CN105209038B - 以盘基网柄菌吡喃酮衍生物或二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分的骨桥蛋白产生抑制剂 - Google Patents
以盘基网柄菌吡喃酮衍生物或二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分的骨桥蛋白产生抑制剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105209038B CN105209038B CN201380069437.4A CN201380069437A CN105209038B CN 105209038 B CN105209038 B CN 105209038B CN 201380069437 A CN201380069437 A CN 201380069437A CN 105209038 B CN105209038 B CN 105209038B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- compound
- chemical formula
- opn
- dictyostelium discoideum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 title claims abstract description 17
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 title abstract description 38
- ZPSJGADGUYYRKE-UHFFFAOYSA-N 2H-pyran-2-one Chemical class O=C1C=CC=CO1 ZPSJGADGUYYRKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 37
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 67
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 62
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 15
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 14
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 6
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 125
- 101000613820 Homo sapiens Osteopontin Proteins 0.000 description 83
- 102100040557 Osteopontin Human genes 0.000 description 81
- 208000023004 optic perineuritis Diseases 0.000 description 81
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 72
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 47
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 42
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 40
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 24
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 23
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 23
- KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-N (R)-mevalonic acid Chemical compound OCC[C@](O)(C)CC(O)=O KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 22
- KJTLQQUUPVSXIM-UHFFFAOYSA-N DL-mevalonic acid Natural products OCCC(O)(C)CC(O)=O KJTLQQUUPVSXIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 22
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 229960004424 carbon dioxide Drugs 0.000 description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 20
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 19
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 19
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 18
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 16
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 16
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 15
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 15
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 229940093499 ethyl acetate Drugs 0.000 description 13
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 13
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 12
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 10
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCOC(C)=O OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- -1 pyrans Ketone Chemical class 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 9
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 8
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 8
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 7
- RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N SJ000286063 Natural products C12C(OC(=O)C(C)(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 235000019624 protein content Nutrition 0.000 description 7
- 229960002855 simvastatin Drugs 0.000 description 7
- RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N simvastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- AIDLAEPHWROGFI-UHFFFAOYSA-N 2-methylbenzene-1,3-dicarboxylic acid Chemical class CC1=C(C(O)=O)C=CC=C1C(O)=O AIDLAEPHWROGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 6
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VOLMSPGWNYJHQQ-UHFFFAOYSA-N Pyranone Natural products CC1=C(O)C(=O)C(O)CO1 VOLMSPGWNYJHQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 5
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 3
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 3
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 3
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 3
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 3
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 3
- UKVIEHSSVKSQBA-UHFFFAOYSA-N methane;palladium Chemical compound C.[Pd] UKVIEHSSVKSQBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 3
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2s)-2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 2
- ZGGHKIMDNBDHJB-NRFPMOEYSA-M (3R,5S)-fluvastatin sodium Chemical compound [Na+].C12=CC=CC=C2N(C(C)C)C(\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)=C1C1=CC=C(F)C=C1 ZGGHKIMDNBDHJB-NRFPMOEYSA-M 0.000 description 2
- BPGMCWOXIIMCLL-NSHDSACASA-N 2-[(2S)-1-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)propan-2-yl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C[C@@H](CC1(OCCCO1)C)N1C(C2=CC=CC=C2C1=O)=O BPGMCWOXIIMCLL-NSHDSACASA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091016585 CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 101000703512 Homo sapiens Sphingosine-1-phosphate phosphatase 1 Proteins 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 2
- RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N Isoprene Chemical compound CC(=C)C=C RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N Monacolin X Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N Pravastatin Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AJLFOPYRIVGYMJ-UHFFFAOYSA-N SJ000287055 Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CCC=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 AJLFOPYRIVGYMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 229960005110 cerivastatin Drugs 0.000 description 2
- SEERZIQQUAZTOL-ANMDKAQQSA-N cerivastatin Chemical compound COCC1=C(C(C)C)N=C(C(C)C)C(\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)=C1C1=CC=C(F)C=C1 SEERZIQQUAZTOL-ANMDKAQQSA-N 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 229930191552 dictyopyrone Natural products 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229960003765 fluvastatin Drugs 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000009650 gentamicin protection assay Methods 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 102000051312 human SPP1 Human genes 0.000 description 2
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine monohydrate Substances O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004844 lovastatin Drugs 0.000 description 2
- PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N lovastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N 0.000 description 2
- QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N lovastatin hydroxy acid Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C21 QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950009116 mevastatin Drugs 0.000 description 2
- AJLFOPYRIVGYMJ-INTXDZFKSA-N mevastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=CCC[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 AJLFOPYRIVGYMJ-INTXDZFKSA-N 0.000 description 2
- BOZILQFLQYBIIY-UHFFFAOYSA-N mevastatin hydroxy acid Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CCC=C21 BOZILQFLQYBIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010813 municipal solid waste Substances 0.000 description 2
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 2
- HYAFETHFCAUJAY-UHFFFAOYSA-N pioglitazone Chemical compound N1=CC(CC)=CC=C1CCOC(C=C1)=CC=C1CC1C(=O)NC(=O)S1 HYAFETHFCAUJAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002797 pitavastatin Drugs 0.000 description 2
- VGYFMXBACGZSIL-MCBHFWOFSA-N pitavastatin Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)\C=C\C1=C(C2CC2)N=C2C=CC=CC2=C1C1=CC=C(F)C=C1 VGYFMXBACGZSIL-MCBHFWOFSA-N 0.000 description 2
- 229960002965 pravastatin Drugs 0.000 description 2
- TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N pravastatin Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@H](CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@H](O)C=C21 TUZYXOIXSAXUGO-PZAWKZKUSA-N 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 229960000672 rosuvastatin Drugs 0.000 description 2
