
图5：在内部开发的生长培养基中进行Vibriomidae的生长以实现生物体的高细胞密度生产。
图6：描述如下的发酵曲线，所述发酵曲线描述了对在15L的BraunC生物反应器的最佳发酵培养基中的Vibriomidae的生长而言的操作参数。
图7：在补充有54.4g/lCSL和25g/lHTM的培养基中培养Vibriomidae期间进行评价并获得的关键响应。
图8：在内部开发的生长培养基中进行汉逊德巴利酵母的生长以实现生物体的高细胞密度生产。
图9：描述如下的发酵曲线，所述发酵曲线描述了对在15L的BraunC生物反应器的最佳发酵培养基中的汉逊德巴利酵母的生长而言的操作参数。
图10：在补充有24g/lCSL和10g/lHTM的培养基中培养汉逊德巴利酵母菌株期间获得的关键响应。
具体实施方式
现参照附图，在下文中对本发明进行更全面的描述，在附图中示出本发明的一些、但并非全部的实施方式。
所描述的发明不应限于所公开的特定实施方式，并且修改和其它实施方式旨在包含于本发明的范围内。虽然本文中采用了特定的术语，但是这些术语仅以一般性和描述性意义使用，而并不用于限定的目的。
所使用的词语“包含/包括(comprise)”及该词语的变体(例如“comprising”和“comprises”)意味着“包括但不限于”，而并不旨在排除例如其它添加剂、组分、整数(integers)或步骤。
本文中使用的术语“活的细菌细胞”或“活的酵母细胞”是指活着的、且能够增殖和/或繁殖的微生物，或者指活的但不可培养的处于营养(vegetative)状态、冷冻状态、保藏状态或重构(reconstitued)状态的微生物。
本文中使用的术语“活细胞的产量”或“活细胞的浓度”是指每测量单位(例如升、毫升、千克、克或毫克)的处于液体培养、浓缩或保藏状态的活细胞的数量，并可包含活的但不可培养的活细菌细胞和/或活酵母细胞。
本文中使用的术语“细胞保藏”是指取出营养细胞并将其以随时间推移仍保持存活力的代谢非活性状态进行保藏的工艺。本文中使用的术语“产品”是指能够与其它组分混合且含有指定浓度的活细胞的微生物组合物，该产品能够销售和使用。
本文中使用的术语“益生菌”是指向宿主生物体赋予有益效果的一种或多种活的微生物。消化道内的益生微生物的建立带来的益处包括：减少病原体负荷、改善微生物发酵模式、改善营养吸收、改善免疫功能和帮助消化。
本文中使用的术语“发酵”是指通过生物体进行的将一种物质转化成另一物质的代谢过程，在该过程中细胞能够获得细胞能量(例如，当生物体利用葡萄糖并将其转化成乳酸或丙酸时)。在本申请中，利用发酵工艺产生细胞能量，从而促进细菌菌株和/或酵母菌株的生殖，并由此生产更多的此类微生物。
本发明的工艺提供了鲍鱼饲料的生产，所述鲍鱼饲料包含Vibriomidae细菌或汉逊德巴利酵母、或者二者的组合。
通过以高产率的发酵工艺繁殖这些微生物来生产益生菌。
本发明的发酵工艺可为间歇工艺或间歇补料工艺。然而，对于Vibriomidae而言，所述工艺优选为间歇工艺；对于汉逊德巴利酵母而言，所述工艺优选为间歇补料工艺。
对于Vibriomidae或汉逊德巴利酵母而言，发酵的气流量为0.5v/v/m-2.0v/v/m、优选为1v/v/m。对于Vibriomidae或汉逊德巴利酵母而言，将发酵的搅拌速度控制为维持溶解氧处于20％-100％的饱和度、优选处于30％的饱和度。对于Vibriomidae或汉逊德巴利酵母而言，发酵的氧利用率为10mMol/l/h-210mMol/l/h，并且对于Vibriomidae而言，标称为160mMol/l/h，对于汉逊德巴利酵母而言，标称为200mMol/l/h。
发酵的背压为0-250kPa，发酵的背压最优为50kPa。
对于Vibriomidae而言，发酵的温度为20℃-34℃、最优为30℃(图1a)；对于汉逊德巴利酵母而言，发酵温度为16℃-34℃、最优为24℃(图1b)。
对于Vibriomidae而言，发酵的pH为5.0-8.0、最优为6.5(图2a)；对于汉逊德巴利酵母而言，发酵的pH为4.0-7.0、最优为5.6(图2b)。利用酸或碱控制发酵的pH。所述酸优选为硫酸，所述碱优选为氨水。
生长培养基包含盐，对于Vibriomidae而言，优选包含如下物质：六水合氯化镁、氯化钾、柠檬酸、硝酸钙、四水合硫酸锰、七水合硫酸铁和磷酸；对于汉逊德巴利酵母而言，优选包含如下物质：柠檬酸、七水合硫酸镁、无水氯化钙、磷酸二氢钾和磷酸。
