JPWO2014136161A1 - ジクチオピロン誘導体又はジヒドロジクチオピロン誘導体を有効成分とするオステオポンチン産生阻害剤 - Google Patents
ジクチオピロン誘導体又はジヒドロジクチオピロン誘導体を有効成分とするオステオポンチン産生阻害剤Info
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Abstract
Description
pGL-3ベクター basic (Promega)のマルチクローニング部位に、ヒトOPNプロモーター配列(−765から23)を組込んだレポーターベクターpOPN1-lucは、動物細胞にトランスフェクションするとルシフェラーゼを発現する。このpOPN1-lucを、ピューロマイシン耐性遺伝子(puromycin-N-acetyl-transferase gene)を発現するpPUR(Clontech)と共にヒト非小細胞肺癌由来細胞株A549にトランスフェクションし、ピューロマイシン添加培地にて増殖可能である、ルシフェラーゼを発現する細胞を選択した。選択された細胞をA549/OPNluc細胞と名づけ、後述するOPNプロモーター制御下におけるルシフェラーゼ発現阻害効果の観察に使用した。
A549/OPNluc細胞を10%牛胎児血清(FCS)及び1%ペニシリン・ストレプトマイシン(P/S)を添加したDMEM培地に3×104 cells/mLとなるよう懸濁させ、これを96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつ分注した。試験をトリプリケートで実施するので、対照群及び各濃度の被験化合物添加用として、それぞれ3ウェルずつ準備した。分注後、96ウェルプレートを炭酸ガス培養器(37℃, 5%CO2条件下)で24±4時間培養した。
細胞懸濁液を入れた各ウェルにDMSOのみ(対照)又は希釈した被験化合物(検体)の溶液を0.5μLずつ加えて200倍希釈し、ボルテックスミキサーで混和した後、炭酸ガス培養器(37℃, 5%CO2条件下)で48±4時間培養する工程まで、上述したWSTアッセイと同じ操作を行った。
非特許文献7の記載どおりに合成された5mgの (S)-3-dodecanoyl-5,6-dihydro-4,6-dimethyl- 1H-pyridin-2-one を 1mL のメタノールに溶解させた。1mg のパラジウム炭素(Pd 5%)を添加し、水素雰囲気下、室温にて2時間攪拌した。反応液を濾過してパラジウム炭素を除去し、その濾液を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル(4:1)で溶出させた画分より、化学式4に示される化合物を4mg得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) d 5.76 (1H, br.s), 3.52-3.64 (1H, m), 3.05 (1H, d, J = 11.2 Hz), 2.81 (1H, dt, J = 17.8, 7.5 Hz), 2.52 (1H, dt, J = 17.8, 7.4 Hz), 2.28-2.41 (1H, m), 1.87 (1H, dt, J = 13.0, 2.3 Hz), 1.52-1.68 (3H, m), 1.23-1.36 (16H, s), 1.17 (3H, d, J = 6.4 Hz), 0.94 (3H, d, J= 6.5 Hz), 0.88 (3H, t, J = 6.4 Hz).
EIMS m/z (rel. int) 309 [M]+ (11), 294 (5), 182 (10), 169 (13), 127 (100), 112 (55).
297mgの suberic acid monomethyl ester を8mLの塩化メチレンに溶解させ、250mgのメルドラム酸、453mg1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、及び19mgの4-(ジメチルアミノ)ピリジンを加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液に0.5M塩酸30mLを加え、30mLの酢酸エチルを用いて3回抽出した。抽出され酢酸エチル層を全て合わせて、60mLの水及び60mLの飽和食塩水によってそれぞれ洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、溶媒を減圧留去した。その残渣を5mLのトルエンに溶解させ、246mg の (2S,4S)-2,4-pentandiol を添加し、120℃で2時間攪拌した。室温に戻した後、反応液を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル(3:1)で溶出させた画分より200mgの 1-(1S,3S)-3-hydroxy-1-methylbutyl 10-methyl 3-oxodecanedioate を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) d 4.50-4.60 (1H, m), 3.67 (3H, s), 2.74 (1H, dt, J = 17.3, 7.4 Hz), 2.73 (1H, dt, J = 17.3, 7.4 Hz), 2.45(1H, ddq, J = 17.9, 11.6, 0.9 Hz), 2.31 (1H, dd, J = 17.9, 3.8 Hz), 2.30 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.01 (3H, d, J = 0.9 Hz), 1.58-1.68 (4H, m), 1.44 (3H, d, J = 6.4 Hz), 1.30-1.38 (4H, m).
EIMS m/z (rel. int) 296 [M]+ (6), 281 (10), 265 (11), 246 (14), 181 (20), 168 (83), 153 (100), 109 (30).
