CN108704135A

CN108704135A - Chaf1a抑制剂在制备胃癌治疗药物中的用途

Info

Publication number: CN108704135A
Application number: CN201810509943.5A
Authority: CN
Inventors: 王德强; 束永前; 李小琴; 陈德玉; 顾汉刚; 朱雯
Original assignee: Affiliated Hospital of Jiangsu University; Jiangsu Province Hospital
Current assignee: Affiliated Hospital of Jiangsu University; Jiangsu Province Hospital
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2018-10-26

Abstract

本发明属于生物医学研究领域，具体涉及CHAF1A抑制剂在制备胃癌治疗药物中的用途。本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，CHAF1A可作为胃癌治疗靶点。CHAF1A抑制剂可减少胃癌细胞的生长数量；降低胃癌细胞的增值率；增加胃癌细胞的S期细胞百分比；增加胃癌细胞S期阻滞；增加胃癌细胞的凋亡率；抑制胃癌细胞所形成肿瘤的生长速度；减小胃癌细胞所形成肿瘤的体积；降低胃癌细胞所形成肿瘤的重量，为胃癌治疗开辟新的方向。

Description

CHAF1A抑制剂在制备胃癌治疗药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医学研究领域，具体涉及CHAF1A抑制剂在制备胃癌治疗药物中的用途。

背景技术

据国家癌症中心报道，2015年我国估算新发胃癌病例67.91万，当年死亡病例49.80万，均位列恶性肿瘤的第二位。胃癌具有高度异质性，因此个体化防治难以实施，是导致胃癌治疗困难、治疗反应各异及靶向药物缺乏的重要原因。因此，进一步阐明胃癌的分子基础，以寻找新的治疗靶点，是提高胃癌防治有效率的关键。

CHAF1A(p150)在胃癌中的作用仍未见报道。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供CHAF1A抑制剂在制备胃癌治疗药物中的用途。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供了CHAF1A抑制剂用于制备胃癌治疗药物的用途。

一种实施方式中，所述胃癌治疗药物至少具有以下功用之一：

减少胃癌细胞的生长数量；降低胃癌细胞的增值率；增加胃癌细胞的S期细胞百分比；增加胃癌细胞S期阻滞；增加胃癌细胞的凋亡率；抑制胃癌细胞所形成肿瘤的生长速度；减小胃癌细胞所形成肿瘤的体积；降低胃癌细胞所形成肿瘤的重量。

一种实施方式中，所述CHAF1A抑制剂是指对CHAF1A具有抑制效果的分子。

对于CHAF1A具有抑制效果包括但不限于：抑制CHAF1A活性，或者抑制CHAF1A基因转录或表达。

所述CHAF1A抑制剂可以为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。

如本发明实施例列举的，所述CHAF1A抑制剂可以为siRNA或shRNA。所述siRNA 的靶序列或shRNA的靶序列如SEQ ID NO.1所示。

所述胃癌治疗药物必然包括CHAF1A抑制剂，并以CHAF1A抑制剂作为前述功用的有效成分。

所述胃癌治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为CHAF1A抑制剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

亦即，CHAF1A抑制剂为所述胃癌治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述胃癌治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述胃癌治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述胃癌治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明的第二方面，提供了一种治疗胃癌的方法，为向对象施用CHAF1A抑制剂。

所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的胃癌细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述胃癌细胞可以为离体胃癌细胞。

所述对象可以是罹患胃癌的患者或者期待治疗的胃癌的个体。或者所述对象为胃癌患者或者期待治疗胃癌的个体的离体胃癌细胞。

所述CHAF1A抑制剂可以在接受胃癌治疗前、中、后向对象施用。

本发明的第三方面，提供一种胃癌治疗药物，包括有效剂量的CHAF1A抑制剂。

进一步地，所述胃癌治疗药物，包括有效剂量的CHAF1A抑制剂及药用载体。

所述胃癌治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

本发明的第四方面，提供一种胃癌联合治疗药物组合，包括有效量的CHAF1A抑制剂和至少一种其他胃癌治疗药物。

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将CHAF1A抑制剂和其他胃癌治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

当其他胃癌治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他胃癌治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。

二)将CHAF1A抑制剂和其他胃癌治疗药物配置成复方制剂，在将CHAF1A抑制剂和其他胃癌治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

本发明的第五方面，提供一种治疗胃癌的方法，为向对象施用有效量的CHAF1A抑制剂以及向对象施用有效量的其他胃癌治疗药物和/或向对象实施其他胃癌治疗手段。

可以同步地或顺序地给予有效量的CHAF1A抑制剂和至少一种有效量的其他胃癌治疗药物。

基于CHAF1A为本发明首次发现的胃癌治疗靶点，在与CHAF1A抑制剂以外的其他胃癌治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于胃癌的治疗作用。

其他的胃癌治疗药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。

所述CHAF1A抑制剂可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。所述其他胃癌治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。对于抗体药物，一般采用胃肠外给药。

本发明的第六方面，提供CHAF1A抑制剂在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：减少胃癌细胞的生长数量；降低胃癌细胞的增值率；增加胃癌细胞的S期细胞百分比；增加胃癌细胞S期阻滞；增加胃癌细胞的凋亡率；抑制胃癌细胞所形成肿瘤的生长速度；减小胃癌细胞所形成肿瘤的体积；降低胃癌细胞所形成肿瘤的重量。

本发明的第七方面，提供CHAF1A在制备和筛选胃癌治疗药物中的用途。

一种实施方式中，CHAF1A作为作用靶标。

所述用途具体是指：将CHAF1A作为作用对象，对候选物质进行筛选，以找到CHAF1A抑制剂，作为潜在的胃癌治疗药物。

本发明的第八方面，提供一种筛选胃癌治疗药物的方法，包括步骤：将CHAF1A作为作用对象，对候选物质进行筛选，以找到CHAF1A抑制剂，作为潜在的胃癌治疗药物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，CHAF1A可作为胃癌治疗靶点。CHAF1A抑制剂可减少胃癌细胞的生长数量；降低胃癌细胞的增值率；增加胃癌细胞的S期细胞百分比；增加胃癌细胞S期阻滞；增加胃癌细胞的凋亡率；抑制胃癌细胞所形成肿瘤的生长速度；减小胃癌细胞所形成肿瘤的体积；降低胃癌细胞所形成肿瘤的重量，为胃癌治疗开辟新的方向。