生长培养基包含无机氮、NaCl、消泡剂、碳水化合物的源和有机营养源。无机氮源可为硫酸铵，对于Vibriomidae而言，硫酸铵可为0-15g/l、优选0-4g/l、最优选0g/l；对于汉逊德巴利酵母而言，硫酸铵可为15g/l-50g/l、优选18g/l-30g/l、最优选18.5g/l。对于Vibriomidae而言，NaCl源为10g/l-50g/l、优选20g/l-40g/l、最优选30g/l；对于汉逊德巴利酵母而言，NaCl源为0-10g/l、优选0.1g/l。生长培养基以0.5ml/l-10ml/l、优选1ml/l-5ml/l、最优选1ml/l包含消泡剂。有机营养源可为玉米浆(下文称为“CSL”)、蛋白胨、酵母提取物和/或酪蛋白水解物，优选经液体植酸酶处理并超滤过的CSL，对于Vibriomidae而言，经液体植酸酶处理并超滤过的CSL为42g/l-255g/l、最优浓度为54.4g/l(图3a)，对于汉逊德巴利酵母而言，经液体植酸酶处理并超滤过的CSL为8g/l-212g/l、最优浓度为204g/l(图3b)。碳水化合物源可为葡萄糖、果糖、蔗糖和糖蜜，然而，对于Vibriomidae而言，碳水化合物源优选为1g/l-40g/l转化总糖(下文称为“TSAI”)、最优为24g/l的转化的高级糖蜜(下文称为“HTM”)(图4a)，对于汉逊德巴利酵母而言，碳水化合物源为1g/l-40g/l、最优为10g/l的TSAI(葡萄糖或HTM)(图4b)。
在接种期，使微生物在与生长培养基类似的接种物培养基中生长，以改善产率和稳健性，对于Vibriomidae而言，生长培养基为：六水合氯化镁、氯化钾、柠檬酸、硝酸钙、四水合硫酸锰、七水合硫酸铁、磷酸、酵母提取物、酪蛋白水解物和蛋白胨；或者，对于汉逊德巴利酵母而言，生长培养基为：柠檬酸、七水合硫酸镁、无水氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸和酵母提取物。
对于Vibriomidae而言，发酵产率为1.0×108-1.6×1013个细胞/l/h、最优为1.5×1013个细胞/l/h；对于汉逊德巴利酵母而言，发酵产率为3.0×104-7.0×1011个细胞/l/h、最优为6.4×1011个细胞/l/h。
对于Vibriomidae而言，发酵的微生物细胞浓度为2×108-1×1011个细胞/ml、最优为9.2×1010个细胞/ml；对于汉逊德巴利酵母而言，发酵的微生物细胞浓度为4.0×107-2.0×1010个细胞/ml、最优为1.6×1010个细胞/ml。
通过离心或过滤、优选通过垂直管离心和/或连续离心从发酵液中收集经培养的Vibriomidae或汉逊德巴利酵母。
可将生物质配制成合适的缓冲液、优选含有NaCl的磷酸盐缓冲液，以产生益生菌液体产品。或者，对于汉逊德巴利酵母而言，磷酸盐缓冲液包含约4m/m％-20m/m％海藻糖、优选12.5m/m％海藻糖；所述缓冲液的pH为约4-6，优选该pH为4.5。
可将液体产品形式与干燥的载体、稳定剂或填料配制成生物质糊状物，所述载体、稳定剂或填料例如为微晶纤维素(下文称作“MCC”)、海藻糖、蔗糖或脱脂奶，优选海藻糖和MCC的组合。
可将生物质糊状物挤出并干燥，从而生成益生菌干燥产品。可在30℃-50℃的温度下将生物质糊状物挤出，然而优选在45℃的温度下将生物质糊状物挤出。
通过在饲料挤出前进行预混合、或者通过真空注入已有的饲料中或对已有饲料进行表面涂覆，可将益生菌液体产品或益生菌干燥产品配制成鲍鱼饲料。
没有发现证据表明，以高细胞密度培养物或者以比起现有技术中的描述显著更高的细胞产率(g/h/l)产生本文所述的生物体。此外，标准工艺通常产生1×109个细胞/ml的细胞滴度，出乎预料的是，使用本申请文件中所述的工艺产生显著更高的细胞滴度(对于汉逊德巴利酵母而言为1.57×1010个细胞/ml；对于Vibriomidae而言为9.72×1010个细胞/ml)。
实施例
以说明的方式、而非限定的方式提供如下实施例。
实施例1
鲍鱼益生菌Vibriomidae的生产