非特許文献7の記載どおりに合成された300mgの (S)-2-[1-Methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-isoindole-1,3-dione を6mLのメタノールに溶解させ、ヒドラジン一水和物1038mgを添加し、6時間加熱還流した。室温に戻した後、反応液に1M水酸化ナトリウム水溶液30mLを添加し、30mLの酢酸エチルによって3回抽出した。抽出された酢酸エチル層を全て合わせて、60mLの水、及び60mLの飽和食塩水でそれぞれ洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣を6mLのトルエンに溶解させ、565mgの 5-butanoyl-2,2-dimethyl-1,3-dioxane-4,6-dione を添加し、15時間加熱還流した。室温に戻し、反応液を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル(2:1)を用いて溶出させた画分より、140mgの (S)-N-[l-methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-3-oxohexanamide を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) d 5.45 (1H, br.s), 3.66-3.78 (1H, m), 2.71 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.31 (1H, dd, J= 17.6, 7.6 Hz), 2.23 (1H, dd, J = 17.6, 7.2 Hz), 1.93 (3H, s), 1.64 (2H, quint, J = 7.4 Hz), 1.24, (3H, d, J= 6.4 Hz), 0.94 (3H, t, J = 7.4 Hz).
EIMS m/z(rel. int) 195 [M]+ (19), 180 (100), 152 (54), 109 (22).
非特許文献7の記載どおりに合成された300mgの (S)-2-[1-Methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan- 2-yl)ethyl]-isoindole-1,3-dione を6mLのメタノールに溶解させ、ヒドラジン一水和物1038mgを添加して、6時間加熱還流させた。室温に戻した後、反応液に1M水酸化ナトリウム水溶液30mLを添加し、30mLの酢酸エチルによって3回抽出した。抽出された酢酸エチル層を全て合わせて、60mLの水、及び60mLの飽和食塩水でそれぞれ洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を減圧留去した。残渣を6mLのトルエンに溶解させ、564mgの 2,2-dimethyl-5-octanoyl-1,3-dioxane-4,6-dione を添加して、15時間加熱還流させた。室温に戻した後、反応液を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル(2:1)で溶出させた画分より、51mgの (S)-N-[l-methyl-2-(2-methyl-1,3-dioxan-2-yl)ethyl]-3-oxodecanamide を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) d 5.52 (1H, br.s), 3.65-3.78 (1H, m), 2.72 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.31 (1H, dd, J= 17.2, 5.6 Hz), 2.23 (1H, dd, J = 17.2, 7.2 Hz), 1.92 (3H, s), 1.60 (2H, quint, J = 7.6 Hz), 1.23-1.35 (8H, m), 1.24 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.87 (3H, t, J= 7.0 Hz).
EIMS m/z (rel. int) 251 [M]+ (33), 236 (57), 180 (100), 167 (69), 152 (76), 109 (23).
非特許文献7の記載どおりに合成された10mgの3-dodecanoyl-5,6-dihydro-4,6,6-trimethyl- 2H-pyran-2-one を1mLの酢酸エチルに溶解させ、1mgの20%水酸化パラジウム-炭素を添加し、水素雰囲気下、室温にて20時間攪拌した。反応液を濾過してパラジウム炭素を除去し、その濾液を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、ヘキサン-酢酸エチル(19:1)で溶出させた画分より、9mgの化学式14に示される化合物を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) d 3.13 (1H, d, J= 10.8 Hz), 2.87 (1H, dt, J = 14.8, 7.2 Hz), 2.59-2.67 (1H, m), 2.55 (1H, dt, J= 14.8, 6.8 Hz), 1.84 (1H, dd, J = 13.4, 4.0 Hz), 1.57-1.66 (2H, m), 1.51 (1H, t, J= 13.4 Hz), 1.43 (3H, s), 1.42 (3H, s), 1.25-1.31 (16H, m), 0.95 (3H, d, J = 6.4 Hz), 0.88 (3H, t, J = 6.6 Hz).
EIMS m/z (rel. int) 324 [M]+ (3), 309 (6), 84 (100).