附图说明

图1：pGCSIL-GFP质粒DNA图谱。

图2：GV365质粒DNA图谱。

图3：CHAF1A基因敲减使其mRNA及蛋白表达水平显著下调CON:control；NC:negative control；KD:knock-down。

图4：CHAF1A基因扩增使其蛋白表达显著上调。

图5：Cellomics实时检测CHAF1A基因敲减对胃癌细胞生长的影响。

图6：Cellomics检测CHAF1A基因敲减对胃癌细胞生长数量的影响。

图7：MTT检测CHAF1A基因敲减对胃癌细胞增值率的影响。

图8：MTT检测CHAF1A基因扩增对胃癌细胞增值率的影响。

图9：CHAF1A基因敲减对胃癌细胞周期的影响。

图10：CHAF1A基因敲减对胃癌细胞凋亡的影响。

图11：CHAF1A基因扩增对胃癌细胞周期的影响。

图12：CHAF1A基因扩增对胃癌细胞凋亡的影响。

图13：CHAF1A在TCGA胃癌组织中与cyclin A2(编码基因为CCNA2)、Bcl-xl(BCL2L1)、Survivin(BIRC5)及p21(CDKN1A)基因mRNA表达水平的关系。

图14：CHAF1A在本研究的34例胃癌测序组织中与cyclin A2(编码基因为CCNA2)、Bcl-xl(BCL2L1)、Survivin(BIRC5)及p21(CDKN1A)基因mRNA表达水平的关系。

图15：CHAF1A基因敲减影响胃癌细胞在活体(in vivo)的成瘤性a:裸鼠及其肿瘤的代表性图像；b:肿瘤体积变化曲线的比较；c:肿瘤重量的比较。

图16：CHAF1A基因敲减前后SGC-7901胃癌细胞基因表达谱变化的聚类图。

图17：基因芯片检测中与CHAF1A有关的信号通路分析。

图18：基因芯片检测中与CHAF1A有关的信号通路分析

图19：基于TCGA测序数据，CHAF1A在胃癌组织中与选择性基因mRNA表达水平间的相关性。

图20：基于GSEA的Gene Ontology分析提示CHAF1A抑制与氧化磷酸化有关的细胞代谢功能(均P<0.001；control vs CHAF1A敲减)。

图21：PathScan细胞内信号测试CHAF1A扩增在MGC-803和SGC-7901胃癌细胞中显著活化HSP27，p38MAPK，Chk1和Survivin，抑制Bad(通过Ser136氨基酸位点的磷酸化)和IκBα(通过Ser32和Ser36氨基酸位点的磷酸化)，在SGC-7901细胞中还活化 SAPK/JNK(P<0.05)。

图22：胃癌细胞中CHAF1A的信号网络图。

具体实施方式

本研究对CHAF1A与胃癌的关系展开了系统研究：1)在活体外(in vitro)及活体内(in vivo)通过功能实验研究CHAF1A基因沉默对胃癌细胞增殖、细胞周期、凋亡及成瘤能力的影响；2)进一步通过CHAF1A扩增实验加以验证，以证明CHAF1A对胃癌恶性表型的作用；3)利用基因芯片分析CHAF1A基因沉默前后的基因表达谱变化，并对表达变化显著的基因予以选择性验证其蛋白水平的表达；4)利用细胞内压力及凋亡信号的抗体检测实验对CHAF1A扩增后的相关蛋白表达进行分析；5)绘制CHAF1A相关的信号通路，以揭示 CHAF1A在胃癌中的分子机制。

本发明在研究中发现，CHAF1A可作为胃癌治疗靶点。CHAF1A抑制剂可减少胃癌细胞的生长数量；降低胃癌细胞的增值率；增加胃癌细胞的S期细胞百分比；增加胃癌细胞S期阻滞；增加胃癌细胞的凋亡率；抑制胃癌细胞所形成肿瘤的生长速度；减小胃癌细胞所形成肿瘤的体积；降低胃癌细胞所形成肿瘤的重量。因此，CHAF1A抑制剂可用于治疗胃癌。

通过本研究的实施，我们证实了CHAF1A在胃癌发生过程中的重要作用，为胃癌治疗提供了新的靶点，基于CHAF1A抑制剂可以进一步开发新的治疗药物。

CHAF1A

CHAF1A是指染色质组装因子1亚单位A(chromatin assembly factor 1subunitA)。 CHAF1A的Genebank登录号为NM_005483。

CHAF1A抑制剂

指对于CHAF1A具有抑制效果的分子。对于CHAF1A具有抑制效果包括但不限于：抑制CHAF1A活性，或者抑制CHAF1A基因转录或表达。所述CHAF1A抑制剂包括但不限于siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。

抑制CHAF1A活性是指使CHAF1A活力下降。优选地，相比抑制前，CHAF1A活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。

抑制CHAF1A基因转录或表达是指：使CHAF1A的基因不转录，或降低CHAF1A的基因的转录活性，或者使CHAF1A的基因不表达，或降低CHAF1A的基因的表达活性。

本领域技术人员可以使用常规方法对CHAF1A的基因转录或表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。

CHAF1A的基因转录或表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。

优选地，与野生型相比，CHAF1A基因转录或表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地CHAF1A基因完全没有表达。

小分子化合物

本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。

CHAF1A抑制剂制备药物

以CHAF1A抑制剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与CHAF1A抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

联合治疗药物组合和施用方法

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将CHAF1A抑制剂和其他胃癌治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。

抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。

小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。siRNA、shRNA、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。

使用时，可将有效量的CHAF1A抑制剂和有效量的其他胃癌治疗药物同时使用，也可将有效量的CHAF1A抑制剂和有效量的其他胃癌治疗药物先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 CHAF1A在胃癌细胞中的功能实验

一、方法

1.细胞系和细胞培养：MGC-803和SGC-7901均购自中科院上海生化所，培养于37℃、 5％CO₂培养箱中，使用RPMI 1640或DMEM(GIBCO-BRL)培养基。