已知的是，本文所述的Vibriomidae处于活的、但不可培养(VNBC)的状态。然而，本文所述的工艺和培养基使得Vibriomidae能够进入可培养的状态，从而大规模生产这些益生菌。
Vibriomidae的接种
将单个冻存管的Vibriomidae接种于各接种瓶(1.8l，Fernbach)。各接种瓶中的生长培养基由如下物质组成：1g/l柠檬酸、2.5ml/lH3PO4、3g/l(NH4)2SO4、0.4g/lCa(NO3)2、0.04g/lMnSO4·7H2O、0.032g/lFeSO4·7H2O、1g/lKCl、30g/lNaCl、2.3g/lMgCl2·6H2O、5g/l酪蛋白水解物、5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨(Biolab)和10g/l葡萄糖。用10v/v％H2SO4或25v/v％NH4OH将生长培养基的pH调节至6.5，然后在121℃下灭菌15分钟。在接种后，在定轨摇床(Innova2300，NewBrunswickScientific，Edison，NJ，USA)中于30℃和180rpm的速度下将接种瓶孵育4.5h(OD660nm～2.0)。Vibriomidae的发酵工艺
使用单个接种瓶对各发酵罐进行接种。在工作体积为10l的15lBiostatCTM发酵罐(SartoriusBBI系统，Melsungen，德国)中实施发酵工艺。
发酵罐中使用的生长培养基含有如下培养基成分：1g/l柠檬酸、2.5ml/lH3PO4、0.4g/lCa(NO3)2、0.040g/lMnSO4·7H2O、0.032g/lFeSO4·7H2O、1g/lKCl、30g/lNaCl、2.3g/lMgCl2·6H2O、54.4g/lCSL和24g/lHTM。将生长培养基的盐、消泡剂(1ml/lPluriolTMP2000，BASF，Ludwigshafen，德国)和CSL加入至初始装载物中并使之达到9.3l。将初始装载物灭菌后，加入单独灭菌的HTM溶液。发酵温度维持在30℃。将搅拌器速度设定为500rpm并升高至1000rpm，以保持溶解氧高于30％的饱和度。用10v/v％H2SO4或25v/v％NH4OH将pH维持在6.5。将通气设定为1v/v/m。
Vibriomidae菌株的下游工艺
使用Sharples-Stokes离心机(Pennwalt，法国)对发酵液进行离心。离心管的速度为15700g，发酵液的进料速度为30l/h。弃去上清液，并将生物质用磷酸盐缓冲液(0.11m/m％KH2PO4、0.71m/m％K2HPO4、2.91m/m％NaCl、96.27m/m％H2O，)进行配制。使用顶置式搅拌器(桨式搅拌器)使液体产品均质化(1000rpm)。
对于挤出的干燥产品形式，将细菌(在磷酸盐缓冲液中配制)与MCC(液体产品:MCC以质量计为1:1)和海藻糖(5m/m％)在食品混合器(KMX50，Kenwood，London，UK)中进行混合。将混合物通过筛网型挤出机(NicaE-140挤出机，Niro-Aeromatic，Southampton，UK)进行冷挤出，随后使用实验室规模的AeromaticFluidisedBedDryer(AeromaticAG，德国)将混合物对流干燥至～10m/m％。入口气流量设定为50m3/h并处于环境温度下。
对于鲍鱼饲料而言，将经离心的生物质重悬于人工海水(ASW)缓冲液中。将重悬的缓冲液加入到鲍鱼饲料中，使用螺杆挤出机进行冷挤出，并在对流烘箱中(30℃)干燥至～10m/m％的最终水分含量。在30-70℃温度下将所述重悬的生物质挤出。然而，优选在45℃的温度下将生物质糊状物挤出。
结果
当在含有24g/lHTM和54.4g/lCSL的培养基中对Vibriomidae培养6h后，获得9.7×1010个细胞/ml的最大细胞浓度和11.1的光密度(图5)。
在整个发酵中，将气流量和温度维持在1v/v/m和30℃。用10v/v％H2SO4或25v/v％NH4OH将pH自动控制在6.5。必要时，通过提高搅拌速度使PO2维持高于30％。在本发酵过程中，实现的最大氧气利用率(OUR)为160mMol/l/h(图6)。
测量的关键响应是：生长速度，细胞浓度，细胞产率，以及相对于蛋白而言的细胞产量(YPP)、相对于糖而言的细胞产量(YPS)和相对于氧气而言的细胞产量(YPO)(图7)。