上述したように、ジクチオピロン誘導体及びジヒドロジクチオピロン誘導体の中に、50%細胞増殖を抑制する濃度(IC50)の1/2以下の濃度で、OPNプロモーター制御下でのルシフェラーゼ発現を50%阻害する化合物が存在することが確認された。そこで、最もEC50濃度が低く、なおかつIC50濃度がEC50濃度の2倍以上を示した化学式3に示される化合物(化合物3)について、癌細胞由来細胞株から産生されるOPN量を実際に抑制できるか否かの確認試験を行った。
まず、A549細胞又はHepG2細胞を、それぞれ10%FCS、1%P/Sを添加したDMEM培地に4×104 cells/mLとなるよう懸濁させ、24ウェルプレートの各ウェルに500μLずつ分注した。試験はトリプリケートで実施するので、対照及び各濃度の被験化合物添加群は、それぞれ3ウェルずつ準備した。24ウェルプレートを炭酸ガス培養器(37℃, 5%CO2条件下)内で24±4時間培養した。
ELISA用試料を以下のように希釈した。
A549細胞(20倍希釈):試料5μL+培養培地95μL
HepG2細胞(80倍希釈):試料2μL+培養培地158μL
蛋白量測定用試料10μLと水90μLを混和し、10倍希釈した。検量線サンプルを、表3に示されるように、BSA溶液を水で希釈して調製した。
OPN量(培養上清1mL当たりの量)は、ELISA測定用の試料の全量(0.5mL)当たりに換算された。この換算値を、OPN量を求めた試料と同じウェルの蛋白測定用試料全量(0.2mL)中の蛋白量で除し、OPN量を細胞総蛋白1mg当たりに換算した。この蛋白1mg当たりのOPN量で、化合物3投与の影響を検討した。
OPN量の統計処理には、エクセル統計Statcel 3を用いた。エクセルファイル上にて、被験化合物である化合物3を添加された試料のOPN量を、対照のOPN量との比較でDunnett検定した。
OPNプロモーター制御下でのルシフェラーゼ発現を抑制する化合物3は、実際に蛋白としてのOPN産生を阻害することが、図1及び図2に示される実験結果から判明した。次の段階として、OPNが産生されたことにより細胞に生じる生理的な機能が、被験化合物である化合物3によって抑制されるか否かを確認した。確認方法の一つとして、細胞の創傷治癒試験(Wound-Healing assay)を行った。この試験は、細胞の遊走能を調べる方法として一般的に知られている方法である。単層培養した細胞をピペットの先などで部分的に細胞を剥がした際に、傷のまわりの細胞が移動(遊走)することで傷の部分を埋めていくが、培養液中に被験化合物を添加することより、この機能に影響を与えるかを観察した。
ヒト非小細胞肺癌由来細胞株A549を10%FCS、1%P/Sを添加したDMEM培地に3.5×105 cells/mLとなるよう懸濁させた。24ウェルプレートの各ウェルに、細胞懸濁液を500μL(1.75×105cells)ずつ分注した。試験はトリプリケートで実施するので、対照及び各濃度の被験化合物添加用として、それぞれ3ウェルずつ準備した。分注後、24ウェルプレートを炭酸ガス培養器(37℃, 5%CO2条件下)で24±4時間培養した。
創傷回復率(%) =100 - [創傷2日後の創傷面積/創傷直後の創傷部面積]×100
という計算式に基づいて、創傷回復率(%)を計算した。対照群及び2種類の濃度の化合物3投与群それぞれの創傷回復率(%)の平均値を算出した。また、対照群の創傷回復率に対する化合物処理群の創傷回復率(%)も算出した。
創傷回復率の算出値の統計処理は、エクセル統計Statcel 3を用い、エクセルファイル上ですべての化合物3投与処理群の創傷回復率を、対照との比較でDunnett検定を行うことにより実施された。
OPNが産生されたことにより細胞に生じる生理的な機能が、被験化合物によって抑制されるか否かを調べる2番目の試験として、マトリクス浸潤試験(Matrix-Invasion assay)を行った。この試験では、細胞外マトリクス成分であるコラーゲン又はラミニン(マトリゲル、BD Bioscience社)をコーティングした、φ8μmの細孔(ポア)を有する膜が底部に張ってあるカップ(インサート)と、そのインサートを挿入する24ウェルプレートを用意した。無血清培地に懸濁した細胞を内側のインサートに入れ、外側の24ウェルプレートの各ウェルに細胞の転移及び浸潤を誘引する物質(ここでは牛胎児血清)を加えた培地を注入し、インサートのマトリゲルをコーティングした膜を通過して外側のウェルに出てくる細胞数を観察した。
ヒト非小細胞肺癌由来細胞株A549を、10%FCS、1%P/Sを添加したDMEM培地に1.8×105 cells/mLとなるよう懸濁させた。その懸濁液を75cm2フラスコに10mL分注し、炭酸ガス培養器(37℃, 5%CO2条件下)で24±4時間培養した。同様に、検量線作成用にA549細胞の6×104cells/mLの懸濁液を調製し、その懸濁液を25cm2フラスコに5mL分注し、炭酸ガス培養器(37℃, 5%CO2条件下)で24±4時間培養した。この日を作業の0日目とした。