- BPRHUIZQVSMCRT-VEUZHWNKSA-N rosuvastatin Chemical compound CC(C)C1=NC(N(C)S(C)(=O)=O)=NC(C=2C=CC(F)=CC=2)=C1\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O BPRHUIZQVSMCRT-VEUZHWNKSA-N 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- QDRKDTQENPPHOJ-UHFFFAOYSA-N sodium ethoxide Chemical compound [Na+].CC[O-] QDRKDTQENPPHOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- ZNDPOFXYUIQWPY-LBPRGKRZSA-N (2S)-2,4-dimethyl-5-octanoyl-2,3-dihydro-1H-pyridin-6-one Chemical compound CC1=C(C(N[C@H](C1)C)=O)C(CCCCCCC)=O ZNDPOFXYUIQWPY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- UKEUUJGAOURIJG-QMMMGPOBSA-N (2s)-5-butanoyl-2,4-dimethyl-2,3-dihydro-1h-pyridin-6-one Chemical class CCCC(=O)C1=C(C)C[C@H](C)NC1=O UKEUUJGAOURIJG-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- IQQDVKNVOMCSIJ-INIZCTEOSA-N (2s)-5-dodecanoyl-2,4-dimethyl-2,3-dihydro-1h-pyridin-6-one Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)C1=C(C)C[C@H](C)NC1=O IQQDVKNVOMCSIJ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- GTCCGKPBSJZVRZ-WHFBIAKZSA-N (2s,4s)-pentane-2,4-diol Chemical class C[C@H](O)C[C@H](C)O GTCCGKPBSJZVRZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- UHHHTIKWXBRCLT-VDBOFHIQSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide;ethanol;hydrate;dihydrochloride Chemical compound O.Cl.Cl.CCO.C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O.C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O UHHHTIKWXBRCLT-VDBOFHIQSA-N 0.000 description 1
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCYFNVUDZSIQSH-STQMWFEESA-N 1-o-[(2s,4s)-4-hydroxypentan-2-yl] 10-o-methyl 3-oxodecanedioate Chemical compound COC(=O)CCCCCCC(=O)CC(=O)O[C@@H](C)C[C@H](C)O HCYFNVUDZSIQSH-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- KEKKWQUBMUQVHE-ZDUSSCGKSA-N 10-o-methyl 1-o-[(2s)-4-oxopentan-2-yl] 3-oxodecanedioate Chemical compound COC(=O)CCCCCCC(=O)CC(=O)O[C@@H](C)CC(C)=O KEKKWQUBMUQVHE-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- UQMZDDUUYXBLHI-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethyl-5-octanoyl-1,3-dioxane-4,6-dione Chemical compound CCCCCCCC(=O)C1C(=O)OC(C)(C)OC1=O UQMZDDUUYXBLHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LCPVQAHEFVXVKT-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-difluorophenoxy)pyridin-3-amine Chemical compound NC1=CC=CN=C1OC1=CC=C(F)C=C1F LCPVQAHEFVXVKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 1
- WVQQZWSJXLXGDC-UHFFFAOYSA-N 5-butanoyl-2,2-dimethyl-1,3-dioxane-4,6-dione Chemical compound CCCC(=O)C1C(=O)OC(C)(C)OC1=O WVQQZWSJXLXGDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBQSPOSHAIKDOW-UHFFFAOYSA-N 5-dodecanoyl-2,2,4-trimethyl-3h-pyran-6-one Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)C1=C(C)CC(C)(C)OC1=O NBQSPOSHAIKDOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KOVPXZDUVJGGFU-UHFFFAOYSA-N 8-methoxy-8-oxooctanoic acid Chemical compound COC(=O)CCCCCCC(O)=O KOVPXZDUVJGGFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000157882 Acrasida Species 0.000 description 1
- XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N Atorvastatin Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N 0.000 description 1
- XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N Atorvastatin Natural products C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000224495 Dictyostelium Species 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008607 Integrin beta3 Human genes 0.000 description 1
- 108010020950 Integrin beta3 Proteins 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- LFTLOKWAGJYHHR-UHFFFAOYSA-N N-methylmorpholine N-oxide Chemical compound CN1(=O)CCOCC1 LFTLOKWAGJYHHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 1
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-N Suberic acid Natural products OC(=O)CCCCCCC(O)=O TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- 239000005030 aluminium foil Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229960005370 atorvastatin Drugs 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000028446 budding cell bud growth Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002090 carbon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000021953 cytokinesis Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229930194663 dihydrodictyopyrone Natural products 0.000 description 1
- IWYMSCITVORDAJ-UHFFFAOYSA-N dihydrodictyopyrone A Natural products CC=CCCCCCCCCC(=O)C1C(C)CC(C)OC1=O IWYMSCITVORDAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIPXKPDEFBRLPH-UHFFFAOYSA-N dihydrodictyopyrone C Natural products CCCCCCCCCCCC(=O)C1C(C)CC(C)OC1=O DIPXKPDEFBRLPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 229940069417 doxy Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008556 epithelial cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N ethyl acetoacetate Chemical compound CCOC(=O)CC(C)=O XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- ALBYIUDWACNRRB-UHFFFAOYSA-N hexanamide Chemical compound CCCCCC(N)=O ALBYIUDWACNRRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- DCPMPXBYPZGNDC-UHFFFAOYSA-N hydron;methanediimine;chloride Chemical compound Cl.N=C=N DCPMPXBYPZGNDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- UOPRYGGRIGQSBB-LBPRGKRZSA-N methyl 8-[(2S)-2,4-dimethyl-6-oxo-2,3-dihydropyran-5-yl]-8-oxooctanoate Chemical compound CC1=C(C(O[C@H](C1)C)=O)C(CCCCCCC(=O)OC)=O UOPRYGGRIGQSBB-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 1
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000003707 ovarian clear cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 238000001935 peptisation Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229960005095 pioglitazone Drugs 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 108010045647 puromycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229940116351 sebacate Drugs 0.000 description 1
- CXMXRPHRNRROMY-UHFFFAOYSA-L sebacate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCCCCCCCC([O-])=O CXMXRPHRNRROMY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 1
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- CHQMHPLRPQMAMX-UHFFFAOYSA-L sodium persulfate Substances [Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O CHQMHPLRPQMAMX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- OSBSFAARYOCBHB-UHFFFAOYSA-N tetrapropylammonium Chemical compound CCC[N+](CCC)(CCC)CCC OSBSFAARYOCBHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N troglitazone Chemical compound C1CC=2C(C)=C(O)C(C)=C(C)C=2OC1(C)COC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001641 troglitazone Drugs 0.000 description 1
- GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N troglitazone Natural products C([C@@]1(OC=2C(C)=C(C(=C(C)C=2CC1)O)C)C)OC(C=C1)=CC=C1C[C@H]1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
- A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
- A61K31/45—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cycloheximide
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/365—Lactones
- A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
- A61K31/4412—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Abstract
本发明的目的是提供能够预防因骨桥蛋白产生亢进而引起的疾病的骨桥蛋白产生抑制剂。本发明的骨桥蛋白产生抑制剂以盘基网柄菌吡喃酮衍生物或二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分。盘基网柄菌吡喃酮衍生物优选的是由化学式1或化学式2表示的化合物,二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物优选的是化学式3或化学式4表示的化合物。
Description
技术领域
本发明涉及能够预防或改善因骨桥蛋白(osteopontin;OPN)产生亢进而引起的疾病(例如,癌转移)的、以盘基网柄菌吡喃酮(Dictyopyrone)衍生物或二氢盘基网柄菌吡喃酮(Dihydrodictyopyrone)衍生物为有效成分的OPN产生抑制剂。
背景技术
OPN是被鉴定为构成钙沉积的骨组织的基质(matrix)的主要非骨胶原性蛋白质且分子量为41kDa的分泌型酸性磷酸化糖蛋白质。已确认其在乳汁、尿、肾小管、破骨细胞、成骨细胞、巨噬细胞、活化T细胞以及较多的肿瘤组织中表达广泛。OPN被认为在骨基质中发挥连接破骨细胞和羟磷灰石的架桥的作用(非专利文献1),但是除此以外还报告称具有参与细胞粘着、细胞迁移、一氧化氮产生的抑制、肿瘤或免疫系统的多种功能。
OPN表达与肿瘤的发展相关,并且表示与癌转移的相关性。在肺癌、肝癌、乳癌或前列腺癌的患者的血浆中检测出OPN(非专利文献2),报告称与正常部位相比癌部位的OPNmRNA上升(非专利文献3),并且报告称神经胶质瘤中的OPN表达也具有与恶性度相关的倾向(非专利文献4)。OPN表达与肿瘤的相关在动物模型中也被确认(非专利文献5)。根据这样的与OPN相关的最近的见解认为抑制促进肿瘤细胞的转移以及侵袭的OPN的产生是防止癌转移的抗癌剂的一种新靶点(非专利文献6)。
现有技术文献:
非专利文献:
非专利文献1:Miyauchi A,Alvarez J,Greenfield EM,Teti A,Grano M,ColucciS,Zambonin-Zallone A,Ross FP,Teitelbaum SL,Cheresh D,Hruska KA.(1991)Recognition of osteopontin and related peptides by an alpha v beta 3integrinstimulates immediate cell signals in osteoclasts.J Biol Chem 266,20369-20374.
非专利文献2:Senger DR,Perruzzi CA,Gracey CF,Papadopoulos A,Tenen DG.(1988)Secreted phosphoproteins associated with neoplastic transformation:close homology with plasma proteins cleaved during blood coagulation.CancerRes 48,5770–5774.
非专利文献3:Brown LF,PapadopoμLos-Seigiou A,Brygida B,Manseau EJ,Tognazzi K,Perruzzi CA,Dvorak HF,Senger DR.(1994)Osteopontin expression inhuman carcinoma.Am J Pathol.145,610–623.
非专利文献4:Saitoh Y,Kuratsu JI,Takeshima H,Yamamoto S,Ushio Y(1995)Expression of osteopontin in human glioma.Lab Invest 72,55-63.
非专利文献5:Suzuk M,Mose E,Galloy C,and Tarin T(2007)Osteopontin GeneExpression Determines Spontaneous Metastatic Performance of Orthotopic HumanBreast Cancer Xenografts.Am J Pathol 171,682–692.
非专利文献6:Weber GF(2001)Review:The metastasis gene osteopontin:acandidate target for cancer therapy.Biochim Biophys Acta 1552,61-85.
非专利文献7:Kikuchi H,Sasaki K,Sekiya J,Maeda M,Amagai A,Kubohara Yand Oshima Y(2004)Dihydrodictyopyrone A and C:new members of dictyopyronefamily isolated from Dictyostelium cellular slime molds Bioorg Med Chem 12,3203-3214.
非专利文献8:Matsuura M,Suzuki T,Suzuki M,Tanaka R,Ito E and Saito T(2011)Statin-mediated reduction of osteopontin expression induces apoptosisand cell growth arrest in ovarian clear cell carcinoma.Oncol Rep 25,41-47.