观察到的生长速度为1.0/h。通过将Vibriomidae在发酵培养基中进行培养，获得9.7×1010个细胞/ml的最大细胞浓度以及1.6×1013个细胞/ml/h的细胞产率。相对于蛋白、糖和氧气而言，Vibriomidae细胞产量分别是1.8×1013个细胞/g、4.1×1012个细胞/g和2.0×1010个细胞/g(图7)。
液体产品具有100天的半寿期(存储于4℃)。配制成初始计数为2×1010CFU/ml的终产品，储存寿命为669天(至计数为1×108CFU/ml的终产品)。
挤出产品具有4.86天的半寿期(存储于4℃)。配制成初始计数为2×1010CFU/ml的终产品，储存寿命为31.5天(至计数为1×108CFU/ml的终产品)。
鲍鱼饲料具有22.4天的半寿期(存储于4℃)。配制成初始计数为2×1010CFU/ml的终产品，储存寿命为156.8天(至计数为1×108CFU/ml的终产品)。
此前可利用的涉及Vibriomidae的生长、培养和维持的信息非常有限。只有一篇给予了该生物体生长的信息的文献，该文献由分离该生物体的人提供(Macey和Coyne，2006)。在其出版物中，他们教导了在22℃的温度下于pH为～7.0下在标准海洋肉汤(MB)中对Vibriomidae进行培养。
另一方面，本发明提供了细菌生长培养基，使Vibriomidae的产率提高27％，并使生产成本大幅降低(109108％)。
此外，Macey和Coyne，2006的教导建议最佳生长温度为22℃，然而发现，将温度升高到30℃使得细胞产率增加1077倍。进而，当使用所述的细菌生长培养基时，通过将pH调节至稍微更加酸性的6.5，使得细胞产率进一步增加333％。
通过在最佳pH和温度下使用CSL作为营养源，工艺的性能得到显著改善，并出乎预料地使细胞浓度增加24％，细胞产率增加2750倍，并使生产成本降低1.82×106％。
此外，通过引入HTM作为碳源，该工艺使得细胞浓度增加181％，细胞产率增加5705倍，并使生产成本降低3.74×106％。
上述因素的组合使得开发出生产作为益生菌的Vibriomidae的新工艺，该工艺具有显著提高的产率、浓度和产量，并使该生物体的生产成本大幅降低。
相比于此前的生产工艺，利用本实施例的工艺、在本文所述的培养基中对Vibriomidae进行培养的累积效果使得产率提高3117倍。该增高的产出量可归因于新的生长培养基以及最佳温度和pH的使用。通过将常用的氮源和碳水化合物源替换成CSL和HTM，该工艺的产率进一步提高83％。在最终的工艺优化步骤中，观察到99％的成本降低。该研究提供了关于Vibriomidae培养的大量新知识。
实施例2
作为鲍鱼益生菌的汉逊德巴利酵母的生产
汉逊德巴利酵母的接种
将单个冻存管的汉逊德巴利酵母(5.9×108CFU/ml)接种于各接种瓶(1.8l，Fernbach)中。各接种瓶中的生长培养基由如下物质组成：2.5g/l柠檬酸、16.3ml/lH3PO4、30g/l(NH4)2SO4、8.2g/lMgSO4·7H2SO4、0.8g/lCaCl2·2H2O、0.1g/lNaCl、11.3g/lKH2PO4、10g/l酵母提取物和10g/l葡萄糖。用10v/v％H2SO4或25v/v％NH4OH将生长培养基的pH调节至5.6，然后在121℃下灭菌15分钟。在接种后，在定轨摇床(Innova2300，NewBrunswickScientific，Edison，NJ，USA)中于24℃和180rpm的速度下将接种瓶孵育22h(OD660nm～4.0)。
汉逊德巴利酵母的发酵工艺
使用单个接种瓶对各发酵罐进行接种。在工作体积为10l的15lBiostatCTM发酵罐(SartoriusBBI系统，Melsungen，德国)中实施发酵工艺。
发酵罐中使用的生长培养基含有如下培养基成分(g/l)：2.5g/l柠檬酸、16.3ml/lH3PO4、30g/l(NH4)2SO4、8.2g/lMgSO4·7H2SO4、0.8g/lCaCl2·2H2O、0.1g/lNaCl、11.3g/lKH2PO4、204g/lCSL以及10g/l葡萄糖或HTM。将生长培养基的盐、消泡剂(1ml/l，PluriolTMP2000，BASF，Ludwigshafen，德国)和CSL加入至初始装载物中并使之达至9.3l。将初始装载物灭菌后，加入单独灭菌的HTM溶液。发酵温度维持在24℃。将搅拌器速度设定为500rpm并升高至1000rpm，以保持溶解氧高于30％的饱和度。用10v/v％H2SO4或25v/v％NH4OH将pH维持在5.6。将通气设定为1v/v/m。