2.CHAF1A RNA干扰慢病毒载体制备

2.1siRNA设计：由Pubmed Nucleotide获取CHAF1A基因(NM_005483)序列，利用公用网站按照RNA干扰序列设计原则，设计多个RNA干扰靶点序列，进一步评估测定，选择最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，确定的siRNA的靶序列为：CCGACTCAATTCCTGTGTAAA(SEQ ID NO.1)；

2.2双链DNA oligo制备：由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，正反链为：CcggCCGACTCAATTCCTGTGTAAATTCAAGAGATTTACACAGGAATTGAGTCGGTTTTT g(SEQ ID NO.2)；和aattcaaaaaCCGACTCAATTCCTGTGTAAATCTCTTGAATTTACACAGG AATTGAGTCGG(SEQ IDNO.3)；

2.3siRNA载体构建：pGCSIL-GFP载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司，质粒DNA 图谱如图1所示；

2.4Age I和EcoRI酶切pGCSIL-GFP载体以使其线性化：酶切反应体系见表1，将相关混合的反应物置于37℃，1h；对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。

表1.酶切反应体系

2.5感受态制备

2.5.1配置下述溶液：

1、0.1M CaCl₂溶液，以0.45过滤除菌；

2、250mM KCl₂溶液

3、2M MgCl₂溶液，高压灭菌；

4、SOB:1ml250mM KCl₂溶液加入100ml LB，以5M NaOH调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml 2M MgCl₂溶液；

2.5.2用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞

1、从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转/分)。

2、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，3、在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。

4、于4℃,以4000转/分离心10分钟，回收细胞。

5、倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

6、以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份沉淀，放置于冰浴上。

7、于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。

8、倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

9、每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份细胞沉淀。

10、将细胞分装成小份，放于-70℃冻存。

2.6克隆制备：

2.6.1连接，反应体系见表2，于16℃连接过夜；

表2.连接反应体系:

2.7转化

2.7.1配置下述溶液：

1、250mM KCl₂溶液；

2、2M MgCl₂溶液，高压灭菌；

3、SOB培养基:1ml250mM KCl₂溶液加入100ml LB，以5M NaOH调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml 2M MgCl₂溶液；

4、SOB琼脂培养基：0.49396g MgSO₄.7H₂O溶于100mlSOB培养基，加入1.5琼脂粉，高压灭菌，冷至温度低于60℃，加入Amp至终浓度到100μg/ml，混匀铺板，一般 90mm直径平皿需要30-50ml培养基；

5、1M葡萄糖溶液，过滤除菌；

6、SOC培养基：2ml 1M葡萄糖溶液加入100ml SOB培养基；

2.7.2实验步骤：

1、用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加2μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。

2、将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。

3、快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l-2分钟。

4、每管加800μl SOC培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏。

5、将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO₄和Amp抗性(100ug/ml)的LB琼脂培养基上。

6、将平板置于室温直至液体被吸收。

7、倒置平皿，于37℃培养，16小时。

8、阳性克隆PCR鉴定。

2.8阳性克隆的PCR鉴定

2.8.1PCR反应体系见表3

表3.PCR反应体系

2.8.2PCR引物说明：

Primer(+)：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’(SEQ ID NO.4)；

Primer(-)：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’(SEQ ID NO.5)。

2.8.3PCR仪进行反应，循环条件：94℃30sec，94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，72℃6min，共30cycle；菌落PCR模版：在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于 10μlLB，混匀取1μl作为模板；阴性对照：排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果；

2.8.4电泳：设阴性对照(ddH2O)、自连对照(空载体自连对照组)、Marker(5Kb，3Kb， 2Kb，1.5Kb，1Kb，750，500，250，100bp)及样品1-5。

2.9挑选阳性克隆送测序，结果示例(粗体部分为目的序列，Ccgg是AgeI酶切位点，重组载体中该酶切位点被破坏。TTTTT是终止信号，g是EcoRI酶切位点)。

2.10质粒抽提

将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的质粒进入下游流程。详细操作步骤如下：

1)收集过夜培养的菌液于标记好的5ml离心管，12000rpm，离心2min收菌；

2)弃上清,加入250μl细胞重悬液，充分振荡，使菌块悬浮均匀；

3)加入250μl细胞裂解液，再加入10μl蛋白酶K，上下颠倒5-6次，轻轻混匀；静置1-2min，致使菌体裂解澄清；

4)加入350μl中和液，上下颠倒混匀，使蛋白完全析出，冰浴静置5min；

5)10000rpm离心10min，弃蛋白，收集上清于另一干净无菌的1.5ml EP管；

6)12000rpm离心5min，同时准备标记好的回收柱，将上清转移至回收柱中，12000rpm 离心1min，弃下层废液；

7)加入600μl预先配置好的漂洗液，12000rpm离心1min，弃下层废液，重复一次，12000rpm空离2min，进一步除去残留的漂洗液；

8)在超净台中将回收柱转移至新的1.5ml EP管中，静置10-20min，自然晾干；

9)往回收柱中加入95μl Nuclease-Free Water，静置2min，12000rpm离心2min，收集样品做好编号，电泳、测定浓度，进行质检。

3.CHAF1A扩增慢病毒载体制备

3.1CHAF1A基因片段的获取

3.1.1引物：

CHAF1A-P1：

GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGCTGGA GGAGCTGGAGTGCGGGGCG (SEQ IDNO.7)；

CHAF1A-P2：TCCTTGTAGTCCATACCGGATG CACCCAGTGGGCTCGCGGTCAG (SEQ IDNO.8)；

3.1.2PCR扩增目的基因片段：反应体系如表5，轻轻吹打混匀，短暂离心，置于PCR仪中进行反应。

表4.PCR反应体系

3.1.3PCR仪进行反应，循环条件：98℃5min，98℃10s，55℃10sec，72℃90s，72℃8min，共30cycle；

3.2基于扩增载体构建：GV365载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司，质粒DNA图谱如图2所示；

3.3Age I酶切GV365载体以使其线性化：酶切反应体系见表5，将相关混合的反应物置于37℃，1h；对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。

表5.酶切反应体系

3.5PCR产物与载体进行交换：于冰水浴中配制反应体系，见表6。用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，避克产生气泡。于37℃反应30min，随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。