非专利文献9:Haruhisa Kikuchi,Koji Nakamura,Yuzuru Kubohara,NaomiGokan,Kohei Hosaka,Yasuo Maedad and Yoshiteru Oshima,Tetrahedron Letters 48(2007)5905-5909.。
发明内容
发明要解决的问题:
如上所述,通过抑制OPN的产生,以此可以防止癌转移。作为具有OPN产生抑制作用的药物,已知有作为PPAR-γ(Peroxysome Proliferator-Activated Receptor-γ;过氧化物酶体增殖物激活受体γ)激动剂的胰岛素抵抗性改善药(曲格列酮、匹格列酮、罗格列酮)、非甾体抗炎药(例如,吲哚美辛或布洛芬)以及作为HMG-CoA还原酶抑制剂的他汀类高胆固醇血症治疗药(例如,瑞舒伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀以及美伐他汀)。
另一方面,细胞性粘菌是广泛分布于土壤表层中的一种原生生物,在生态循环中同时具备动物性与植物性、单细胞与多细胞这样的较大不同的性质,并且包括如细胞运动、细胞质分裂或分化等的构成多细胞生物的产生系统的主要过程。与天然化学中以往经常利用的生物种大为不同,因此期待产生各种新型化合物。
本发明的目的是提供能够预防因OPN产生亢进而引起的疾病(例如癌转移)的OPN产生抑制剂。
解决问题的手段:
本发明人等为了发现抑制OPN的基因表达的化合物,而使用在OPN启动子的控制下表达报告基因的荧光素酶的细胞株,并且将如盘基网柄菌(D.discoideum)那样的细胞性粘菌的二次代谢产物作为对象进行了筛选。
其结果是,本发明人等在盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物中发现了抑制荧光素酶表达的化合物。
本发明人等又发现了这样的抑制在OPN启动子控制下的荧光素酶活性的化合物会降低人非小细胞肺癌细胞株A549或人肝癌细胞株HepG2所产生的OPN量。本发明人等进一步通过细胞划痕实验(Wound-Healing assay)发现盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物抑制OPN的生理功能的细胞迁移能力,并且通过基质胶侵袭实验发现盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物抑制细胞的转移以及侵袭能力,从而完成本发明。
具体而言,本发明涉及以盘基网柄菌吡喃酮衍生物或二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分的骨桥蛋白产生抑制剂。
报告称在盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物中存在具有抑制人白血病细胞K562细胞的增殖的活性的化合物(非专利文献7),但是OPN产生抑制剂作用至今未被报道。
作为盘基网柄菌吡喃酮衍生物,优选的是化学式1或化学式2表示的化合物。
[化学式1]
[化学式2]
作为二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物,优选的是化学式3或化学式4表示的化合物。
[化学式3]
[化学式4]
发明效果:
本发明的以盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分的OPN产生抑制剂是具有不同于胰岛素抵抗性改善药或他汀类高胆固醇血症治疗药的作用机理的OPN产生抑制剂。
附图说明
图1示出通过添加化合物3(化学式3示出的化合物)而产生的A549细胞的OPN产生抑制效果的图表;
图2示出通过添加化合物3(化学式3示出的化合物)而产生的HepG2细胞的OPN产生抑制效果的图表;
图3示出通过添加化合物3(化学式3示出的化合物)而产生的A549细胞的创伤恢复抑制效果的图表;
图4示出通过添加化合物3(化学式3示出的化合物)而产生的A549细胞的基质侵袭抑制效果的图表;
图5示出相对于由SVS(simvastatin;辛伐他汀)所产生的OPN产生量抑制效果的、通过添加MVA(mevalonic acid;甲羟戊酸)而产生的恢复效果的图表;
图6示出相对于由化合物3所产生的OPN产生量抑制效果的、通过添加MVA而产生的影响的图表。
具体实施方式
关于本发明的实施形态,适当参照附图进行说明。本发明不限于以下记载。
<A:OPN启动子控制下的荧光素酶表达抑制效果的确认方法>
在pGL-3basic载体(Promega)的多克隆位点中组入人OPN启动子序列(从-765至23)而形成的报告载体pOPN1-luc在转染至动物细胞中时表达荧光素酶。将该pOPN1-luc与表达嘌呤霉素耐性基因(puromycin-N-acetyl-transferase gene)的pPUR(Clontech)一起转染至人非小细胞肺癌细胞株A549,并且选择了能够在嘌呤霉素添加培养基中增殖且表达荧光素酶的细胞。将选择的细胞命名为A549/OPNluc细胞,并且使用于后述的OPN启动子控制下的荧光素酶表达抑制效果的观察中。
将被试化合物添加到A549/OPNluc细胞的培养液中,并且观察了对细胞内的荧光素酶表达量的影响。在这里,考虑到在被试化合物具有细胞毒性或细胞增殖抑制效果的情况下,因依赖于被试化合物的浓度的活细胞数量的减少而总荧光素酶表达量下降,无法正确地评价被试化合物在OPN启动子控制下的荧光素酶表达抑制效果。因此,首先实施作为通过显色测定对细胞增殖能力或细胞生存能力进行定量的方法的WST(water-solubletetrazolium salt;水溶性四氮唑盐)实验,并且求出被试化合物对于细胞增殖的IC50(50%细胞增殖抑制浓度)。之后,实施荧光素酶活性测定,求出被试化合物对于OPN启动子控制下的荧光素酶表达的EC50(50%荧光素酶表达抑制浓度)。
A1)WST实验
使A549/OPNluc细胞在添加了10%胎牛血清(FCS)以及1%青霉素-链霉素(P/S)的DMEM培养基中达到3×104cells/mL并悬浮于其中,并且将它向96孔板的各孔内分别注入100μL。由于将试验重复实施三次(triplicate),因此作为对照组以及各浓度的被试化合物添加用孔,每个分别准备了三个孔。在分注后,将96孔板在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养24±4小时。
将被试化合物通过二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide;DMSO)形成50mmol/L溶液,并且保存在-80℃。为了WST实验,准备了将该被试化合物溶液通过DMSO稀释为两倍稀释系列(通常是0.31mmol/L~20mmol/L的范围)而浓度分别以两倍变化的被试化合物溶液。
在加入了细胞悬浮液的各孔内分别注入0.5μL仅DMSO(对照)或者稀释的被试化合物(待测样品)的溶液(稀释200倍)。通过涡旋混合器(vortex mixer)混合后,将96孔板在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养48±4小时。之后,将预混WST-1试剂(PremixWST-1Reagent)(TAKARABIO)分别在各孔内添加10μL。在使用涡旋混合器混合后,将96孔板在37℃,5%CO2条件下进行培养(Incubation),并且使用酶标仪(Bio-Rad;Benchmark或Thermo Scientific;Varioskan Flash)测定60分钟后或120分钟后的吸光值(450nm)。
将对照的孔以及各浓度的待测样品孔的吸光值分别输入至Excel文件中,求出各浓度的待测样品孔的吸光值相对于对照的平均吸光值的百分数。根据求出的值通过最小二乘法求出近似曲线式,计算IC50。
A2)荧光素酶实验
在加入了细胞悬浮液的各孔中分别添加仅DMSO(对照)或者稀释的被试化合物(待测样品)的溶液0.5μL而稀释200倍,在通过涡旋混合器混合后,进行与上述WST实验相同的操作直至二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养48±4小时的工序为止。
将荧光素酶检测系统(luciferase assay systems)(Promega:Cat#E1500)中含有的荧光素酶实验底物(luciferase assay substrate;以下标为LAS)用荧光素酶实验缓冲液(Luciferase Assay Buffer;LAB)溶解,配制出荧光素酶试剂。将5×细胞培养裂解试剂(Cell Culture Lysis Reagent;以下标为CCLR)用水稀释5倍,配制出1×CCLR。
在培养48±4小时后,完全去除各孔的培养基,并且分别注入50μL1×CCLR。在室温中静置30分钟后,将各孔内的1×CCLR作为测定用试样。在化学发光测定用管内加入荧光素酶试剂100μL,在其中添加测定用试剂20μL并进行混合,使用调谐器设计发光检测仪20/20(Tuner Design Luminometer 20/20)(Promega)测定了化学发光(相对发光强度:RLU)。
将对照的RLU以及各浓度的待测样品的RLU分别输入至Excel文件中,求出各浓度的待测样品的RLU相对于对照的RLU的平均值的百分数,并且根据该值通过最小二乘法求出近似曲线式,计算出EC50。
表1示出对于作为被试化合物的化学式1~化学式16所示的盘基网柄菌吡喃酮衍生物或二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物通过WST实验以及荧光素酶实验计算出的IC50以及EC50。
[化学式5]
[化学式6]
[化学式7]
[化学式8]
[化学式9]
[化学式10]
[化学式11]
[化学式12]
[化学式13]
[化学式14]
[化学式15]
[化学式16]
在这里,化学式1、2、5~8所示的化合物是按照非专利文献7中公开的制造方法制造而成。化学式3、12、13、15~16所示的化合物是按照非专利文献9中公开的制造方法制造而成。
[化学式4所示的化合物的制造方法]
将如非专利文献7的记载进行合成的5mg的(S)-3-十二酰基-5,6-二氢-4,6-二甲基-1H-吡啶-2-酮((S)-3-dodecanoyl-5,6-dihydro-4,6-dimethyl-1H-pyridin-2-one)溶解于1ml的甲醇中。添加1mg的钯碳(Pd5%),并且在氢气氛下在室温搅拌2小时。将反应液过滤而去除钯碳,将其滤液减压蒸馏。将残渣进行硅胶柱层析,并且根据由己烷-乙酸乙酯(4:1)洗脱的组分得到化学式4表示的化合物4mg。