汉逊德巴利酵母菌株的下游工艺
使用Sharples-Stokes离心机(Pennwalt，法国)对发酵液进行离心。离心管的速度为15700g，发酵液的进料速度为30l/h。弃去上清液，并将生物质用磷酸盐缓冲液(0.11m/m％KH2PO4、0.71m/m％K2HPO4、2.91m/m％NaCl、96.27m/m％H2O)进行配制。使用顶置式搅拌器(桨式搅拌器)使液体产品均质化(1000rpm)。
对于挤出的干燥产品形式，将汉逊德巴利酵母(在液体磷酸盐缓冲液中配制)与MCC(液体产品:MCC以质量计为1:1)和海藻糖(5m/m％)在食品混合器(KMX50，Kenwood，London，UK)中进行混合。将混合物通过筛网型挤出机(NicaE-140挤出机，Niro-Aeromatic，Southampton，UK)进行冷挤出，随后使用实验室规模的AeromaticFluidisedBedDryer(AeromaticAG，德国)将混合物对流干燥至～10m/m％。入口气流量设定为50m3/h并处于环境温度下。
对于鲍鱼饲料的配制而言，将离心的生物质重悬于人工海水(ASW)缓冲液中。将重悬的缓冲液加入到鲍鱼饲料中，使用螺杆挤出机进行冷挤出，并在对流烘箱中(30℃)干燥至～10m/m％的最终水分含量。在30-50℃的温度下将所述重悬的生物质挤出。然而，优选在45℃的温度下将生物质糊状物挤出。
结果
当在含有25g/lHTM和24g/lCSL的培养基中对汉逊德巴利酵母培养22h后，获得8.4×109个细胞/ml的最大细胞浓度和37.9的光密度(图8)。
在整个发酵中，将气流量和温度维持在1v/v/m和24℃。用10v/v％H2SO4或25v/v％NH4OH将pH自动控制在5.6。必要时，通过提高搅拌速度使PO2维持高于30％。在本发酵过程中，实现的最大氧气利用率(OUR)为200mMol/l/h(图9)。
测量的关键响应是：生长速度，细胞浓度，细胞产率，以及相对于蛋白而言的细胞产量(YPP)、相对于糖而言的细胞产量(YPS)和相对于氧气而言的细胞产量(YPO)(图10)。
观察到的生长速度为0.3/h。通过将汉逊德巴利酵母在发酵培养基中进行培养，获得8.4×109个细胞/ml的最大细胞浓度以及3.8×1011个细胞/ml/h的细胞产率。相对于蛋白、糖和氧气而言，汉逊德巴利酵母细胞产量分别是3.6×1011个细胞/g、3.5×1011个细胞/g和4.2×1011个细胞/g(图10)。
液体产品具有381天的半寿期(存储于4℃)。配制成初始计数为2×1010CFU/ml的终产品，储存寿命为2535天(至计数为1×108CFU/ml的终产品)。
挤出产品具有27.5天的半寿期(存储于4℃)。配制成初始计数为2×1010CFU/ml的终产品，储存寿命为192.5天(至计数为1×108CFU/ml的终产品)。
汉逊德巴利酵母鲍鱼饲料具有101.2天的半寿期(存储于4℃)。配置为初始计数为2×1010CFU/ml的终产品，储存寿命为708.4天(至计数为1×108CFU/ml的终产品)。
此前并不知晓关于汉逊德巴利酵母益生菌的生产技术。文献中没有关于取决于商业性能参数(如细胞数量或生物质的浓度、产率和产量系数)的实际的酵母生产的报道。Papouskova和Sychrova(2007)建议在23℃的培养温度和pH6.5下进行木糖醇的生产(其目标并非是生产生物质)。其它文献提到的最佳温度为28-30℃。涉及该酵母的生物质生产的唯一在先文献是Macey和Coyne(2006)的研究中对该酵母生长的说明。该研究描述了使用标准YPD培养基、20℃的温度和7.0的pH。
本发明描述了使用专利的酵母生长培养基对汉逊德巴利酵母进行商业化生产的工艺，该工艺使细胞产率提高30％并使生产成本降低42.7％。
此外，我们的研究发现使我们得出如下结论：本文所述工艺的最佳温度是24℃，而不同于此前所述的温度。该新的培养温度使细胞产率提高449倍。通过将pH调节为5.6，观察到细胞产率进一步提高95％。