細胞をシードした75cm2フラスコから培地を除去した。培地を除去したフラスコに0.1%BSA及び1%P/S添加DMEM培地(無血清培地)を10mL分注し、細胞表面に一様に培地が被るようにフラスコを前後左右に傾けた。その後、フラスコから培地を除去した。
マトリゲル(10mg/mL:BD Biosciences)を氷上で融解させた。セルカルチャーインサート(24ウェル用, 8.0μmポア:BD Biosciences)及び無血清培地を氷冷しておいた。マトリゲルを氷冷した無血清培地で25倍希釈し、マトリゲル溶液を調製した。
25cm2フラスコで培養していたA549細胞の培地を除去し、無血清培地5mLに交換した。その後、25cm2フラスコを炭酸ガス培養器(37℃, 5%CO2条件下)で24±4時間培養した。
カルセインAM(50μg/バイアル:BD Biosciences)のバイアルを室温に戻し、DMSOを30μL添加して混和し、カルセインAM溶液を調製した。15mLチューブにCDSを5mL分注し、これにカルセインAM溶液を6μL添加して混和し、1×カルセインAM溶液(被験インサート用カルセインAM溶液)を調製した。一方、15mLチューブにCDSを1.5mL分注し、カルセインAM溶液を3.6μL添加して混和し、2×カルセインAM溶液(検量線用カルセインAM溶液)を調製した。
前日に培地交換した25cm2フラスコの細胞の培養上清を除去し、D-PBS(-)5mLを用いて、上述した洗浄操作を行った。さらに、CDS 3mLを用いて上述した細胞剥離を行った。その後、上述した細胞数カウントを行い、CDSを用いて5×105 cells/mLの細胞懸濁液を調製した。そして、表4に示されるように、細胞懸濁液をCDSを用いて希釈した。96ウェルブラックプレート(コーニング)の各ウェルに、バイアルA〜H内の細胞懸濁液を50μLずつ分注した。試験は、トリプリケートで行った。
新しい24ウェルプレートの各ウェルにD-PBS(-)を0.75mLずつ分注した。各インサートをピンセットで持ち上げながらインサート内の培地をピペットによって除去し、D-PBS(-)0.75mLを分注したウェルに挿入した。各インサートにD-PBS(-)を0.5mL分注し、インサートをD-PBS(-)によって洗浄した。
1時間のインキュベーションが終わった後、インサートの入った24ウェルプレートを、内部の液がこぼれないように注意しながら揺すって、液を混和した。その後、24ウェルプレートの各ウェルからピンセットを用いて各インサートを取り除いた。インサートを除いた各ウェルの液を、新しい96ウェルブラックプレートの各ウェルに100μLずつ3ウェルに移した(被験インサートの細胞用プレート)。
検量線用細胞の蛍光強度(RLU)をエクセルに入力し、最小二乗法により近似曲線(検量線)の数式を求めた。検量線の数式を用いて、96ウェルプレートの1ウェルあたりの蛍光強度から浸潤細胞数を算出した。その浸潤細胞数に3.5を乗じ、24ウェルプレートの1ウェル当たりの総浸潤細胞数を算出し、さらにトリプリケートで行っているので3ウェルの総浸潤細胞数の平均値を算出した。
統計処理は、エクセル統計Statcel 3を用いて、エクセルファイル上で、陽性対照及び化合物3処理群の総浸潤細胞数を、陰性対照(Control)値との比較でDunnett検定を行うことにより実施された。
スタチン系高コレステロール血症治療薬(具体例は、ロスバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチン又はメバスタチン)はHMG-CoA阻害剤であり、この酵素の阻害によりメバロン酸の低下を導き、それにともなうメバロン酸由来のイソプレノイド量の低下に起因するRasのようなG蛋白に影響をもたらし、OPN産生抑制効果を示すと考えられている(非特許文献8)。
A549/OPNluc細胞を10%FCS及び1%P/Sを添加したDMEM培地に3×104 cells/mLとなるよう懸濁させた。この懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつ分注し、96ウェルプレートを炭酸ガス培養器(37℃, 5%CO2条件下)で24±4時間培養した。
各サンプルの吸光値 ÷ Controlの吸光値 = Ratio to Control
WST アッセイの終わった各ウェルの上清を除き、D-PBS(-)を100μLずつそれぞれのウェルに分注した。Luciferase Assay Systems(Promega)に含まれるLuciferase Assay Substrate(LAS)を、Luciferase Assay Buffer(LAB)を用いて溶解し、ルシフェラーゼ試薬を調製した。さらに、5×CCLRを、水を用いて5倍希釈し、1×CCLRを調製した。
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