将得到的化合物通过基于EIMS(electron impact mass spectra;电子轰击质谱)法的质量分析以及NMR(nuclear magnetic resonance spectroscopy;核磁共振波谱法)进行解析。EIMS以及NMR的结果如下。1H-NMR(400MHz,CDCl3)d 5.76(1H,br.s),3.52-3.64(1H,m),3.05(1H,d,J=11.2Hz),2.81(1H,dt,J=17.8,7.5Hz),2.52(1H,dt,J=17.8,7.4Hz),2.28-2.41(1H,m),1.87(1H,dt,J=13.0,2.3Hz),1.52-1.68(3H,m),1.23-1.36(16H,s),1.17(3H,d,J=6.4Hz),0.94(3H,d,J=6.5Hz),0.88(3H,t,J=6.4Hz);EIMS m/z(rel.int)309[M]+(11),294(5),182(10),169(13),127(100),112(55)。
[化学式9所示的化合物的制造方法]
将297mg的辛二酸单甲酯(suberic acid monomethyl ester)溶解于8mL的二氯甲烷中,并且加入250mg的丙二酸环异丙酯(Meldrum’acid,米氏酸)、453mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、以及19mg的4-二甲氨基吡啶后,在室温搅拌4小时。在反应液中加入0.5M盐酸30mL,使用30mL的乙酸乙酯萃取三次。将萃取的乙酸乙酯层全部合在一起,用60mL的水以及60mL的饱和食盐水分别洗涤后,使用无水硫酸钠进行干燥,减压蒸馏溶剂。将其残渣溶解于5mL的甲苯中,并且添加246mg的(2S,4S)-2,4-戊二醇,在120℃下搅拌2小时。在恢复至室温后,将反应液进行减压蒸馏,并且将残渣进行硅胶柱层析,由被己烷-乙酸乙酯(3:1)洗脱的组分得到200mg的1-(1S,3S)-3-羟基-1-甲基丁基-10-甲基-3-氧代癸二酸酯(1-(1S,3S)-3-hydroxy-1-methylbutyl 10-methyl 3-oxodecanedioate)。
将196mg的1-(1S,3S)-3-羟基-1-甲基丁基-10-甲基-3-氧代癸二酸酯溶解于8mL的二氯甲烷中,并且依次添加109mg的N-甲基马林-N-氧化物(N-methylmorpholine N-oxide)、311mg的粉末状的分子筛4A、以及11mg的过钌酸四内胺(tetrapropylammoniumperruthenate),在室温中搅拌5小时。过滤反应液,将其滤液进行减压蒸馏。将残渣进行硅胶柱层析,由被己烷-乙酸乙酯(4:1)洗脱的组分得到133mg的1-(S)-1-甲基-3-氧代丁基-10-甲基-3-氧代癸二酸酯(1-(S)-1-methyl-3-oxobutyl 10-methyl 3-oxodecanedioate)。
将126mg的1-(S)-1-甲基-3-氧代丁基-10-甲基-3-氧代癸二酸酯溶解于2mL的乙醇中,添加41mg的乙醇钠,在室温搅拌10小时。将反应液注入至20mL的0.5M盐酸中,使用20mL的乙酸乙酯萃取3次。将萃取的乙酸乙酯层全部合在一起,用40mL的水以及40mL的饱和食盐水分别洗涤后,使用无水硫酸钠进行干燥,减压蒸馏溶剂。将残渣进行硅胶柱层析,由被己烷-乙酸乙酯(4:1)洗脱的组分得到88mg的甲基-(S)-8-(4,6-二甲基-2-氧代-5,6-二氢-2H-吡喃-3-基)-8-氧代辛酸酯(methyl(S)-8-(4,6-dimethyl-2-oxo-5,6-dihydro-2H-pyran-3-yl)-8-Oxooctanoate)(化学式9表示的化合物)。
将得到的化合物通过基于EIMS(电子轰击质谱)法的质量分析以及NMR进行解析。EIMS以及NMR的结果如下。1H-NMR(400MHz,CDCl3)d 4.50-4.60(1H,m),3.67(3H,s),2.74(1H,dt,J=17.3,7.4Hz),2.73(1H,dt,J=17.3,7.4Hz),2.45(1H,ddq,J=17.9,11.6,0.9Hz),2.31(1H,dd,J=17.9,3.8Hz),2.30(2H,t,J=7.4Hz),2.01(3H,d,J=0.9Hz),1.58-1.68(4H,m),1.44(3H,d,J=6.4Hz),1.30-1.38(4H,m);EIMS m/z(rel.int)296[M]+(6),281(10),265(11),246(14),181(20),168(83),153(100),109(30)。
[化学式10所示的化合物的制造方法]
按照非专利文献7的记载所合成的300mg的(S)-2-[1-甲基-2-(2-甲基-1,3-二恶烷-2-基)乙基]-异吲哚-1,3-二酮((S)-2-[1-Methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-isoindole-1,3-dione)溶解于6mL的甲醇中,添加水合肼1038mg,加热回流6小时。恢复至室温后,在反应液中添加1M氢氧化钠水溶液30mL,用30mL的乙酸乙酯萃取3次。将萃取的乙酸乙酯层全部合在一起,用60mL的水以及60mL的饱和食盐水分别洗涤后,使用无水硫酸钠进行干燥,减压蒸馏溶剂。将其残渣溶解于6mL的甲苯中,并且添加565mg的5-丁酰-2,2-二甲基-1,3-二恶烷-4,6-二酮(5-butanoyl-2,2-dimethyl-1,3-dioxane-4,6-dione),加热回流15小时。恢复至室温,将反应液进行减压蒸馏。将残渣进行硅胶柱层析,由使用己烷-乙酸乙酯(2:1)洗脱的组分得到140mg的(S)-N-[l-甲基-2-(2-甲基-1,3-二恶烷-2-基)乙基]-3-氧代己酰胺((S)-N-[l-methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-3-oxohexanamide)。
将115mg的(S)-N-[l-甲基-2-(2-甲基-1,3-二恶烷-2-基)乙基]-3-氧代己酰胺溶解于80%醋酸水溶液4mL中,在室温下搅拌7小时。将反应液减压蒸馏,将残渣进行硅胶柱层析,由使用己烷-乙酸乙酯(2:1)洗脱的组分得到59mg的(S)-N-(1-甲基-3-氧代丁基)-3-氧代己酰胺((S)-N-(1-methyl-3-oxobutyl)-3-oxohexanamide)。
将11mg的(S)-N-(1-甲基-3-氧代丁基)-3-氧代己酰胺溶解于1mL的乙醇中,添加5mg的乙醇钠,在室温搅拌8小时。将反应液注入至10mL的0.5M盐酸中,使用10mL的乙酸乙酯萃取3次。将萃取的乙酸乙酯层全部合在一起,用20mL的水以及20mL的饱和食盐水分别洗涤后,使用无水硫酸钠进行干燥,减压蒸馏溶剂。将残渣进行硅胶柱层析,由被己烷-乙酸乙酯(2:1)洗脱的组分得到4mg的(S)-3-丁酰-5,6-二氢-4,6-二甲基-1H-吡啶-2-酮((S)-3-butanoyl-5,6-dihydro-4,6-dimethyl-1H-pyridin-2-one)(化学式10表示的化合物)。
将产物通过基于EIMS(电子轰击质谱)法的质量分析以及NMR进行解析。EIMS以及NMR的结果如下。1H-NMR(400MHz,CDCl3)d 5.45(1H,br.s),3.66-3.78(1H,m),2.71(2H,t,J=7.4Hz),2.31(1H,dd,J=17.6,7.6Hz),2.23(1H,dd,J=17.6,7.2Hz),1.93(3H,s),1.64(2H,quint,J=7.4Hz),1.24,(3H,d,J=6.4Hz),0.94(3H,t,J=7.4Hz);EIMS m/z(rel.int)195[M]+(19),180(100),152(54),109(22)。
[化学式11所示的化合物的制造方法]
将按照非专利文献7的记载合成的300mg的(S)-2-[1-甲基-2-(2-甲基-1,3-二恶烷-2-基)乙基]-异吲哚-1,3-二酮((S)-2-[1-Methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-isoindole-1,3-dione)溶解于6mL的甲醇中,并且添加水合肼1038mg,加热回流6小时。恢复到室温后,在反应液中添加1M氢氧化钠水溶液30mL,用30mL的乙酸乙酯萃取3次。将萃取的乙酸乙酯层全部合在一起,用60mL的水以及60mL的饱和食盐水分别洗涤后,使用无水硫酸钠进行干燥,将减压蒸馏溶剂。将该残渣溶解于6mL的甲苯中,并且添加564mg的2,2-二甲基-5-辛酰基-1,3-二恶烷-4,6-二酮(2,2-dimethyl-5-octanoyl-1,3-dioxane-4,6-dione),加热回流15小时。恢复至室温后,将反应液进行减压蒸馏。将残渣进行硅胶柱层析,由被己烷-乙酸乙酯(2:1)洗脱的组分得到51mg的(S)-N-[l-甲基-2-(2-甲基-1,3-二恶烷-2-基)乙基]-3-氧代癸酰胺((S)-N-[l-methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-3-oxodecanamide)。
将47mg的(S)-N-[l-甲基-2-(2-甲基-1,3-二恶烷-2-基)乙基]-3-氧代癸酰胺溶解于80%醋酸水溶液3mL中,在室温下搅拌7小时。将反应液减压蒸馏,将残渣进行硅胶柱层析,由被己烷-乙酸乙酯(2:1)洗脱的组分得到38mg的(S)-N-(1-甲基-3-氧代丁基)-3-氧代癸酰胺((S)-N-(1-methyl-3-oxobutyl)-3-oxodecanamide)。
将23mg的(S)-N-(1-甲基-3-氧代丁基)-3-氧代癸酰胺溶解于2mL的N,N-二甲基甲酰胺中,添加3mg的氢化钠(60%,分散在矿物油中),在室温搅拌10小时。将反应液注入至10mL的0.5M盐酸中,使用10mL的乙酸乙酯萃取3次。将萃取的乙酸乙酯层全部合在一起,用20mL的水以及20mL的饱和食盐水分别洗涤后,使用无水硫酸钠进行干燥,减压蒸馏溶剂。将残渣进行硅胶柱层析,由被己烷-乙酸乙酯(2:1)洗脱的组分得到9mg的(S)-5,6-二氢-4,6-二甲基-3-辛酰基-1H-吡啶-2-酮((S)-5,6-dihydro-4,6-dimethyl-3-octanoyl-1H-pyridin-2-one)(化学式11表示的化合物)。