通过在最佳pH和温度下使用CSL作为营养源，该工艺的性能得到显著改善，并出乎预料地使细胞浓度增加176％，细胞产率增加2382倍，并使生产成本降低644％。
上述因素的组合使得开发出用于商业化生产作为益生菌的汉逊德巴利酵母的新工艺，该工艺具有显著提高的产率、浓度和产量，并使生产成本大幅降低。
相比于此前已知的生产工艺，本实施例的工艺的累积效果使得产率提高2075倍。该增高的产出量可归因于新的生长培养基以及最佳温度和pH的使用。通过使用CSL作为营养物，该工艺的产率进一步提高，与此前的用于生产汉逊德巴利酵母的最佳工艺相比，细胞产率进一步提高15％且生产的材料成本降低66％。
实施例3
生产培养基和培养条件的比较性评价
对本发明的工艺与Macey&Coyne(2006)描述的工艺进行了比较性评价。本发明人对根据Macey&Coyne给出的条件和培养基生长的培养物的生产成本和细胞产率以及根据本发明的生产培养基生长的培养物的生产成本和细胞产率进行了研究。
Macey&Coyne将Vibriomidae在海洋肉汤(MB)中培养(所述海洋肉汤由如下物质制成(wt/v)：3％NaCl、0.23％MgCl2·6H2O、0.03％KCl、0.2％葡萄糖、0.5％酪蛋白水解物和0.1％酵母提取物)，在22℃下以100rpm摇动，并维持在海洋琼脂(MA)上(补充有2wt/v％细菌琼脂的MB，Unilab)。所述作者将汉逊德巴利酵母在酵母蛋白胨D-葡萄糖(YPD)肉汤中培养(所述YPD由如下物质制成(wt/v)：1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％D-葡萄糖)并维持在YPD琼脂上(补充有1.5wt/v％细菌琼脂的YPD肉汤，Unilab)。
结果
在表1中列出了本发明的生长培养基和工艺与现有技术的生长培养基和工艺之间的比较性评价的结果。
本文中所述的培养基和工艺生产的Vibriomidae的生物质浓度可达到46.0g/l的最大值，生物质产率可达到11.4g/l/h。类似地，本文中所述的培养基和工艺生产的汉逊德巴利酵母的生物质浓度可达到133.7g/l的最大值，生物质产率可达到6.1g/l/h。
表1：利用本发明的方法和培养基与利用Macey和Coyne(2006)描述的方法和培养基进行鲍鱼益生菌生产的产率和成本的比较性评价。
从表1中的结果可明显看出，本发明人所开发的用于生产Vibriomidae和汉逊德巴利酵母(在水产养殖中作为益生菌)的生长培养基和密集型生产工艺使得这些微生物的商业化生产的成本显著降低，同时，各培养物的产率相应升高。
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Claims (41)

1.细菌生长培养基，所述细菌生长培养基包含：
(i)柠檬酸；
(ii)H3PO4；
(iii)约0g/l-约4g/l(NH4)2SO4；
(iv)Ca(NO3)2；
(v)MnSO4·7H2O；
(vi)FeSO4·7H2O；
(vii)KCl；
(viii)约20g/l-约40g/lNaCl；
(ix)MgCl2·6H2O；
(x)约42g/l-约255g/l玉米浆；
(xi)约1g/l-约40g/l转化的高级糖蜜；以及
(xii)约0.5ml/l-约5ml/l消泡剂；
其中，所述生长培养基的pH为约5-约8。
2.如权利要求1所述的细菌生长培养基，其中，所述生长培养基包含：
(i)约1g/l柠檬酸；
(ii)约2.5ml/lH3PO4；
(iii)约0.4g/lCa(NO3)2；
(iv)约0.040g/lMnSO4·7H2O；
(v)约0.032g/lFeSO4·7H2O；
(vi)约1g/lKCl；
(vii)约30g/lNaCl；
(viii)约2.3g/lMgCl2·6H2O；
(ix)约54.4g/l玉米浆；
(x)约24g/l转化的高级糖蜜；以及
(xi)约1ml/l消泡剂；
其中，所述生长培养基的pH为约6.5。
3.如权利要求1或2所述的细菌生长培养基，其中，与海洋肉汤(MB)培养基相比，所述细菌生长培养基支持显著更高的细胞产率(g/l/h)。
4.用于生产益生菌组合物的工艺，所述工艺包括如下步骤：