表6.反应体系

3.6感受态细胞制备、转化、阳性克隆鉴定及质粒抽提均参见siRNA慢病毒载体制备，阳性克隆测序结果如下(粗体部分为目的序列)：

4.慢病毒的包装

4.1细胞株：293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10％FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞；

4.2菌株：大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒；

4.3病毒载体见siRNA载体构建；

4.4DNA溶液的制备：以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒 DNA的A260/A280在1.8～2.0之间；

4.5病毒包装过程：

1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度为1.2x 10⁷细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染。

2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。

3)向一灭菌离心管中加入所制备的DNA溶液20μg，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟。

4)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100μl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。

5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。

6)混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。

7)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃, 5％CO₂细胞培养箱中培养。

8)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。

9)每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基25ml，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48小时。

4.6病毒的收获及浓缩

1)收集转染后48小时(转染即可为0小时计起)的293T细胞上清液。

2)于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。

3)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。

4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19ml)，盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中。

5)组合好后，做好平衡，放在转头上。

6)在4000g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。

7)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。

8)将过滤杯倒扣在样品收集杯上。

9)离心力不超过1000g，时间为2分钟，把过滤杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。

10)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80度长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。

4.7病毒滴度鉴定

采用孔稀释法：

1)测定前一天，为测定滴度所需的细胞铺板，96孔板，每个孔加4×104个细胞，体积为100μl。

2)根据病毒的预期滴度，准备7～10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl的无血清培养基。

3)取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。

4)选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基，丢弃。加入90μl稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。

5)24小时后，加入完全培养基100μl。小心操作，不要吹起细胞。

6)4天后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。

7)病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量。

5.慢病毒的感染

5.1准备目的细胞

5.1.1细胞复苏

1)从液氮罐中取出细胞冻存管

2)迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻

3)完全解冻后，1000rpm，离心2min

4)70％酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台

5)吸去冻存液上清，加入1ml新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3ml 含完全培养基的6-cm dish中，轻轻晃匀后置于37℃、5％CO2培养箱培养

6)次日更换一次培养液后再继续培养

5.1.2细胞传代

1)将生长90％汇合的细胞进行传代

2)弃去旧培养液，加入2ml灭菌的D-Hank’s溶液，洗涤细胞生长面，然后弃去该溶液

3)加入1ml胰酶消化液，37℃消化约1-2min，直到细胞完全消化下来

4)加入完全培养基2ml，用刻度吸管吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来

5)混匀细胞后分至两个新的6cm dish中，补足完全培养基至4ml，继续培养

5.2目的细胞慢病毒感染

1)处于对数生长期的目的细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液

2)将细胞悬液(细胞数约为5×10⁴)接种于6-well中，37℃5％CO2培养箱培养待细胞融合度达到约30％

3)根据细胞MOI值，加入适宜量的病毒

4)12h后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基

5)感染3天后观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况，荧光率大于80％者，将细胞分成两分，一份分于12孔培养板中待长满后收集细胞用于RNA提取，一份分于6孔板中待长满后收集细胞用于蛋白提取；感染效率低于80％的实验组，重新进行感染实验；

6)以上的操作是针对贴壁细胞设计的。悬浮细胞的区别主要在细胞分盘上，它不需要提前一天分盘。操作时将细胞离心后悬浮在不同的培养基中，计数分盘后，就可以加入病毒。

6.qRT-PCR检测CHAF1A基因敲减效率：参见第一节qRT-PCR检测方法。

7.Western Blot检测CHAF1A基因的表达

7.1细胞总蛋白抽提

1)从培养箱中取出细胞，弃去细胞培养液，PBS洗涤2次；

2)弃去PBS，加入适量预冷的1×Lysis Buffer(即蛋白电泳loading buffer)；

3)用移液枪头吹打至细胞充分裂解，将细胞裂解样品转移入Ep管中，冰上再裂解细胞10～15min；

4)4℃，12000g，离心5min，放入沸水中水浴10min；

5)4℃，12000g，离心1min，-80℃保存备用。

7.2SDS-PAGE

1)制胶：根据目的蛋白分子量大小配制相应浓度的胶；

2)上样：等胶凝固好后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品进行上样；

3)电泳：恒压80V，2小时。

7.3免疫印迹(湿转)

电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃，300mA恒流条件下电转150min，将蛋白转移到PVDF膜上

7.4免疫显色：

1)封闭：用封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h或4℃过夜；

2)一抗孵育：封闭液稀释抗体，然后不封闭好的PVDF膜室温孵育2h或4℃过夜；

3)洗膜：TBST洗膜3次，每次10min；

4)二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜2h；

5)洗膜：TBST洗膜3次，每次10min；

6)采用Amersham公司ECL+plusTM Western blotting system试剂盒进行显色；

7)X光显影：在暗房中进行获得显示条带的胶片。

8.Cellomics实时(real time)细胞计数检测细胞生长：感染病毒的细胞通常带有绿色或红色荧光，Cellomics仪器可以读取带荧光的细胞并拍照，然后通过软件分析处理计算出孔板中不同组别含有的细胞数目。连续检测3-5天后，绘制出细胞生长曲线图，从而呈现出细胞生长状况。

1)将处于对数生长期的各实验组(CHAF1A siRNA和空质粒转染的对照)细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；

2)用血球计数板对细胞计数；

3)根据细胞生长快慢决定铺板(96孔板)细胞密度(多数为2000cell/well)；每组3-5复孔，每孔100μl，铺板过程中要确保每孔加入细胞数目的一致；

4)铺好板后，置37℃5％CO2培养箱培养；

5)从铺板后第二天开始，每天CELLOMICS检测读板一次，连续检测读板3-5天；

6)通过调整cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；

7)对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。

9.FACS细胞周期检测

使用的流式细胞仪为FACSCalibur(美国BD公司)，荧光显微镜为micropublisher3.3RTV(日本奥林巴斯公司)

1)待各实验组6cm dish细胞生长至覆盖率约为80％时(确保细胞未进入生长平台期)：吸弃细胞培养上清，D-Hanks洗涤细胞一次，胰酶消化细胞，完全培养基终止，收集细胞于5ml离心管中，每组设三个复孔。(为保证上机细胞数足够，细胞数目≥1000000/处理)；

2)1200rmp离心5min，弃去上清；

3)4℃预冷的PBS(pH＝7.2～7.4)洗涤细胞沉淀1次，1500rmp 5min离心，收集细胞；

4)4℃预冷的70％乙醇固定细胞至少1h；

5)1500rmp离心5min去固定液，PBS洗涤细胞沉淀一次，步骤同3；

6)细胞染色液配制：40×PI母液(2mg/ml)：100×RNase母液(10mg/ml)：1×PBS＝25： 10：1000；

7)细胞染色：根据细胞量，加入一定体积的细胞染色液(1～1.5ml)重悬，使上机时细胞通过率为200～350Cell/s；

8)300目的筛网过滤于流式上机管中，上机检测。

10.Annexin V-APC单染法流式细胞仪检测细胞凋亡

使用的凋亡试剂盒为Annexin VAPC Apoptosis Detection Kit(美国ebioscience)，流式细胞仪为FACSCalibur(美国BD公司)，荧光显微镜为micropublisher3.3RTV(日本奥林巴斯公司)。

1)收集感染后各实验组细胞培养上清于5ml离心管中，D-Hanks洗涤细胞一次，胰酶消化细胞，培养上清终止化，收集细胞于同一5ml离心管中。每组设三个复孔；

2)1500rmp 5min离心，弃去上清；

3)PBS洗涤细胞沉淀一次，1500rmp 5min离心，收集细胞；

4)1×binding buffer洗涤细胞沉淀一次，1500rmp 5min离心，收集细胞

5)1ml(根据细胞沉淀量决定加入染色缓冲液体积，使细胞悬液最终密度为1x10⁶-1 x10⁷cell/ml)1×staining buffer重悬细胞沉淀；

6)取细胞悬液100ul(1x 10⁵-1x 10⁶细胞)，加入5ul annexin V-APC染色，室温避光 10-15min；

7)转移至流式上机管中，上机检测。

11.细胞克隆形成检测

1)准备感染后细胞：将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化，完全培养基重悬，制成细胞悬液；

2)血球计数板对细胞悬液进行细胞计数；

3)细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种800个细胞/孔，每个实验组设3个复孔；

4)将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50 为止，中途每隔3day进行换液并观察细胞状态；

5)实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照；

6)实验终止时PBS洗涤细胞1次；

7)每孔加入1ml多聚甲醛，固定细胞30～60min；

8)PBS洗涤细胞1次；

9)每孔加入洁净、无杂质GIEMSA染液500μL，染细胞20min；

10)ddH2O洗细胞数次，直至洗净板上背景，晾干；

11)显微镜下拍照单克隆；

12)数码相机拍照整张板；

13)克隆计数。

12.MTT细胞增殖活力检测

1)将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；

2)将血球计数板擦拭干净；

3)将处于对数期细胞消化后，制成细胞悬液；

4)对细胞悬液计数；

5)根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(多数为2000cell/well)，每组5-6重复，共5 张96孔板，连续检测5天；

6)统一铺好后，待细胞完全沉淀下来后，在显微镜下观察各实验组的细胞密度，如果密度不均匀，则固定一组，微调其他组细胞的量，再次铺入96孔板中；

7)放进细胞培养箱中培养；

8)从铺板后第二天开始，培养终止前4h加入20μL5mg/mL的MTT(北京鼎国生物技术有限责任公司)于孔中4.1、4.3，无需换液；

9)4hours后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒4.4，加150μLDMSO 溶解甲瓒颗粒；

10)振荡器振荡5-10min，酶标仪(Biotek Elx800)490/5700nm检测OD值4.7；

11)对数据进行统计绘图。

13.活体内(in vivo)成瘤实验

雌性BALB/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验组和对照组各10支(4周龄)，所有实验均经江苏大学动物保护与利用委员会批准。

1)将处于对数生长期的各组成瘤细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；

2)用血球计数板对细胞进行计数，并最终用一定体积的PBS重悬，使细胞悬液的浓度为1～2×10⁷个细胞/ml；

3)用一次性注射器将一定量的细胞悬液注射到裸鼠右侧腋窝，注射的细胞量为2×10⁶个细胞；

4)注射后饲养裸鼠至肉眼可见瘤体；

5)自注射起2周后开始收集数据(称重和测量瘤体长短径)，隔天一次，自注射起第24天时处死裸鼠；

6)拍照(包括处死后裸鼠荷瘤的照片和瘤体照片)；

7)对数据进行统计绘图。

14.统计分析

统计软件为SPSS 19.0software(SPSS,Chicago,IL)。组间比较采用Student t检验。相关系数的计算基于线性模型，采用普通最小二乘回归法。双侧p<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.CHAF1A基因敲减及扩增效果

如图3所示，与转染空质粒的对照组相比，基因敲减(siRNA)使人胃癌细胞系MGC-803 和SGC-7901的CHAF1A基因mRNA及蛋白表达均显著下调。如图4所示，与转染空质粒的对照组相比，基因扩增使人胃癌细胞系MGC-803和SGC-7901的CHAF1A基因蛋白表达显著上调。

2.CHAF1A促进胃癌细胞增殖

Cellomics实时细胞生长实验显示(图5和6)，与对照相比，CHAF1A敲减显著减少人胃癌细胞MGC-803和SGC-7901的生长数量(P<0.05)。MTT实验显示(图7)，与对照相比，CHAF1A敲减显著降低MGC-803和SGC-7901细胞的增殖率(P<0.05)。与之相反，如图8所示，CHAF1A扩增显著提高MGC-803和SGC-7901细胞的增殖率(P<0.05)。上述结果表明，CHAF1A促进胃癌细胞增殖。

3.CHAF1A调节胃癌细胞的细胞周期进程及抑制凋亡

如图9所示，与对照相比，CHAF1A基因敲减显著增加MGC-803和SGC-7901的S期细胞百分比，而对G2/M期细胞百分比无显著影响，提示S期阻滞的增加(P<0.05)。如图 10所示，与对照相比，CHAF1A基因敲减显著增加MGC-803和SGC-7901细胞的凋亡率 (P<0.05)。与之相反，如图11和12所示，CHAF1A基因扩增显著减少S期细胞百分比、显著增加G2/M期细胞百分比(SGC-7901)及减少凋亡率(P<0.05)。