将产物通过基于EIMS(电子轰击质谱)法的质量分析以及NMR进行解析。EIMS以及NMR的结果如下。1H-NMR(400MHz,CDCl3)d 5.52(1H,br.s),3.65-3.78(1H,m),2.72(2H,t,J=7.6Hz),2.31(1H,dd,J=17.2,5.6Hz),2.23(1H,dd,J=17.2,7.2Hz),1.92(3H,s),1.60(2H,quint,J=7.6Hz),1.23-1.35(8H,m),1.24(3H,d,J=6.8Hz),0.87(3H,t,J=7.0Hz);EIMS m/z(rel.int)251[M]+(33),236(57),180(100),167(69),152(76),109(23)。
[化学式14所示的化合物的制造方法]
将按照非专利文献7的记载合成的10mg的3-十二酰基-5,6-二氢-4,6,6-三甲基-2H-吡喃-2-酮(3-dodecanoyl-5,6-dihydro-4,6,6-trimethyl-2H-pyran-2-one)溶解于1mL的乙酸乙酯中,添加1mg的20%氢氧化钯-碳,在氢气气氛下,在室温中搅拌20小时。过滤反应液而去除钯碳,将其滤液进行减压蒸馏。将残渣进行硅胶柱层析,由被己烷-乙酸乙酯(19:1)洗脱的组分得到9mg的化学式14所示的化合物。
将产物通过基于EIMS(电子轰击质谱)法的质量分析以及NMR进行解析。EIMS以及NMR的结果如下。1H-NMR(400MHz,CDCl3)d 3.13(1H,d,J=10.8Hz),2.87(1H,dt,J=14.8,7.2Hz),2.59-2.67(1H,m),2.55(1H,dt,J=14.8,6.8Hz),1.84(1H,dd,J=13.4,4.0Hz),1.57-1.66(2H,m),1.51(1H,t,J=13.4Hz),1.43(3H,s),1.42(3H,s),1.25-1.31(16H,m),0.95(3H,d,J=6.4Hz),0.88(3H,t,J=6.6Hz);EIMS m/z(rel.int)324[M]+(3),309(6),84(100)。
[表1]
关于化学式1、化学式2以及化学式8所示的盘基网柄菌吡喃酮衍生物、和化学式3、化学式4、化学式15以及化学式16所示的二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物,EC50浓度为IC50浓度的1/2以下。尤其是,对于化学式1~4所示的化合物(化合物1~化合物4),EC50浓度小于30μM,在低浓度下将OPN启动子控制下的荧光素酶(OPN Luc)表达抑制50%。
<B:化合物3对于人非小细胞肺癌细胞株A549以及人肝癌细胞株HepG2的OPN产生的抑制效果>
如上所述证实了在盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物中,存在以抑制50%细胞增殖的浓度(IC50)的1/2以下的浓度将OPN启动子控制下的荧光素酶表达抑制50%的化合物。因此,对于EC50浓度最低且IC50浓度示出EC50浓度的两倍以上的化学式3所示的化合物(化合物3)进行了是否能够实际抑制由癌细胞株产生的OPN量的确认试验。
将化合物3加入至人非小细胞肺癌细胞株A549以及人肝癌细胞株HepG2的培养液中,将培养两天后的培养上清中的OPN量使用人骨桥蛋白免疫检测试剂盒(HumanOsteopontin Immunoassay Kit)(R&D systems)进行测定,通过与化合物3无添加组(对照组)的OPN量进行比较,以此进行确认试验。
化合物3还具有细胞增殖抑制效果,因此为了正确评价OPN产生量抑制效果,而在去除培养上清后孔内剩余的细胞中添加在荧光素酶实验中使用的1×CCLR液而配制出细胞裂解液,并且将其蛋白量使用BCA蛋白定量试剂盒(BCA protein assay kit)(ThermoScientific)进行测定。对于化合物3的添加对OPN产生量的影响,通过每1mg蛋白量的OPN量进行比较。
B1)试样配制方法
首先,使A549细胞或HepG2细胞在分别添加了10%FCS、1%P/S的DMEM培养基中悬浮并达到4×104cells/mL,并且向24孔板的各孔内分别注入500μL。由于将试验重复实施三次,因此将对照以及各浓度的被试化合物添加组分别准备三孔。将24孔板在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)内培养24±4小时。
将作为被试化合物的化合物3使用DMSO制成50mmol/L溶液,并且保存在-80℃。将该化合物3溶液使用DMSO进行稀释,分别配制成3.75mmol/L、7.5mmol/L以及15mmol/L的浓度。在培养A549细胞的各孔内,将化合物3的7.5mmol/L溶液或15mmol/L溶液分别添加2μL。在对照孔内仅分别添加2μLDMSO。
在培养HepG2细胞的各孔内分别添加化合物3的3.75mmol/L溶液或7.5mmol/L溶液2μL。在对照孔内仅分别添加2μLDMSO。
将24孔板前后左右摇动,将孔内的溶液混合后,在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养48±4小时。之后,将培养上清全部转移至1.5mL管内,在留下细胞的孔内添加500μL D-PBS(-)。
将24孔板轻轻地摇动后,去除D-PBS(-),并且向各孔内分别注入200μL的将在荧光素酶实验中使用的5×CCLR用水稀释5倍而配制出的1×CCLR。之后,将24孔板放置于摇摆式振荡器(rocking shaker)中摇摆15分钟。
从摇摆15分钟后的24孔板的各孔中将细胞裂解液转移至1.5mL管内,并且为了去除细胞碎片等的夹杂物而通过微量高速冷却离心机在4℃、15000rpm下离心1分钟。将得到的上清作为蛋白量测定用试样。
另一方面,为了去除如细胞碎片等的夹杂物而将转移至1.5mL管内的培养上清通过微量高速冷却离心机在4℃、15000rpm下离心1分钟。将得到的上清作为ELISA用试样。
B2)OPN蛋白量的测定:
将ELISA用试样如下进行稀释;
A549细胞(稀释20倍):试样5μL+培养基95μL
HepG2细胞(稀释80倍):试样2μL+培养基158μL。
在包含于ELISA试剂盒中的OPN标准品的小瓶(vial)中加入1mL水,平稳地混合,在室温中静置15分钟而配制出200ng/mL的OPN标准品。然后,如表2所示,将OPN标准品用包含于试剂盒中的稀释液RD5-24进行依序稀释。
[表2]
准备包含于试剂盒中的所需数量的OPN微孔板(microplate)和RD1-6,向孔中分别注入100μLRD1-6。将稀释的OPN标准品(小瓶A~H)以及试样50μL分别进一步添加于已添加RD1-6的孔内。之后,将孔上部用密封件覆盖,在室温下静置2小时。在这期间,用水稀释包含于试剂盒中的浓缩洗涤缓冲液(wash buffer concentrate),配制出洗涤缓冲液(washbuffer)。
在静置2小时后,去除各孔内的液体。向各孔内分别注入250μL洗涤缓冲液后,去除洗涤缓冲液,将孔进行洗涤。将该洗涤操作进行四次。
在各孔中分别注入200μL OPN结合物(conjugate)。然后,将孔上部用密封件覆盖,在室温下静止两个小时。在这期间,将包含于试剂盒中的显色剂A(Color Reagent A)和显色剂B(Color Reagent B)进行等量混合,从而配制出底物溶液(Substrate Solution)。
在静置两个小时后,去除各孔内的液体。向各孔中分别注入250μL洗涤缓冲液后,去除洗涤缓冲液,将孔进行洗涤。将该洗涤操作进行了四次。
向各孔内分别注入200μL底物溶液,并且在遮光下室温中静置30分钟。之后,在各孔内分别添加50μL的包含于试剂盒中的终止液(stop solution),并且通过涡旋混合器平稳地混合至孔的全部液体从蓝色变成黄色。在混合后,使用酶标仪(microplate Reader)(Bio-Rad;Benchmark或Thermo Scientific;Varioskan Flash)测定吸光值(450nm以及570nm)。进行从所有的测定数据的OD 450nm减去OD 570nm的值的运算,以后的计算使用这一值。
根据标准曲线样品的吸光值制作标准曲线。使用标准曲线的数学式根据各样品的吸光值算出OPN蛋白量。
B3)细胞中的总蛋白量测定:
将蛋白量测定用试样10μL和水90μL进行混合,稀释10倍。如表3所示用水稀释BSA溶液而配制出标准曲线样品。
[表3]
将包含于蛋白测定用试剂盒中的BCA试剂A和BCA试剂B(50:1)进行混合,配制出工作试剂(Working Reagent)。向96孔板中分别注入标准曲线样品(小瓶A~F)以及稀释10倍的蛋白测定用试样各25μL。由于试验重复实施两次,因此将对照组以及各浓度的被试化合物添加组分别准备两个孔。
向各孔内分别添加200μL工作试剂,并且通过涡旋混合器混合30秒钟。以60℃加热30分钟后,在室温下静置15分钟。之后,使用酶标仪(Bio-Rad;Benchmark或ThermoScientific;Varioskan Flash)测定吸光值(550nm)。
根据标准曲线样品的吸光值制作标准曲线,根据标准曲线的数学式算出各孔的稀释的试样的总蛋白浓度。此外,在总蛋白浓度上乘以稀释倍数(10倍),算出试样的总蛋白浓度。
(OPN(蛋白)量的显示)
将OPN量(每1mL培养上清的量)换算成以ELISA测定用的试样的总量(0.5mL)为单位的值。将该换算值除以与求出了OPN量的试样相同的孔的蛋白测定用试样总量(0.2mL)中的蛋白量,从而将OPN量换算成每1mg细胞总蛋白的值。根据该每1mg蛋白的OPN量研究了给予化合物3的影响。
(统计处理)
在OPN量的统计处理中使用Excel统计Statcel 3。在Excel文件上,通过将添加了作为被试化合物的化合物3的试样的OPN量与对照的OPN量之间的比较而进行了Dunnett检验。
图1示出通过添加化合物3而产生的A549细胞的OPN产生抑制效果的图表。化合物3被证实了在浓度为30μmol/L时小于5%的危险比下,在浓度为60μmol/L时小于1%的危险比下,与对照组(control)相比显著抑制A549细胞的OPN产生。
图2示出表示通过添加化合物3而产生的HepG2细胞的OPN产生抑制效果的图表。化合物3被证实了在浓度为15μmol/L以及浓度为30μmol/L时,在小于1%的危险比下,与对照组相比显著抑制HepG2细胞的OPN产生。尤其是,在浓度为30μmol/L时,OPN产生量与对照组相比减少一半以下。