通过将活的Vibriomidae细胞的培养物接种至接种物培养基，制备预发酵培养物；
将所述预发酵培养物接种至权利要求1-3中任一项所述的生长培养基；
在Vibriomidae细胞的生长期期间，控制所述生长培养基的pH、温度、气流量、氧饱和度和背压；
在对数生长中期和稳定生长期之间，当Vibriomidae细胞处于稳定形式且其中的活细胞的浓度为2×108个细胞/ml至1×1011个细胞/ml时，收集Vibriomidae细胞；以及
通过将所收集的Vibriomidae细胞重悬于缓冲液中，生产液体产品。
5.如权利要求4所述的工艺，所述工艺进一步包括如下步骤：
将所述液体产品与载体、稳定剂或填料进行混合，以形成生物质糊状物；以及
将所述生物质糊状物进行干燥，以生产干燥产品。
6.如权利要求4或5所述的工艺，其中，所述工艺为间歇工艺。
7.如权利要求4-6中任一项所述的工艺，其中，进入反应器中的气流量为0.5v/v/m-2.0v/v/m，优选所述反应器中的气流量为1v/v/m。
8.如权利要求4-7中任一项所述的工艺，其中，所述发酵培养基中的溶解氧处于20％-100％的饱和度，优选所述溶解氧维持在30％的饱和度。
9.如权利要求4-8中任一项所述的工艺，其中，所述反应器中的背压为0-250kPa，优选所述反应器中的背压为50kPa。
10.如权利要求4-9中任一项所述的工艺，其中，将所述Vibriomidae细胞在20℃-34℃的温度下于所述培养基中进行培养，优选将所述Vibriomidae细胞在30℃的温度下于所述培养基中进行培养。
11.如权利要求4-10中任一项所述的工艺，其中，所述培养基具有的pH为5.0-8.0，优选所述pH为6.5。
12.如权利要求4-11中任一项所述的工艺，其中，通过离心或过滤从所述生长培养基中收集Vibriomidae细胞。
13.如权利要求4-12中任一项所述的工艺，其中，将所收集的Vibriomidae细胞重悬于磷酸盐缓冲液中，以生产液体产品。
14.如权利要求4-13中任一项所述的工艺，其中，将所述液体产品与载体组合以形成混合产品，所述载体选自于由微晶纤维素、海藻糖、蔗糖和脱脂奶或它们的组合所组成的组。
15.如权利要求5-13中任一项所述的工艺，其中，将所述生物质糊状物挤出并干燥，以形成所述干燥产品。
16.如权利要求5-15中任一项所述的工艺，其中，在30℃-70℃的温度下将所述生物质糊状物挤出，优选在45℃的温度下将所述生物质糊状物挤出。
17.益生菌组合物，所述组合物包含在权利要求1-3中任一项所述的培养基中培养的活的Vibriomidae细胞，其中，在对数生长中期和稳定生长期之间，当培养物中的活细胞的浓度为2×108个细胞/ml至1×1011个细胞/ml时，收集Vibriomidae细胞；以及
其中，将所收集的Vibriomidae细胞重悬于缓冲液中。
18.如权利要求17所述的益生菌组合物，其中，将所述重悬的Vibriomidae细胞与载体、稳定剂或填料进行混合，以形成生物质糊状物；并且其中，所述生物质糊状物是干燥的。
19.权利要求17或18所述的益生菌组合物在鲍鱼水产养殖中的用途。
20.鲍鱼饲料，所述鲍鱼饲料包含权利要求17-19中任一项所述的益生菌组合物，其中，通过在饲料挤出前进行预混合、真空注入预制备的鲍鱼饲料中或对已有饲料进行表面涂覆，将所述益生菌组合物与鲍鱼饲料组合。
21.酵母生长培养基，所述酵母生长培养基包含:
(i)柠檬酸；
(ii)H3PO4；
(iii)约18g/l-约30g/l(NH4)2SO4；
(iv)MgSO4·7H2SO4；
(v)CaCl2·2H2O；
(vi)约0g/l-约40g/lNaCl；
(vii)KH2PO4；
(viii)约8g/l-约212g/l玉米浆；
(ix)约1g/l-约40g/l葡萄糖或HTM；以及
(x)约0.5ml/l-约5ml/l消泡剂；
其中，所述生长培养基的pH为约4-约7。
22.如权利要求21所述的酵母生长培养基，其中，所述生长培养基包含：
(i)约2.5g/l柠檬酸；
(ii)约16.3ml/lH3PO4；
(iii)约18.5g/l(NH4)2SO4；
(iv)约8.2g/lMgSO4·7H2SO4；
(v)约0.8g/lCaCl2·2H2O；
(vi)约0.1g/lNaCl；
(vii)约11.3g/lKH2PO4；