4.CHAF1A与胃癌组织中影响恶性表型的关键性基因的mRNA表达相关

如图13所示，利用TCGA中的胃癌组织mRNA表达数据，本研究发现，CHAF1A mRNA 表达水平与cyclin A2(编码基因为CCNA2)、Bcl-xl(BCL2L1)及Survivin(BIRC5) 的mRNA表达水平呈显著正相关(P<0.05)，而与p21(CDKN1A)的mRNA表达水平呈显著负相关(P<0.05)。如图14所示，利用本研究的34例胃癌mRNA测序数据，我们验证了CHAF1A mRNA表达水平与cyclin A2及Survivin的正相关关系(P＜0.05)，而其它未能够验证的结果可能是受限于小样本量。

5.CHAF1A促进胃癌细胞在活体(in vivo)的成瘤性

如图15所示，在活体(in vivo)内，CHAF1A敲减后与未敲减相比显著抑制胃癌细胞所形成肿瘤的生长速度，并且有更小的肿瘤体积(第24天时分别为254.36±109.20mm³vs.930.47±262.01mm³；P＜0.05)和重量(第24天时分别为0.17±0.06g vs.0.58±0.15g，respectively； P＜0.05)。

实施例2 CHAF1A影响胃癌细胞恶性表型的机制研究

一、方法

1、芯片样品总RNA质检

1.1基本信息

样品数量：6；样品类型：细胞

1.2实验信息

抽提试剂：Trizol法；

质检标准：Thermo NanoDrop 2000：1.7＜A260/A280＜2.2；Agilent 2100Bioanalyzer：RIN＞＝7.0and 28S/18S＞0.7

2、3′IVT反应：总RNA起始量范围：50-500ng

表6.RNA扩增程序

2.1poly-A RNA对照准备：将稀释好的poly-A RNA与总RNA混合，poly-A RNA作为整个操作流程的内部对照。

2.2一链cDNA合成：配制一链合成反应液，加入poly-A RNA/总RNA mix。使用“First-Strand cDNA Synthesis”程序孵育，合成cDNA。

2.3二链cDNA合成：配制二链合成反应液，加入一链合成产物。使用“Second-Strand cDNA Synthesis”程序孵育，合成双链的cDNA模板。

2.4IVT反应：配制IVT(体外反转)反应液，加入二链合成产物。使用“IVT”程序孵育，反转获得带生物素标签的aRNA

2.5amplified RNA(aRNA)纯化：用GeneChip 3’IVT Express Kit内的纯化试剂纯化aRNA。纯化的aRNA用nanodrop 2000测定浓度。

2.6aRNA片段化：配制aRNA片段化反应液，加入已纯化的aRNA。使用“Fragmentation” 程序孵育，获得片段化产物.

3.杂交

3.1配制杂交反应液。

3.2使用“Hybridization”程序加热杂交液。

3.3同时，向芯片注入130μl预杂交液，45℃杂交炉预杂交10min。

3.4吸去芯片的预杂交液，注入130μl杂交液。放于杂交炉中，45℃，60rpm杂交16小时。

3.5杂交完成后取出芯片，用GeneChip Fluidics Station 450仪器进行自动洗染。

3.6洗染完成后进行扫描，获得数据。

4.Western Blot

4.1细胞总蛋白抽提

1)从培养箱中取出细胞，弃去细胞培养液，PBS洗涤2次；

2)弃去PBS，加入适量预冷的1×Lysis Buffer(即蛋白电泳loading buffer)

3)用移液枪头吹打至细胞充分裂解，将细胞裂解样品转移入Ep管中，冰上再裂解细胞 10～15min；

4)4℃，12000g，离心5min，放入沸水中水浴10min；

5)4℃，12000g，离心1min，-80℃保存备用。

4.2SDS-PAGE

1)制胶：根据目的蛋白分子量大小配制不同浓度的胶；

3)电泳：恒压80V，2小时

4.3免疫印迹(湿转)

4.4免疫显色：

3)洗膜：TBST洗膜3次，每次10min；

5)洗膜：TBST洗膜3次，每次10min；

7)X光显影：在暗房中进行获得显示条带的胶片；加ECL、曝光、显影、定影的具体步骤如下：

a)将PVDF膜置于平铺好的保鲜膜上，以1：40的比例混合A液和B液，将混合液均匀滴加在PVDF膜上，避光反应5min；

b)将膜取出，稍微沥干多余的ECL底物反应液，放入暗盒，铺上保鲜膜，放上X光片，关上暗盒，曝光1-2min；

c)取出X光片，放入显影液中，约1min后取出，在清水中漂洗几秒钟，后放入定液中至少2min；

d)取出X光片，晾干，分析。

5.PathScan细胞内信号检测

使用Cell Signaling Technology(CST)公司的Antibody Array Kit，检测和比较待测定样本中信号通路关键信号分子的变化。

5.1细胞裂解(全部冰上操作)

1)配制1X细胞裂解缓冲液(货号Cell Signaling,#7018)，其中混合有PMSF或者蛋白酶抑制剂，终浓度为1mM

2)移除培养液后使用冰上预冷的1X PBS清洗1～2遍。

3)移除PBS，根据需要加入适当的裂解缓冲液，放置冰上2min后移至EP管中。

4)使用前用阵列稀释缓冲液调整浓度范围0.2-1.0mg/ml。

5.2Array检测

1)使用前将玻片放置于室温。

2)室温：将20X阵列清洗缓冲液配制成1X(1mL母液+19mL去离子水)

3)冰上操作：使用前将10X配制抗体检测混合液调整为1X(0.15mL 10X+1.35mL整列稀释缓冲液)

4)冰上操作：同前面一样，使用前将10X配制HRP-链接的链霉亲和素调整为1X(0.15mL10X+1.35mL整列稀释缓冲液)

5)安装检测装置：硅胶垫放置最下(粗面朝下)。

6)室温：每个孔加入100微升封闭液，室温摇床15min。

7)移除封闭液，每孔加入细胞裂解样品50-75微升。室温2h或者4℃过夜。

8)移除细胞裂解样品后使用1X阵列清洗液在水平摇床上清洗3遍，每次5min。

9)室温：加入75微升的1X抗体检测混合液，水平摇床孵育1h。

10)移除抗体检测混合液后使用1X阵列清洗液在水平摇床上清洗4遍，每次5min。

11)室温：加入75微升的1X HRP-链接的链霉亲和素，水平摇床孵育0.5h。

12)移除1X HRP-链接的链霉亲和素后使用1X阵列清洗液在水平摇床上清洗4遍，每次 5min。

13)拆解装置，将玻片浸入1X清洗液中。

14)曝光：配制曝光液(9mL去离子水+0.5mL LumiGlo+0.5mL Peroxide)。

15)化学发光成像系统(CLINX ChemiScope 5300)曝光1-2s。

6.统计分析

组间比较采用Student’s t检验。相关系数的计算基于线性模型，采用普通最小二乘回归法。双侧p<0.05为差异有统计学意义。上述分析的统计软件为SPSS 19.0software(SPSS, Chicago,IL)。在基因表达谱分析中，信号通路富集分析(pathway enrichmentanalysis)基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes，KEGG)和 BioCarta数据库。基因本体论(Gene Ontology，GO)分析采用基因集合富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)软件v3.0版。

二、结果

1、CHAF1A调控原癌/抑癌信号通路及胃癌细胞代谢

我们使用基因芯片研究CHAF1A敲减前后的基因表达谱变化。如图16，我们发现399个基因的表达水平在CHAF1A敲减前后显著改变。其中，293个基因上调，106个基因下调。

如图17，生信分析显示，与癌症生物学相关的显著改变的信号通路包括transcriptional misregulation in cancer,proteoglycans in cancer,the FoxOsignaling pathway,the P53signaling pathway,cytokine-cytokine receptorinteractions,pathways in cancer,等等。

如图18所示，通过Western blot，我们进一步检测了P53信号通路相关基因的蛋白表达水平，发现THBS1,CDKN1A,和IGFBP3在CHAF1A敲减后显著上调，而在肿瘤组织中，我们也发现CHAF1A与这些基因的mRNA表达水平显著负相关(P<0.05)。

此外，如图19和如图20，基于GSEA的GO分析显示，CHAF1A抑制与氧化磷酸化有关的细胞代谢功能，提示糖酵解代谢的增加，而这与P53通路被抑制后的代谢表型是一致的。

2、CHAF1A过表达调控胃癌细胞的压力应激与凋亡信号

为进一步研究CHAF1A促癌的作用机制，PathScan抗体试剂盒被用于检测CHAF1A过表达后的信号变化。如图21，我们发现，在MGC-803和SGC-7901细胞中，CHAF1A过表达显著活化HSP27，p38MAPK,NF-κB,Chk1和Survivin，并抑制Bad，在SGC-7901 细胞中还额外活化SAPK/JNK。

利用mRNA测序数据，我们也发现CHAF1A与Survivin，NF-κB(NFKB1)及Chk1(CHEK1)的mRNA表达水平显著正相关。这些结果提示CHAF1A促进压力应激的应答反应。

重要的是，这种应答反应能够诱导我们的基因表达谱分析所提示的与糖酵解有关的癌细胞能量代谢转换。利用上述结果及前述基因表达谱的结果，我们绘制了与CHAF1A相关的信号网络图，如图22所示。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 江苏大学附属医院

江苏省人民医院

<120> CHAF1A抑制剂在制备胃癌治疗药物中的用途

<130> 182546

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgactcaat tcctgtgtaa a 21

<210> 2

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccggccgact caattcctgt gtaaattcaa gagatttaca caggaattga gtcggttttt 60

g 61

<210> 3

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aattcaaaaa ccgactcaat tcctgtgtaa atctcttgaa tttacacagg aattgagtcg 60

g 61

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctatttccc atgattcctt cata 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtaatacggt tatccacgcg 20

<210> 6

<211> 1040

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagataattg gaattaattt gactgtaaac acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt 60

agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat tatgttttaa aatggactat 120

catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa 180

ggacgaaaca ccggccgact caattcctgt gtaaattcaa gagatttaca caggaattga 240

gtcggttttt gaattcggat ccattaggcg gccgcgtgga taaccgtatt accgccatgc 300

attagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 360

cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 420

ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 480

caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 540

ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 600

tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 660

accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 720

ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 780

cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt 840

gtacggtggg aggtctatat aagcagagct ggtttagtga accgtcagat ccgctagcgc 900

taccggacgc caccatgatg agcaagggcg agagctgttc accgggtgtg cccatcctgt 960

cgagctgacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 1020

gccacctacc gcatgctgaa 1040

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaggatcccc gggtaccggt cgccaccatg ctggaggagc tggagtgcgg ggcg 54

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tccttgtagt ccataccgga tgcacccagt gggctcgcgg tcag 44

<210> 9

<211> 3068

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttttttgtta gacgaagctt gggctgcagg tcgactctag aggatccccg ggtaccggtc 60

gccaccatgc tggaggagct ggagtgcggg gcgcccggcg ccaggggagc cgccacagcc 120

atggattgca aagatagacc agcttttcca gttaagaagt taatacaagc ccgtctgccg 180

tttaagcgcc tgaatcttgt cccaaagggg aaagccgatg acatgtcaga cgatcagggt 240

acttctgtgc aaagtaaaag ccccgattta gaggcctctt tggacacctt ggaaaacaac 300

tgtcatgtgg gttctgacat agactttaga ccgaaacttg tcaacgggaa gggtccctta 360

gataactttt taagaaatag aatcgaaacc agtattggcc agagcacagt catcattgat 420

ttgacagagg actcgaatga gcagccagac agtcttgtgg accacaataa actaaattct 480

gaagcctctc cctccaggga ggcaataaat ggccagcgag aagacactgg ggatcagcag 540

gggttgttga aggccattca gaacgacaag ttggcatttc ctggagagac cctttcagac 600

attccttgca aaacagagga ggagggtgtt ggctgtggag gtgcagggag gagaggcgac 660

tcccaggaat gttcgccacg gagctgcccg gagctgacga gtggcccgag aatgtgcccc 720

agaaaggagc aggacagttg gagtgaagct gggggcatcc tgttcaaagg gaaggtgcct 780

atggtggtct tgcaggacat cttggctgtg agaccaccgc aaatcaagtc ccttccagcc 840

acaccccaag gcaagaacat gacccctgag agtgaggtgc tggaatcttt ccccgaagaa 900

gactctgtac tcagccattc gtccctgagc tctccctctt ccaccagctc gcccgagggg 960

ccgcctgctc ccccaaagca gcacagcagt accagtccct tccccacctc cacgcccctc 1020

cgcagaataa ctaagaaatt cgtcaaaggc tctacagaga agaacaagct cagactgcaa 1080

agagatcagg agcgtctggg caagcagctc aagttacgtg cagaaaggga agaaaaggag 1140

aagctgaaag aggaggccaa gcgggccaag gaggaggcca agaagaagaa ggaggaagag 1200

aaggagctta aggaaaagga gaggcgggag aagcgggaga aggatgagaa ggagaaggcg 1260

gagaagcagc ggctcaagga ggagcggcgc aaggagagac aggaagccct ggaggctaaa 1320

cttgaggaaa aaaggaaaaa ggaagaagag aaacggttaa gagaagaaga gaagcgcatt 1380

aaagcagaga aggccgaaat cacgaggttc ttccagaaac caaagactcc acaggccccc 1440

aagaccctgg ccggctcctg tgggaagttt gccccctttg aaattaaaga gcacatggtc 1500

ctggcccctc ggcgtcggac cgctttccat ccagacctct gcagtcagct ggaccagctc 1560

ctccagcagc agagcggcga gttctccttc ttgaaagacc tcaaaggccg gcagcccctg 1620

aggtccggac ccacgcacgt ttccacccgg aatgcagata tttttaacag tgatgtcgtc 1680

atcgtggagc gtgggaaggg cgacggtgtt cccgagagga ggaagtttgg caggatgaag 1740

ctcctgcagt tctgtgagaa ccaccggcct gcctactggg gtacctggaa taagaagacg 1800

gcactcatcc gcgcgcgaga cccctgggcc caggacacga agctcctgga ctatgaggtg 1860

gacagtgatg aggagtggga agaagaggag cctggggagt ccctgtccca cagtgagggg 1920

gatgatgatg acgacatggg agaggatgaa gatgaggacg atggtttctt tgtgccccat 1980

gggtacctgt ctgaggacga aggtgtgaca gaggagtgtg ccgaccctga gaaccataag 2040

gtccgccaga aactgaaggc caaggagtgg gacgagttcc tggctaaggg gaagcgcttt 2100

cgcgtcctgc aacctgtgaa gatcggctgc gtgtgggcgg ctgacagaga ctgcgcaggc 2160

gatgacctga aggtactgca gcagttcgca gcctgcttcc tggagaccct gccggcccag 2220

gaggagcaga cgcccaaggc ctccaagcgg gagaggagag acgagcagat cctggcccag 2280

ctgctgccgc tcctgcacgg caatgtgaac gggagcaagg tcatcatccg ggagttccag 2340

gagcactgcc gccggggact gctcagcaac cacaccggca gcccgcggag cccctccacc 2400

acctacctgc acacccccac ccccagcgag gatgccgcca tcccctctaa gtcccggctc 2460

aagcggctca tttccgagaa ctcagtgtat gagaagcggc ctgacttcag gatgtgctgg 2520

tacgtgcacc cgcaggtgct acagagcttc cagcaggagc acctgcccgt gccgtgccag 2580

tggagctatg tgacatcggt gccctcggcc cccaaagagg acagtggcag cgtcccctcc 2640

acggggccca gccagggcac tcccatctcg ctgaagagga agtcagcggg cagcatgtgc 2700

atcacccaat tcatgaagaa gcgcaggcac gacggccaga ttggtgctga agacatggac 2760

ggcttccagg cagacacgga ggaggaggaa gaggaggagg gcgactgtat gatcgtggat 2820

gtcccggatg ctgcggaggt ccaagccccg tgtggagccg cttccggagc tgggggtggt 2880

gtgggggtgg acaccggcaa ggccaccctg accgcgagcc cactgggtgc atccggtatg 2940

gactacaagg atgacgatga caaggattac aaagacgacg atgataagga ctataaggat 3000

gatgacgaca aatgagctag ctgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc 3060

gtattacc 3068

Claims

1.CHAF1A抑制剂用于制备胃癌治疗药物的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胃癌治疗药物至少具有以下功用之一：减少胃癌细胞的生长数量；降低胃癌细胞的增值率；增加胃癌细胞的S期细胞百分比；增加胃癌细胞S期阻滞；增加胃癌细胞的凋亡率；抑制胃癌细胞所形成肿瘤的生长速度；减小胃癌细胞所形成肿瘤的体积；降低胃癌细胞所形成肿瘤的重量。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述CHAF1A抑制剂是指对CHAF1A具有抑制效果的分子，优选地，对CHAF1A具有抑制效果包括：抑制CHAF1A活性，或者抑制CHAF1A基因转录或表达。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述CHAF1A抑制剂选自siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述siRNA的靶序列或shRNA的靶序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，CHAF1A抑制剂为所述胃癌治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

7.一种胃癌治疗药物，包括有效剂量的CHAF1A抑制剂。

8.一种胃癌联合治疗药物组合，包括有效量的CHAF1A抑制剂和至少一种其他胃癌治疗药物。

9.CHAF1A抑制剂在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：减少胃癌细胞的生长数量；降低胃癌细胞的增值率；增加胃癌细胞的S期细胞百分比；增加胃癌细胞S期阻滞；增加胃癌细胞的凋亡率；抑制胃癌细胞所形成肿瘤的生长速度；减小胃癌细胞所形成肿瘤的体积；降低胃癌细胞所形成肿瘤的重量。

10.CHAF1A在制备和筛选胃癌治疗药物中的用途。

11.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，CHAF1A作为作用靶标。

12.一种筛选胃癌治疗药物的方法，包括步骤：将CHAF1A作为作用对象，对候选物质进行筛选，以找到CHAF1A抑制剂，作为潜在的胃癌治疗药物。