根据图1以及图2,化合物3被证实了显著降低人非小细胞肺癌细胞株A549以及人肝癌细胞株HepG2所产生的OPN量。
<C:化合物3对于人非小细胞肺癌细胞株A549的创伤治愈能力的抑制效果>
抑制OPN启动子控制下的荧光素酶表达的化合物3实际上抑制作为蛋白的OPN产生由图1以及图2所示的实验结果得到确认。作为下一步,确认作为被试化合物的化合物3是否抑制因OPN产生而在细胞中产生的生理功能。作为确认方法中的一种,进行细胞的划痕试验(Wound-Healing assay)。该试验是对于检验细胞迁移能力的方法来说公知的方法。在将单层培养的细胞通过移液管的梢端等局部剥离细胞时,伤口的周围的细胞移动(迁移)而填充伤口的部分,通过在培养液中添加被试化合物,以此观察是否对该功能产生影响。
C1)划痕试验(Wound-Healing assay)方法
使人非小细胞肺癌细胞株A549在添加了10%FCS、1%P/S的DMEM培养基中悬浮并达到3.5×105cells/mL。向24孔板的各孔内分别注入500μL(1.75×105cells)细胞悬浮液。由于将试验重复实施三次,因此作为对照以及各浓度的被试化合物添加用孔,分别准备三个孔。在分注后,将24孔板在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养24±4小时。
在培养后,从全部孔中去除培养基。将在DMEM中添加0.1%牛血清白蛋白(BSA)以及1%P/S而成的培养基(无血清培养基)向全部孔内分别注入500μL。将板向前后左右摇动后,再一次从全部孔中去除培养基。在去除培养基后,向全部的孔内分别注入500μL无血清培养基。
将作为被试化合物的化合物3用DMSO制成50mmol/L溶液,并且保存在-80℃。将该化合物3溶液用DMSO进行稀释,分别配制为3.125mmol/L以及6.25mmol/L的浓度。在培养A549细胞的各孔内分别添加2μL化合物3的3.125mmol/L或6.25mmol/L的溶液。在对照孔内仅分别添加2μLDMSO。
将24孔板向前后左右摇动,在混合孔内的溶液后,在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养24±4小时。
在显微镜下观察24孔板内的细胞,在确认是100%汇合度后,使用20μL用微型移液器吸头的梢端在板底面的细胞上,每个孔划出3处刮伤。作为显微镜,使用安装有CCD摄像系统的Retiga-2000Fast 1394Color(QImaging)的倒置型研究显微镜IX71(奥林巴斯)。
在显微镜下观察创伤部,并且以使创伤部纳入图像中的形式调节拍摄。倍率设定为40倍(目镜:×10,物镜:×4)。在拍摄后,将24孔板在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养48±4小时。
在培养后,用显微镜观察创伤部,以使创伤部纳入图像中的形式调节拍摄。倍率设定为40倍(目镜:×10,物镜:×4)。
使用Image-Pro Plus 7.0J(MediaCybernetics公司)并基于拍摄的图像确认创伤部的面积。然后,基于如下计算式:
创伤恢复率(%)=100-[创伤两天后的创伤面积/刚创伤后的创伤部面积]×100,计算出创伤恢复率(%)。算出对照组以及两种浓度的化合物3给药组的各自的创伤恢复率(%)的平均值。又,还算出相对于对照组的创伤恢复率的化合物处理组的创伤恢复率(%)。
C2)统计处理:
对于创伤恢复率的算出值的统计处理,使用Excel统计Statcel 3在Excel文件上将全部的化合物3给药处理组的创伤恢复率与对照比较而进行Dunnett检验,以此实施所述统计处理。
图3示出显示添加化合物3时获得的A549细胞的创伤恢复抑制效果的图表。化合物3在浓度为12.5μmol/L时未被认为与对照组之间在创伤恢复率上有差异,但是在25μmol/L时,在小于1%的危险比下被认为与对照组之间在创伤恢复率上有显著差异。即,化合物3被证实在浓度为25μmol/L时显著抑制A549细胞的创伤恢复。
<D:化合物3对于人非小细胞肺癌细胞株A549的迁移侵袭能力的抑制效果>
作为研究被试化合物是否抑制因OPN产生而在细胞中产生的生理功能的第二次的试验,进行了基质侵袭试验(Matrix-Invasion assay)。在该试验中准备包被有作为细胞外基质成分的胶原蛋白或层粘连蛋白(Matrigel,BD Bioscience公司)且具有φ8μm的细孔(小孔)的膜贴在底部的杯(插入皿(insert))、和插入该插入皿的24孔板。将悬浮于无血清培养基中的细胞放入于内侧的插入皿内,在外侧的24孔板的各孔内注入添加了诱导细胞的迁移以及侵袭的物质(在这里是胎牛血清)的培养基,并且观察了通过插入皿的包被基质胶(matrigel)的膜后流出至外侧的孔的细胞数量。
基质胶是细胞培养用的人工基底膜基质,并且是从富含细胞外基质蛋白质的EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜调制品。基质胶的主成分是层粘连蛋白、胶原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Heparan sulfate proteoglycan)以及内联蛋白(entactin)/巢蛋白(nidogen)。基质胶中还包含TGF-β、上皮细胞增殖因子、胰岛素样生长因子、纤维芽细胞增殖因子、组织纤溶酶原激活因子以及EHS肿瘤中自然产生的其他增殖因子。
具体而言,在侵袭至膜的外侧的A549细胞中导入荧光色素后,从膜上剥离,并且测定其荧光强度。与此同时,在数量为已知的标准曲线制作用细胞中也导入荧光色素,由其荧光强度制作标准曲线。然后,根据近似曲线式求出细胞数为未知的被试样品的侵袭细胞数。
癌细胞是因加入于外侧的培养基中的胎牛血清的刺激而产生OPN。然而,在培养液中存在OPN时,细胞产生基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase;MMP)这样的分解胶原蛋白的酶而溶解基质胶,此外由于迁移能力提高,因此向外侧的孔移动。作为抑制OPN启动子控制下的荧光素酶表达的盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物的代表,观察到化合物3对于A549细胞的基质侵袭功能的抑制效果。
D1)基质侵袭试验(Matrix-Invasion assay)方法
使人非小细胞肺癌细胞株A549在添加了10%FCS、1%P/S的DMEM培养基中悬浮并达到1.8×105cells/mL。在75cm2培养瓶中分注10mL该悬浮液,在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养24±4小时。同样地,配制出A549细胞的6×104cells/mL的悬浮液以用于标准曲线的制作,在25cm2瓶中分注5mL该悬浮液,在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养24±4小时。将此日作为作业的第0天。
[次日:作业第一天]
从接种了细胞的75cm2培养瓶中去除培养基。在去除培养基的培养瓶中分注10mL添加了0.1%BSA以及1%P/S的DMEM培养基(无血清培养基),并且以在细胞表面均匀覆盖培养基的形式将培养瓶向前后左右倾斜。之后,从培养瓶中去除培养基。
在去除培养基的培养瓶中分注10mL无血清培养基。之后,在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养24±4小时。
[作业第二天]
将基质胶(10mg/mL:BD Biosciences)在冰上融解。将细胞培养插入皿(24孔板用,8.0μm孔:BD Biosciences)以及无血清培养基预先用冰冷却。将基质胶通过用冰冷却的无血清培养基稀释25倍,配制出基质胶溶液。
在24孔板上设置所需数量的细胞培养插入皿,并且在细胞培养插入皿内分别注入50μL基质胶溶液,并且通过吸头(tip)的梢端使基质胶溶液遍布于整个膜。之后,将24孔板在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中放入1~2小时。
去除前一天更换为无血清培养基的75cm2培养瓶的细胞的培养上清。分注10mL未添加钙·镁的磷酸缓冲生理盐水(D-PBS(-)),并且以在细胞表面均匀覆盖D-PBS(-)的形式使培养瓶向前后左右倾斜后,去除D-PBS(-)(将该操作称为通过D-PBS(-)进行的洗涤操作)。之后,将细胞剥离液(Cell Dissociation Solution;CDS)(SIGMA)的3~5mL分注至培养瓶中。将分注了CDS的培养瓶放入至二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中,加热20分钟左右(每五分钟摇动),进行从培养瓶底部剥离细胞的作业(将该作业称为通过CDS进行的细胞剥离)。
在以300×g进行离心分离后,去除上清,使用5mL的无血清培养基使细胞悬浮。取出悬浮液的一部分(10μL),添加10μL0.4%台盼蓝溶液并轻轻移液后,使用Burker-Turk血球计数板对细胞数进行计数,求出细胞浓度(将该作业成为细胞数计数)。
使用无血清培养基配制8mL的2×105cells/mL的细胞浓度的悬浮液。用基质胶溶液包被表面后,向在二氧化碳培养器中培养了1~2小时的培养插入皿内分别平稳地注入0.5mL(1×105cells)配制的细胞悬浮液。将试验重复进行三次。
在15mL管内分注5mL已添加10%FCS、1%P/S的DMEM培养基。在该管内分注2.5μL(最终浓度25μmol/L)或5μL(最终浓度50μmol/L)化合物3的50mmol/L的DMSO溶液,配制出化合物3添加培养基。将具有抑制迁移以及侵袭的效果的多西环素(DOXY;使用DMSO配制为100mmol/L,在-30℃下保存)作为阳性对照使用。在DMEM的10%FBS、1%P/S添加培养基5mL中添加3.75μL(最终为75μmol/L)多西环素100mmol/L,配制出阳性对照添加培养基。在添加了10%FCS、1%P/S的DMEM培养基5mL中添加5μL DMSO,配制出阴性对照添加培养基。
从培养插入皿与板之间的间隙向24孔板的孔内分别注入0.75mL的化合物3添加培养基、阳性对照添加培养基或阴性对照添加培养基。之后,将24孔板在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养48±4小时。