(viii)约204g/l玉米浆；
(ix)约10g/l葡萄糖或HTM；以及
(x)约1ml/l消泡剂；
其中，所述生长培养基的pH为约5.6。
23.如权利要求21或22所述的酵母生长培养基，其中，与酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YPD)培养基相比，所述酵母生长培养基支持显著更高的细胞产率(g/l/h)。
24.用于生产益生菌组合物的工艺，所述工艺包括如下步骤：
通过将活的汉逊德巴利酵母细胞的培养物接种至接种物培养基，制备预发酵培养物；
将所述预发酵培养物接种至权利要求21-23中任一项所述的生长培养基；
在汉逊德巴利酵母细胞的生长期期间，控制所述生长培养基的pH、温度、气流量、氧饱和度和背压；
在对数生长中期和对数生长晚期之间，当活细胞的浓度为4×107个细胞/ml至2×1010个细胞/ml时，收集汉逊德巴利酵母细胞；以及
通过将所收集的汉逊德巴利酵母细胞重悬于缓冲液中，生产液体产品。
25.如权利要求24所述的工艺，所述工艺进一步包括如下步骤：
将所述液体产品与载体、稳定剂或填料进行混合，以形成生物质糊状物；以及
将所述生物质糊状物进行干燥，以生产干燥产品。
26.如权利要求24或25所述的工艺，其中，所述工艺为间歇补料工艺。
27.如权利要求24-26中任一项所述的工艺，其中，进入反应器中的气流量为0.5v/v/m-2.0v/v/m，优选所述反应器中的气流量为1v/v/m。
28.如权利要求24-27中任一项所述的工艺，其中，所述发酵培养基中的溶解氧处于20％-100％的饱和度，优选所述溶解氧维持在30％的饱和度。
29.如权利要求24-28中任一项所述的工艺，其中，所述反应器中的背压为0-250kPa，优选所述反应器中的背压为50kPa。
30.如权利要求24-29中任一项所述的工艺，其中，将所述汉逊德巴利酵母细胞在16℃-34℃的温度下于所述培养基中进行培养，优选将所述汉逊德巴利酵母细胞在24℃的温度下于所述培养基中进行培养。
31.如权利要求24-30中任一项所述的工艺，其中，所述培养基的pH为4.0-7.0，优选所述pH为5.6。
32.如权利要求24-31中任一项所述的工艺，其中，通过离心或过滤从所述生长培养基中收集汉逊德巴利酵母细胞。
33.如权利要求24-32中任一项所述的工艺，其中，将所收集的汉逊德巴利酵母细胞重悬于磷酸盐缓冲液中，以生成液体产品，优选所述磷酸盐缓冲液包含约4m/m％-20m/m％海藻糖、优选12.5m/m％海藻糖；并且其中，所述缓冲液的pH为约4-6，优选所述pH为4.5。
34.如权利要求25-33中任一项所述的工艺，其中，将所述液体产品与载体组合以形成混合产品，所述载体选自于由微晶纤维素、海藻糖、蔗糖和脱脂奶或它们的组合所组成的组。
35.如权利要求25-34中任一项所述的工艺，其中，将所述生物质糊状物挤出并干燥，以形成所述干燥产品。
36.如权利要求35所述的工艺，其中，在30℃-50℃的温度下将所述生物质糊状物挤出，优选在45℃的温度下将所述生物质糊状物挤出。
37.益生菌组合物，所述组合物包含在权利要求21-23中任一项所述的培养基中培养的活的汉逊德巴利酵母细胞，其中，在对数生长中期和对数生长晚期之间，当培养物中的活细胞的浓度为4×107个细胞/ml至2×1010个细胞/ml时，收集汉逊德巴利酵母细胞；以及
其中，将所收集的汉逊德巴利酵母细胞重悬于缓冲液中。
38.如权利要求37所述的益生菌组合物，其中，将所述重悬的汉逊德巴利酵母细胞与载体、稳定剂或填料进行混合，以形成生物质糊状物；并且其中，所述生物质糊状物是干燥的。
39.权利要求37或38所述的益生菌组合物在鲍鱼水产养殖中的用途。
40.鲍鱼饲料，所述鲍鱼饲料包含权利要求37-39中任一项所述的汉逊德巴利酵母益生菌组合物，并且其中，通过在饲料挤出前进行预混合、真空注入预制备的鲍鱼饲料中或对已有饲料进行表面涂覆，将所述益生菌组合物与鲍鱼饲料组合。
41.鲍鱼饲料，所述鲍鱼饲料包含权利要求17-19中任一项所述的Vibriomidae的益生菌组合物和权利要求37-39中任一项所述的汉逊德巴利酵母的益生菌组合物。
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