[作业第三天]
去除在25cm2培养瓶中培养的A549细胞的培养基,更换为5mL无血清培养基。之后,将25cm2培养瓶在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养24±4小时。
[作业第四天]
使钙黄绿素AM(50μg/小瓶:BD Biosciences)的小瓶恢复至室温,添加30μL DMSO并混合,配制出钙黄绿素AM溶液。在15mL管内分注5mLCDS,对此添加6μL钙黄绿素AM溶液并混合,配制出1×钙黄绿素AM溶液(被试插入皿用钙黄绿素AM溶液)。另一方面,在15mL管内分注1.5mL CDS,添加3.6μL钙黄绿素AM溶液并混合,配制出2×钙黄绿素AM溶液(标准曲线用钙黄绿素AM溶液)。
D2)标准曲线用细胞的准备
去除前一天更换培养基的25cm2培养瓶的细胞的培养上清,使用5mL D-PBS(-)进行上述洗涤操作。此外,使用3mL CDS进行上述的细胞剥离。之后,进行上述细胞数计数,使用CDS配制出5×105cells/mL的细胞悬浮液。然后,如表4所示,使用CDS稀释细胞悬浮液。在96孔黑色板(康宁公司)的各孔内分别注入50μL的小瓶A~H内的细胞悬浮液。试验重复进行三次。
[表4]
D3)钙黄绿素AM染色
在新的24孔板的各孔内分别注入0.75mL D-PBS(-)。将各插入皿通过镊子提起的同时通过移液管去除插入皿内的培养基,并且插入至分注了0.75mL D-PBS(-)的孔内。在各插入皿内分注0.5mL D-PBS(-),将插入皿用D-PBS(-)洗涤。
准备新的24孔板,在其各孔内分别注入0.35mL 1×钙黄绿素AM溶液。将用D-PBS(-)洗净的插入皿用镊子提起的同时使用移液管去除插入皿内的D-PBS(-),并且转移至分注了1×钙黄绿素AM溶液的孔内(被试插入皿的细胞的荧光染色)。将转移有插入皿的24孔板在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养1小时。每隔30分钟轻轻地敲打板的侧面。
在培养期间,在分注了细胞悬浮液的96孔黑色板的各孔内分别注入50μL 2×钙黄绿素AM溶液,并且用铝箔包住后在室温静置(标准曲线用的细胞的染色)。
D4)荧光测定
在1小时的培养结束后,将放入插入皿的24孔板在注意防止内部的液体溢流的同时摇动,而混合液体。之后,从24孔板的各孔中使用镊子去除各插入皿。将去除了插入皿的各孔的液体向新的96孔黑色板的各孔内以分别为100μL的量转移至三个孔(被试插入皿的细胞用板)。
使用酶标仪(Molecular Device;SpectraMax M5或Thermo Scientific;Varioskan Flash)测定标准曲线用细胞以及被试插入皿的细胞用的各自的96孔黑色板的各孔的荧光(激发光:485nm,发射光:520nm)。
D5)总侵袭细胞数的计算
将标准曲线用细胞的荧光强度(RLU)输入至Excel中,根据最小二乘法求出近似曲线(标准曲线)的数学式。使用标准曲线的数学式,根据96孔板的每个孔的荧光强度算出侵袭细胞数。将该侵袭细胞数乘以3.5,算出24孔板的每个孔的总侵袭细胞数,此外,由于重复进行三次,因此算出3个孔的总侵袭细胞数的平均值。
D6)统计处理
对于统计处理,使用Excel统计Statcel 3在Excel文件上通过阳性对照以及化合物3处理组的总侵袭细胞数与阴性对照(control)值的比较进行Dunnett检验,以此实施。
图4示出表示因添加化合物3而获得的A549细胞的基质侵袭抑制效果的图表。阳性对照组(多西环素给药组)的总侵袭细胞数为对照组的1/3以下。另一方面,化合物3在浓度为25μmol/L时与对照组相比总侵袭细胞数减少,但是未确认具有显著差异。然而,化合物3在浓度为50μmol/L时,总侵袭细胞数为对照组的约一半,并且在小于1%的危险比下,确认与对照组之间总侵袭细胞数有显著差异。即,化合物3被证实在浓度为50μmol/L时,显著抑制A549细胞的基质侵袭。
<E.甲羟戊酸对于OPN产生抑制作用的影响>
他汀类高胆固醇血症治疗药(具体是瑞舒伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀以及美伐他汀)是HMG-CoA还原酶抑制剂,并且被认为通过该酶的抑制导致甲羟戊酸的降低,因伴随于此的源自甲羟戊酸的异戊二烯量的降低导致对Ras那样的G蛋白产生影响,从而显示出OPN产生抑制效果(非专利文献8)。
为了确认本发明的OPN产生抑制剂的有效成分的盘基网柄菌吡喃酮衍生物或二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物所示出的OPN产生抑制效果是否具有与公知的他汀类高胆固醇血症治疗药相同的作用机制,而将辛伐他汀或化合物3添加至A549/OPNluc细胞的培养液中,研究对于OPN启动子控制下的基因表达的效果,并观察在甲羟戊酸的共存下是否也能维持该效果。
E1)WST实验
使A549/OPNluc细胞在添加了10%FCS以及1%P/S的DMEM培养基中悬浮并达到3×104cells/mL。将该悬浮液分别注入100μL至96孔板的各孔内,并且将96孔板在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养24±4小时。
将在-80℃下保存的化合物3的50mmol/L DMSO溶液在室温中静置并融解后,使用DMSO进行稀释,配制出5.0mmol/L的溶液。另一方面,使用DMSO配制辛伐他丁(simvastatin;SVS:SIGMA)的50mmol/L溶液,并且在-80℃下保存。将该溶液在使用时室温中静置并融解,使用DMSO进一步稀释,配制1mmol/L的SVS溶液。
使用乙醇配制甲羟戊酸(mevalonic acid;MVA:SIGMA)的0.5mol/L溶液,在-80℃下保存。将该溶液在使用时室温中静置并融解后,在37℃下静置30分钟,之后使用D-PBS(-)稀释,配制出20mmol/L以及200mmol/L的溶液。将配制的溶液在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)内静置20分钟(在此期间不时地混合)。
在分注了细胞悬浮液的孔内分别添加两种浓度(20mmol/L以及200mmol/L)的MVA溶液各0.5μL(MVA 100μmol/L:4孔,MVA 1mmol/L:4孔)。在使用涡旋混合器混合后,将96孔板在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养4小时。
在预先添加了MVA以使其达到100μmol/L或1mmol/L的四个孔内分别添加0.5μL化合物3的5.0mmol/L溶液。同样如此,在未添加MVA的两个孔内也分别添加0.5μL化合物3的5.0mmol/L溶液。此外,在添加了MVA以使其达到100μmol/L或1mmol/L的四个孔内分别添加0.5μL 1mmol/L的SVS溶液。同样如此,在未添加MVA的两个孔内分别添加0.5μL 1mmol/L的SVS溶液。在作为对照药物的MVA、化合物3以及SVS均未被添加的两个孔内分别添加0.5μLDMSO(对照)。表5示出各试验组中的添加药物以及添加量。
[表5]
在通过涡旋混合器混合后,将96孔板在二氧化碳培养器(37℃,5%CO2条件下)中培养48±4小时。之后,在各孔内分别添加10μL Premix WST-1Reagent(TAKARABIO)。在使用涡旋混合器混合后,在37℃、5%CO2条件下培养,使用酶标仪(Bio-Rad;Benchmark或ThermoScientific;Varioskan Flash)测定30分钟、90分钟以及120分钟后的吸光值(450nm)。
将吸光值输入至Excel文件中,将各试验组的全部的样品的吸光值除以对照的吸光值的平均值,求出各个吸光值相对于对照吸光值的比值(与对照的比值(ratio tocontrol));
各样品的吸光值÷对照的吸光值=与对照的比值。
E2)荧光素酶实验
去除WST实验结束的各孔的上清,在各个孔内分别注入100μL D-PBS(-)。将荧光素酶实验系统(luciferase assay systems)(Promega)中含有的荧光素酶实验底物(luciferase assay substrate;LAS)用荧光素酶实验缓冲液(Luciferase Assay Buffer;LAB)溶解,配制出荧光素酶试剂。此外,将5×CCLR用水稀释5倍,配制出1×CCLR。
完全去除各孔的D-PBS(-),并且分别注入50μL 1×CCLR。之后,将96孔板在室温中静置30分钟。将静置后的各孔内的1×CCLR作为测定用试样。在化学发光测定用管内分别注入荧光素酶试剂100μL,在该管内添加20μL测定用试样并进行混合,使用GloMax20/20Luminometer(Promega)测定了化学发光(相对发光强度:RLU)。
将对照的RLU以及各测定用试样的RLU分别输入至Excel文件中。将各组的RLU除以WST实验中求出的与对照的比值,从而修正因添加化合物3或SVS而受到影响的细胞增殖速度的差值所产生的RLU的差值。
图5示出表示相对于由SVS所产生的荧光素酶活性抑制效果的、通过添加MVA而产生的恢复效果的图表。通过添加SVS,被控制OPN启动子的A549细胞的荧光素酶活性降低。然而,如下结果得到证实:通过以100μmol/L或1mmol/L的浓度添加MVA,以此SVS的荧光素酶活性抑制效果消失,A549细胞的荧光素酶活性恢复至与对照组相同的程度。
图6示出表示相对于由化合物3所产生的荧光素酶活性抑制效果的、通过添加MVA而产生的影响的图表。通过添加化合物3而产生的荧光素酶活性抑制并未因MVA添加而恢复。
图5以及图6示出SVS的荧光素酶活性抑制与化合物3的荧光素酶活性抑制在作用机制上不同。
工业应用性:
本发明的以盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分的OPN产生抑制剂有望能够预防如癌转移那样的因OPN产生亢进而引起的疾病。本发明的以盘基网柄菌吡喃酮衍生物以及二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分的OPN产生抑制剂作为具有不同于以往的OPN产生抑制剂的作用机理的OPN产生抑制剂在医药品、生物化学或生物技术领域有用。
Claims (4)
1.一种以化学式1或化学式2表示的化合物为有效成分的骨桥蛋白产生抑制剂在制备预防非小细胞肺癌转移或肝癌转移药物中的应用,
2.一种以化学式3或化学式4表示的化合物为有效成分的骨桥蛋白产生抑制剂在制备预防非小细胞肺癌转移或肝癌转移药物中的应用,
3.一种以化学式5、化学式8或化学式10表示的化合物为有效成分的骨桥蛋白产生抑制剂在制备预防非小细胞肺癌转移或肝癌转移药物中的应用,
4.一种以化学式14、化学式15或化学式16表示的化合物为有效成分的骨桥蛋白产生抑制剂在制备预防非小细胞肺癌转移或肝癌转移药物中的应用,
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013-046197 | 2013-03-08 | ||
JP2013046197 | 2013-03-08 | ||
PCT/JP2013/006943 WO2014136161A1 (ja) | 2013-03-08 | 2013-11-26 | ジクチオピロン誘導体又はジヒドロジクチオピロン誘導体を有効成分とするオステオポンチン産生阻害剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105209038A CN105209038A (zh) | 2015-12-30 |
CN105209038B true CN105209038B (zh) | 2017-06-09 |
Family
ID=51490730
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201380069437.4A Active CN105209038B (zh) | 2013-03-08 | 2013-11-26 | 以盘基网柄菌吡喃酮衍生物或二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分的骨桥蛋白产生抑制剂 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9463188B2 (zh) |
EP (1) | EP2965758B1 (zh) |
JP (1) | JP5716140B2 (zh) |
KR (1) | KR101593018B1 (zh) |
CN (1) | CN105209038B (zh) |
AU (1) | AU2013380489B2 (zh) |
CA (1) | CA2896446C (zh) |
WO (1) | WO2014136161A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3112343B1 (en) | 2014-02-28 | 2023-03-29 | Tohoku University | Amide derivatives |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102475701B (zh) * | 2010-11-30 | 2014-07-23 | 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 | 一种吡喃酮类化合物的应用 |
-
2013
- 2013-11-26 CA CA2896446A patent/CA2896446C/en active Active
- 2013-11-26 AU AU2013380489A patent/AU2013380489B2/en active Active
- 2013-11-26 EP EP13876873.4A patent/EP2965758B1/en active Active
- 2013-11-26 KR KR1020157001055A patent/KR101593018B1/ko active IP Right Grant
- 2013-11-26 WO PCT/JP2013/006943 patent/WO2014136161A1/ja active Application Filing
- 2013-11-26 US US14/766,543 patent/US9463188B2/en active Active
- 2013-11-26 CN CN201380069437.4A patent/CN105209038B/zh active Active
- 2013-11-26 JP JP2014552995A patent/JP5716140B2/ja active Active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Structural requirements of dictyopyrones isolated from Dictyostelium spp.in the regulation of dictyostelium development and in anti-leukemic activity;Haruhisa Kikuchi, et al.;《Bioorganic & Medicinal Chemistry》;20040508(第12期);第3203-3214页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101593018B1 (ko) | 2016-02-22 |
JPWO2014136161A1 (ja) | 2017-02-09 |
AU2013380489B2 (en) | 2015-10-01 |
US20150366851A1 (en) | 2015-12-24 |
CA2896446A1 (en) | 2014-09-12 |
EP2965758B1 (en) | 2018-01-03 |
EP2965758A1 (en) | 2016-01-13 |
EP2965758A4 (en) | 2016-05-11 |
AU2013380489A1 (en) | 2015-08-06 |
CN105209038A (zh) | 2015-12-30 |
US9463188B2 (en) | 2016-10-11 |
JP5716140B2 (ja) | 2015-05-13 |
KR20150023021A (ko) | 2015-03-04 |
WO2014136161A1 (ja) | 2014-09-12 |
CA2896446C (en) | 2016-06-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Mansoorifar et al. | Bone‐on‐a‐chip: microfluidic technologies and microphysiologic models of bone tissue | |
CN101370789B (zh) | 作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的吡啶和嘧啶衍生物 | |
Kirsch et al. | A new bioactive sesterterpene and antiplasmodial alkaloids from the marine sponge Hyrtios cf. erecta | |
EP3184519A1 (en) | ACID-ADDITION SALT OF Trk-INHIBITING COMPOUND | |
White et al. | The bengamides: a mini-review of natural sources, analogues, biological properties, biosynthetic origins, and future prospects | |
CN102250203B (zh) | β-咔啉类氨基酸苄酯及其制备和应用 | |
CN105209038B (zh) | 以盘基网柄菌吡喃酮衍生物或二氢盘基网柄菌吡喃酮衍生物为有效成分的骨桥蛋白产生抑制剂 | |
CN107721975A (zh) | 具有抗肿瘤活性的brd4小分子抑制剂、合成方法及其应用 | |
CN104761572B (zh) | 一叶萩型生物碱二聚体类化合物或其可药用盐及其制法和应用 | |
CN105884645B (zh) | 一类大黄酸类化合物及其用途 | |
CN104193686B (zh) | N-没食子酰胺-嘧啶基苯磺酰胺类衍生物及其制备方法和应用 | |
CN104356119A (zh) | 多取代嘧啶类他汀内酯脱水化合物及其用途 | |
CN104069508A (zh) | FoxO1基因在药物制备中的应用 | |
CN105796568A (zh) | 用于调控激酶级联的药物组合物及其使用方法 | |
Xiong et al. | Enhancing anti-tumor potential: low-intensity vibration suppresses osteosarcoma progression and augments MSCs' tumor-suppressive abilities | |
CN106029632A (zh) | 酰胺衍生物 | |
CN105906598A (zh) | 白杨素衍生物及其制备方法和应用 | |
CN111040018A (zh) | 丙烯酸雷公藤甲素酯、其制备方法及其应用 | |
CN109602765A (zh) | 一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法及其应用 | |
CN101313900B (zh) | 羟基脂肪酸寡聚物及其在调节细胞内钙离子浓度中的应用 | |
CN108704135A (zh) | Chaf1a抑制剂在制备胃癌治疗药物中的用途 | |
CN106810565B (zh) | 映‑三白草酮类衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
CN107253955B (zh) | 吡喃骈吲哚化合物的制备方法及其用途 | |
CN107019687A (zh) | N‑(4‑氯苯基)‑3‑羟基‑2‑萘甲酰胺类化合物的用途 | |
CN105175399A (zh) | 多取代嘧啶类他汀含氟衍生物及其用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |