CN101313900B - 羟基脂肪酸寡聚物及其在调节细胞内钙离子浓度中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了羟基脂肪酸寡聚物及其在调节细胞生长和提高细胞内钙离子浓度中的用途。试验证明,本发明的羟基脂肪酸寡聚物可以抑制癌细胞的增殖,诱导细胞的凋亡和死亡;延长细胞的G1期,降低癌细胞的分裂程度。进一步的钙成像技术检测显示,本发明的寡聚物还可以刺激细胞内游离钙离子浓度的升高。
Description
技术领域
本发明涉及羟基脂肪酸寡聚物及其在调节细胞内钙离子浓度和调节细胞生长中的用途。
背景技术
钙离子生理功能概述
人的身体中,钙元素含量超过1000克,人体中的钙99%沉积在骨骼和牙齿中,促进其生长发育,维持其形态与硬度;剩下的只有不到10克存在于血液和软组织细胞中,恰恰是这少量的钙,在生命过程中起着至关重要的作用.19世纪末的英国心脏生理学家悉尼·林格(Sydney Ringer)在研究蛙心的收缩功能的实验中,意识到钙是一种能维持心脏功能的特殊因子,从此揭开了研究钙离子的序幕(Sydney,1884)。到了20世纪60年代,钙离子驱动肌肉收缩的机理也得以基本阐明。随着认识的不断深入,钙离子越来越多的功能被揭示。钙调蛋白的发现,使得钙离子被确认为是一种细胞信号传导的载体,钙信号在细胞功能控制中的关键地位也得以最终确立(Cheung,1980)。目前为止研究的比较多的钙离子的功能如下:作为调节细胞功能的信使,细胞外Ca2+是重要的第一信使,通过细胞膜上的钙通道(电压依赖性或受体门控性)或钙敏感体(CaSR)发挥重要调节作用。CaSR是G蛋白耦联受体超家族C家族的成员,它存在于各种细胞膜上,细胞外钙离子是其主要配体和激动剂,两者结合后,通过G蛋白激活磷脂酶C(PLC)-IP3通路及酪氨酸激酶-丝裂原蛋白激酶通路,引起肌浆网和内质网释放钙离子,以及细胞外钙离子经钙库操纵性钙流通内流,使细胞内钙离子增加。细胞内钙离子作为第二信使,例如:肌肉收缩的兴奋-收缩耦联因子,参与骨骼肌,心肌,平滑肌兴奋收缩。作为激素和神经递质的刺激-分泌耦联因子,对人体内分泌腺激素的分泌有决定性作用,对维持循环、呼吸、消化、泌尿、神经、内分泌、生殖等系统器官的功能至关重要(Petersen et al,1994)。此外它还是体温中枢调节点的主要调控介质等。此外,调节酶的活性,维持神经-肌肉兴奋性,对细胞的粘着、细胞膜功能的维持也有重要作用,钙离子参与血液凝固,参与免疫过程,钙离子呈弱碱性,有效补钙可以调节人体的酸碱平衡。最近发现在每个细胞外都会有一层由钙离子组成的波状物进行有节奏的振动,如果缺钙,振动就会减慢,细胞的寿命就会减少,人的寿命也就会缩短(Ernesto,2002)。
总之,钙是人体不可或缺的微量元素,它既是身体的构造者,又是身体的调节者,是我们人体的生命之源。细胞的活动几乎时时刻刻都离不开钙离子信号的调节,无论是精子与卵子的结合、胚胎发育的启动,还是体细胞的凋亡;无论是基因的表达、激素的分泌,还是记忆系统的构筑等,无不有钙信号参与其中。钙元素与细胞的关系之密切,可谓生死相依。钙就是一切(Cheng et al,2006)。
与有机分子不同,钙离子既不能被制造,也不能被降解,只能被束缚或转移。研究表明细胞在静止(非激活)状态时,细胞内钙离子浓度一般是大约100~200纳摩(1纳摩等于10-9摩尔),而细胞外液的钙离子浓度则在毫摩量级上(1毫摩等于10-3摩尔)。胞浆游离Ca2+浓度,不但远低于细胞外液,而且低于肌浆网和线粒体内的Ca2+浓度。随着细胞的活动,胞浆Ca2+浓度会发生变化,而这种变化正是调节机体多种生命过程的基础。例如,心肌细胞胞浆游离Ca2+浓度变化是心肌舒缩活动的基础。内分泌细胞的分泌活动也伴随有细胞内钙的变化。因此细胞溶质Ca2+通过多种途径处于极为严格的调节控制之中。胞质内游离钙来源有两条途径:细胞外Ca2+内流和细胞内钙库钙的释放。研究发现细胞膜含有3种跨膜钙转运系统:1.钙通道(Ca2+channel),分为三类即电压依赖性钙通道(VOCs)、受体门控性钙通道(ROCs)和储存开启性钙通道(SOCs)三个通道。2.Na+/Ca2+交换体(Na+/Ca2+exchanger)。3.钙泵(Ca2+pump,又称Ca2+-ATP酶)。细胞内钙库Ca2+转运系统:1.内质网钙释放通道又叫受体门控离子通道,内质网的钙释放通道包括两种类型:蓝尼定(ryanodine)受体门控离子通道和三磷酸肌醇(IP3)受体门控离子通道。2.肌浆网钙泵。3.肌浆网腔内钙结合蛋白(Bootman et al,2001)。可见生物体不仅有以“钙泵”为代表的钙离子转运蛋白,还有作为缓冲剂的钙结合蛋白,它们共同作用,维持正常细胞内外钙稳态。
正是由于钙离子在细胞的功能与代谢活动中发挥着关键性的调节作用,它不仅是细胞兴奋-收缩耦联中的重要因素,而且参与细胞内的信号转导、动作电位的形成和各种代谢活动.因此一旦钙稳态失衡可引起细胞功能障碍和代谢紊乱,甚至导致细胞死亡(Pierluigi et al,1990)。离子通道病(channelopathy)是指离子通道的结构或功能异常所引起的疾病,具体表现在编码离子通道亚单位的基因发生突变或表达异常,或体内出现针对通道的病理性内源性物质时,离子通道的功能发生不同程度的减弱或增强,导致机体整体生理功能紊乱,形成某些先天性或后天获得性疾病,主要累及神经、肌肉、心脏、肾脏等系统和器官(Hatta,2002)。钙离子通道广泛存在于机体的不同类型组织细胞中,参与神经、肌肉、分泌、生殖等系统的生理过程。已经发现的钙通道病有家族性偏瘫型偏头痛、低钾型周期性瘫痪、2-型发作性共济失调、6-型脊髓小脑共济失调、中央脊髓性肌病(central core disease ofmuscle)、恶性高热、Lambert-Eaton肌无力综合征(Nishimune,2004)、癫痫等。
钙离子载体说明
随着钙离子在心脏功能中的关键性作用愈趋明朗,人们开始试图将其应用于临床治疗.维拉帕米(Verapamil)是人类获得的第一种钙通道阻滞药物,证实其作用机理是通过降低流入心肌细胞的钙离子总量,来调节心脏的功能性活动(BN Singh et al,1978)。有时,我们需要激活胞内钙,升高胞内钙离子浓度来为我们服务,激活钙通道或转运钙离子的药物也受到了人们的关注,与阻断药物不同,这种药物增加胞内钙离子浓度,从而调节细胞相关功能性代谢。
离子载体(ionophore)是研究的较多的一种钙激动剂,它是疏水性的小分子,与Ca2+等离子形成脂溶性复合物,可溶于双脂层,提高所转运离子的通透率,多为微生物合成,离子载体也是以被动的运输方式运输离子,可分成可动离子载体(mobile ion carrier)和通道离子载体(channel former)两类:可动离子载体:载体型分为中性离子载体和具有羧酸的羧基离子载体二种。羧基离子载体本来是一端具有羧基的直链分子,但两端通过氢键而形成环状结构。在其内部包以一价或二价的阳离子。所以在膜内的离子(M+,M2+)-离子载体(I-)复合体作为M+I-或M2+I-而存在。作为羧基离子载体的A23187进行Ca2+的运输,可使膜对Ca2+的透性增高。通道离子载体:包括直链肽的短杆菌肽、多烯型抗生素的菲律宾菌素、制霉菌素、两性霉素B等。短杆菌肽A(granmicidin)形成长2.5-3nm的螺旋状的二分子结合体,在膜上形成直径0.4nm的穴,对H+有选择能力,离子透性与越膜电位无关。后者被认为与胆固醇形成复合体,多数集合起来形成管道,对离子的特异性小,与阳离子相比对阴离子的透性更大,且对水那样的中性分子也可透过,同时离子的透性与电位大小有关。这种通道并不稳定,不断形成和解体,其运输效率远高于可动离子载体。(杨宝峰,2005)
下面是一些示例性的激动剂:ionophore RO2-2985,CalciumIonophore X-537A,calcium ionophore A23187,离子霉素(Ionomycin),血管紧张素II,三磷酸肌醇(内释),蓝尼定(Ryanodine内释),乙酰胆碱(ACh),缓激肽BK(bradykinin),依马卡林(Emakalim)等。但是目前大部分只是在实验室阶段使用,况且价格昂贵(刘道明,2000)。
聚羟基脂肪酸酯及其寡聚体简要说明
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是微生物在生长不平衡的环境下积累的能源和碳源贮藏物(Doi&Steinbüichel,2002)。PHA优良的生物降解性和生物相容性使其成为最为引人瞩目的组织工程材料(Chen&Wu,2005)。组成PHA的单体多种多样,截至目前,已发现组成PHA的单体有100多种(Doi&Steinbüchel,2002)。3-羟基丁酸(3HB)是组成PHA的最常见的单体,也是动物体内酮体的基本成分之一。越来越多的证据表明,聚3-羟基丁酸(PHB,一种最为常见的PHA)不仅仅是某些细菌积累的贮藏物质,而且是广泛存在的、涉及许多重要生理功能的生物活性物质(Reusch,1995)。低分子量PHB和其他生物大分子的结合体存在于多种生物中(Reusch,1995)。
3HB的线状或环状寡聚物以及其其他衍生物可以提高体内的酮体水平从而起到营养或治疗的作用(Martin et al,1999)。Tasaki等发现二聚或三聚3HB可以作为受伤病人的能源底物(Tasaki et al,1999)。3HB单体可以作为钙离子内流促进剂,使胞内钙离子浓度上升,从而减少鼠成纤维细胞L929在高密度培养条件下的死亡率(Cheng et al,2006)。寡聚羟基脂肪酸及其衍生物有其特别的优点:1.本来是细胞膜上的一种成分,无毒,血液中存在,可以注射使用。2借助脂质体的靶向性,作用于目标。
发明内容
本发明一方面提供了寡聚羟基脂肪酸(Oligo hydroxyalkanoic acid或OHA),其结构通式如下:
其中:
中括号内为结构单元,各结构单元可以相同或不同;
n表示结构单元的总数,选自1~100的整数;
各结构单元的m独立地选自1~3的整数;
各结构单元的R1独立地选自由H、C1-C9的烷基、C1-C9的烷氧基和芳基构成的组;
R2选自由H、C1-C9的烷基、芳基和无毒金属离子构成的组。
根据本发明的一个优选实施方式,R2选自由H、C1-C5的烷基和无毒金属离子构成的组;更优选地,R2选自由H、C1-C3的烷基、Na+、K+和Ca2+构成的组。
根据本发明的一个优选实施方式,R1选自由H、C1-C5的烷基、C1-C5的烷氧基构成的组;更优选地,R1选自由H、C1-C3的烷基构成的组。
根据本发明的一个特别优选的实施方式,R1选自由H、C1-C2的烷基构成的组,R2选自由H、C1-C2的烷基、Na+和K+构成的组。
优选地,m为1或2,n为1~50的整数,并且当m=1时,R1不为甲基。通常,式(I)化合物的数均分子量不超过10000。
本发明另一方面提供了一种用于调节细胞内钙离子浓度的制剂,含有作为活性成分的式(I)化合物或其对映异构体。
所述制剂中还可以含有适当的载体或赋形剂,例如蒸馏水、矿物油、淀粉等,本领域技术人员可以根据具体情况确定。该制剂可用于提高细胞内钙离子浓度,例如成纤维细胞、食管癌细胞、心肌细胞、胰腺细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞、巨噬细胞等。
本发明再一方面提供了一种用于调节细胞生长的制剂,含有作为活性成分的权利要求1-10之任一项的化合物或其对映异构体。
优选地,所述制剂抑制细胞的增殖或者促进细胞凋亡。优选地,所述细胞为癌细胞。该制剂用于治疗癌症。
本发明又一方面提供了式(I)化合物或其对映异构体在制备用于调节细胞内钙离子浓度的制剂中的用途,在制备用于调节细胞生长的制剂中的用途,以及在制备用于治疗钙离子通道疾病的药物中的用途。所述钙离子通道疾病例如为心脏骤停或心力衰竭。
四甲基噻唑蓝(Thiazolyl blue或MTT)法检测证明本发明的寡聚物可以抑制癌细胞的增殖,并且呈浓度依赖型。低浓度(1~20mg/L)的寡聚物抑制效果不明显,高浓度(>40mg/L)寡聚物显著抑制癌细胞的增殖;细胞凋亡实验证明,寡聚物(40mg/L)能够诱导细胞的凋亡和死亡;流式细胞仪检测细胞周期显示,寡聚物(40mg/L)可以延长细胞的G1期,降低癌细胞的分裂程度。进一步的钙成像技术检测显示,寡聚物可以刺激细胞胞内游离钙离子浓度的升高,上述作用可能是通过提高胞内游离钙离子浓度实现的。
附图简要说明
图1a-图1b显示了OHB对鼠成纤维细胞L929生长的影响。图1a.24小时,图1b.48小时。*p<0.05OHB liposome vs Blank liposometreatment
图2a-图2b显示了OHB对食管癌细胞EC109生长的影响图2a.24小时,图2b.48小时。*p<0.05OHB liposome vs Blank liposometreatment
图3a-图3b显示了OHB对原代食管癌细胞生长的影响图3a.24小时,图3b.48小时。*p<0.05OHB liposome vs Blank liposometreatment
图4a-图4b显示了Omcl HA对食管癌细胞EC109生长的影响图4a.24小时,图4b.48小时。*p<0.05OmclHA liposome vs Blankliposome treatment
图5a-图5b显示了OHBHHx对食管癌细胞EC109生长的影响图5a.24小时,图5b.48小时.*p<0.05OHBHHxl iposome vs Blankliposome treatment
图6显示了OHB对鼠成纤维细胞L929细胞凋亡的影响。*p<0.05OHB liposome vs Blank liposome treatment
图7显示了OHBHHx对原代食管癌细胞细胞凋亡的影响。*p<0.05OHBHHx liposome vs Blank liposome treatment
图8显示了O3HB4HB对食管癌细胞EC109细胞凋亡的影响。*p<0.05O3HB4HB liposome vs Blank liposome treatment
图9显示了OHB对鼠成纤维细胞L929细胞周期的影响。*p<0.05OHB liposome vs Blankliposome treatment
图10显示了O3HB4HB对食管癌细胞EC109细胞周期的影响。*p<0.05O3HB4HB liposome vs Blank liposome treatment
图11显示了Omcl HA对原代食管癌细胞细胞周期的影响。*p<0.05Omcl HAliposome vs Blank liposome treatment
图12a-图12b显示了OHB刺激小鼠成纤维细胞L929胞内游离钙离子荧光强度变化。图12a.细胞外液中有/无钙离子条件下刺激细胞胞内游离钙离子变化。图12b.添加不同钙离子阻断剂的对比。
图13a-图13b显示了OHBHHx刺激小鼠成纤维细胞L929胞内游离钙离子荧光强度变化。图13a.细胞外液中添加钙离子螯合剂与不加钙离子螯合剂条件的对比。图13b.添加加钙离子阻断剂的对比。
图14显示了O3HB4HB刺激大鼠原代心肌细胞胞内游离钙离子荧光强度变化。
图15显示了OmclHA刺激大鼠原代心肌细胞胞内游离钙离子荧光强度变化。
具体实施方式
本文所用的术语“Mn”是指数均分子量(number-average molecularweight)。
术语“OHA”是指寡聚羟基脂肪酸,或称羟基脂肪酸寡聚物,可以是由一种单体构成的均聚物,也可以是由两种或多种单体构成的共聚物。
本发明所指的羟基脂肪酸单体(hydroxyalkanoic acid或HA)可以是单一立体结构的化合物,如R、S型,也可以是R、S的混合物或者外消旋物。寡聚羟基脂肪酸OHA包括寡聚的3-羟基丁酸(Oligohydroxybutyrate或OHB)、3-羟基戊酸(Oligo hydroxyvalerate或OHV)、3-羟基己酸(Oligo hydroxyhexanoate或OHHx)、3-羟基庚酸(Oligohyd roxyHeptanoate或OHHp)、3-羟基辛酸(Oligohydroxyoctanoate或OHO)、3-羟基癸酸(Oligo hydroxydecanoate或OHD)、4-羟基丁酸(Oligo(4-hydroxybutyrate)或O-4HB)、4-羟基戊酸(Oligo(4-hydroxyvalerate)或O-4HV)等的均聚物或共聚寡聚物,也包括上述寡聚物的混合物。比如寡聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯(Oligo(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)或O3HB4HB),寡聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚酯(Oligo(hydroxybutyrate-co-hydroxyhexanoate)或OHBHHx),寡聚中长链脂肪酸共聚酯(Oligomedium chain length hydroxyalkanoate或OmclHA)等。
本发明所述细胞包括成纤维细胞、食管癌细胞、心肌细胞、胰腺β细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞、巨噬细胞等。本发明化合物可以提高所述细胞胞内的游离钙离子浓度,从而促进癌细胞的凋亡与坏死,神经突触的形成,激素的分泌等。
本发明所述的寡聚体可以通过高聚物的水解或酶解获得,也可以化学合成获得。以脂质体包裹寡聚物可以提高寡聚物转入细胞的效率,增大寡聚物的有效浓度。
为了更加详细地解释本发明,下面将结合附图给出本发明的实施例。这些实施例仅仅是出于解释和说明的目的,不应该被理解为是对本发明范围的限制。
实施例13-羟基丁酸寡聚体(OHB)的制备
准确称取3g聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸(P3HB4HB),加入二氯甲烷200ml,于90℃回流。待PHB全部溶解后,加入对甲苯磺酸0.3g,水0.5g,继续回流反应1小时后,补加水0.5g。2小时后终止反应,过滤,以冷甲醇沉淀,过滤,索氏提取器抽提12小时后于50℃真空条件下干燥48小时备用。经凝胶渗透色谱(GPC,Waters1515)检测数均分子量(number-average molecular weight或Mn)为2000,核磁共振波谱(NMR,Bruker400)分析产物不含烯键等细胞毒害物质。
实施例2寡聚3-羟基丁酸甲酯(OHB-CH3)的制备
取1g PHB溶于50mL三氯甲烷,在60℃加热回流2h充分溶解,滴加50mL浓硫酸甲醇溶液(10%v/v),90℃加热回流2h。加入50mL4℃预冷的甲醇,静置1h,将混合溶液在8000rpm、4℃条件下离心20min,弃上清,加入甲醇重悬。重复上述步骤2次,50℃真空条件下干燥48小时备用,得到含有OHB-OCH3固体的白色粉末。经凝胶渗透色谱(GPC,Waters1515)检测Mn为2000,核磁共振波谱(NMR,Bruker400)分析产物不含烯键等细胞毒害物质.
实施例3寡聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸甲酯(O3HB4HB-CH
3
)的制备
取1gP3HB4HB溶于50mL三氯甲烷,在60℃加热回流2h充分溶解,滴加50mL浓硫酸甲醇溶液(10%v/v),90℃加热回流2h。加入50mL4℃预冷的甲醇,静置1h,将混合溶液在8000rpm、4℃条件下离心20min,弃上清,加入甲醇重悬。重复上述步骤2次,50℃真空条件下干燥48小时备用,得到含有OHB-OCH3固体的白色粉末。经凝胶渗透色谱(GPC,Waters1515)检测Mn为2100,核磁共振波谱(NMR,Bruker400)分析产物不含烯键等细胞毒害物质。
实施例4寡聚3-羟基丁酸3-羟基己酸甲酯(OHBHHx-CH
3
)的制备
取1g PHBHHx溶于50mL三氯甲烷,在60℃加热回流2h充分溶解,滴加50mL浓硫酸甲醇溶液(10%v/v),90℃加热回流2h。加入50mL4℃预冷的甲醇,静置1h,将混合溶液在8000rpm、4℃条件下离心20min,弃上清,加入甲醇重悬。重复上述步骤2次,50oC真空条件下干燥48小时备用,得到含有OHB-OCH3固体的白色粉末。经凝胶渗透色谱(GPC,Waters1515)检测Mn为2800,核磁共振波谱(NMR,Bruker400)分析产物不含烯键等细胞毒害物质。
实施例5寡聚中长链羟基脂肪酸甲酯(OmclHA-CH
3
)的制备
1.5g mclPHA纯品溶于37.5ml氯仿,70℃搅拌条件下冷凝回流30min,缓慢滴加15ml甲醇(5%体积的浓硫酸),100℃高速搅拌冷凝回流10h。冷却致室温,加15ml水振荡均匀,旋转蒸发有机溶剂氯仿,甲醇,加15ml氯仿剧烈振荡,静置分层12h,取下相。对于上相加5ml氯仿重新萃取一次。2g无水硫酸镁加入到收集的有机相中,剧烈搅拌3h,稍加热后布氏漏斗抽滤。旋转蒸发除去大部分有机溶剂,将样品oligo mclPHA甲酯60℃真空干燥。得到含有OmclHA-CH3的油状液体。经凝胶渗透色谱(GPC,Waters1515)检测Mn为2300,核磁共振波谱(NMR,Bruker400)分析产物不含烯键等细胞毒害物质。
实施例6一系列寡聚体甲酯表征
分子量使用凝胶渗透色谱法(Gel-permeation chromatography,GPC)测定。在40℃下,使用配备有A2414微分折光率检测器和紫外检测器的water1515高效液相色谱仪测定样品的分子量和分子量分布。使用色谱纯的氯仿为洗脱液,流速为1ml/min。将待测样品以2.0mg/ml的浓度溶解在氯仿中,进样量为50μl。标准曲线根据窄分布聚苯乙烯标样制定.通过分子量的测定我们可以确认我们甲醇解的产物为寡聚体。
1H-NMR在Bruker AV400NMR核磁共振仪上于室温下分析溶于氘代氯仿(CDCl3)(20mg/mL)中的聚合物的结构。400MHz1H-NMR谱图获得条件:4μs的脉冲宽度,27777.8Hz的峰宽,32000个数据点,2048个聚点。首先我们把制备的寡聚体的核磁波谱图与高聚物PHA对比,在波谱图上发现出现新的位移位点就是-OCH3,根据端基OCH3和重复单元中CH2核磁波谱图中峰积分面积比值我门可以计算出寡聚体的聚合度n(前面结构式中出现的n)。结合渗透凝胶色谱测定分子量我们就可以判定此为我们预期的寡聚体甲酯衍生物。此外在核磁共振波谱图中PPM为6.0和7.1处分别表示烯键碳原子上的氢原子,在我们得到的波谱图中没有发现这两个峰,判定我们制备的寡聚体中没有出现烯键对细胞有毒害的产物。
实施例7OHA脂质体的制备
称取0.10g卵磷脂,0.05g胆固醇,溶于20ml氯仿,充分溶解混匀,缓慢加入0.002g氯仿溶解的OHA(任何一种),旋转蒸发仪挥发氯仿,使混合物成膜贴附在圆底烧瓶内壁上,真空干燥48小时驱除干净氯仿.加15ml4℃存放的N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙基磺酸缓冲液(即HEPES,pH=7.2)水化30分钟,将膜充分振荡下来,补充5ml PBS.冰浴条件下超声处理20℃15min100%功率,间歇15min,重复两次,获得脂质体悬液。测pH调整到7.2,10000g离心,过滤除菌。脂质体中OHA含量由气相色谱测定。
样品处理:将一干净离心管计重,取脂质体溶液于管中,冰冻干燥程粉末,计算前后重量差,计算出脂质体寡聚体总重.将粉末置于酯化管中,加入2ml酯化液,2ml氯仿,加盖密闭,100℃烘箱酯化4h,冷却致室温,加入1ml蒸馏水,充分振荡混匀,静置分层,取下层氯仿相GC分析。
标样处理:准确称量10mg左右系列剃度(最少5个梯度)标准物质,于酯化管中加入2ml酯化液,2ml氯仿,加盖密闭,100℃烘箱酯化4h,冷却致室温,加入1ml蒸馏水,充分振荡混匀,静置分层,取下层氯仿相GC分析。
酯化液组成:浓硫酸(98%)与甲醇3:97体积混合,含有1g/L癸二酸内标。
依照Agilent公司GC Agilent6820气相色谱仪的说明书操作气相色谱仪。设定柱头温度为140℃,进样器温度为200℃,检测器温度为220℃,柱头压力为0.25Mpa程序升温条件为:80℃维持1.5分钟,以30℃/min的速度升温至140℃,并在此温度保持2分钟,以5℃/min的速度升温至175℃,在此温度保持3分钟。样品的进样量为1μl,进样使用上海安亭微量进样器厂生产的微量进样器。
处理标准样,以质量对峰面积做标准曲线,作出拟合方程,将样品峰面积带入曲线,分别求出每个样品中每种单体的质量,从而计算出寡聚体质量(每个寡聚甲酯上端基OCH3忽略不计)。将计算出的脂质体质量除以做酯化反应的样品总重(脂质体寡聚体总重)即可计算出脂质体中OHA含量。
实施例8原代食道癌细胞的分离及培养
取新鲜食管癌组织切块(鳞癌,汕头大学肿瘤医院)约5g,置于DMEM培养液(Dulbcco′s Modifed Eagle Medium)带回。PBS缓冲液漂洗三次至组织块变白。剪碎成2-3mm3的小块。加入0.25%胰酶溶液5ml,消化10min。轻轻磨碎,以完全培养液冲洗,300目筛网过滤。显微镜下观察细胞大小差异大,细胞核大,呈现典型的癌细胞特征。取滤液加至细胞培养瓶,于37℃、5%CO2条件下在含10%FBS的DMEM培养基中培养,至细胞生长至70%密度时传代培养。
实施例9大鼠原代心肌细胞的分离及培养
取1-3天龄的SD大鼠,在无菌条件下开胸取出心脏,立即置入4℃PBS液(磷酸缓冲液)中剪取心室肌,用移液管反复吹打充分洗净残血,换新PBS液,剪成约1mm3大小的碎块,轻轻吹打后弃去PBS液,然后碎块小心吸入25ml无菌三角瓶中,加入0.1%胰蛋白酶8ml左右,用盐水瓶胶塞盖紧瓶口,置室温在磁力搅拌器上搅拌消化10min,再弃去首次的消化悬液(主要含血细胞),加入0.1%胰蛋白酶消化液消化10min,如此重复,直至组织块消失。分别收集每次消化悬液,加等量含5%胎牛血清DMEM培养液终止消化,离心(1000rpm/min,10min),弃上清,再加入含5%胎牛血清DMEM培养液,用吸管轻轻吹散沉淀细胞,同条件下再次离心,将每次离心后沉淀细胞合并,用含10%胎牛血清DMEM培养液制成细胞悬液,通过300目网筛滤过,接种于玻璃培养瓶,置37℃,5%CO2培养箱内,根据心肌细胞相对成纤维细胞贴壁慢,采用差速贴壁1h,在培养液中获得心肌细胞,细胞计数并调整好细胞浓度,接种于6孔培养板(已经提前加入了无菌的细胞培养爬片)中,置37℃,5%CO2培养箱内。培养前48h,在心肌细胞的培养液中,加入Brdu0.1mmol/L,以抑制成纤维细胞的增殖。在倒置相差显微镜下动态观察细胞生长情况并摄像记录。
实施例10MTT(噻唑兰)法检测OHB对小鼠成纤维细胞L929增殖
的影响
生长状况良好的L929细胞(购于中国预防医学科学院)用胰酶消化液处理2分钟,吸除消化液,加入新鲜培养液制成单细胞悬液,血球计数板检测细胞数量,接种于96孔板中(5×103个细胞/孔),37℃,5%CO2细胞贴壁培养24小时后去掉培养液,PBS(磷酸盐缓冲液,pH7.2)润洗2遍,更换新鲜培养液,并加入含一系列浓度梯度(OHB终浓度为5、20、40、60mg/L)过滤灭菌的OHB脂质体(Mn=2000,磷脂浓度为2g/L),每一浓度做6个平行孔;实验设置空白对照孔和相同磷脂浓度的空白脂质体孔。继续培养24小时和48小时后,检测细胞活性。每孔加入MTT(5.0g/L)10μl,37℃温育4小时,弃上清,加入DMSO(二甲基亚砜)100μl,振荡数分钟,30分钟内在全自动酶标仪上读取570nm处吸光值,并计算实验孔和空白对照孔的比值。
40、60mg/L的OHB处理鼠成纤维细胞L92924小时后,细胞活力分别为空白孔的99.2±7.2%、105.5±9.3%,而相同磷脂浓度的空白脂质体处理后细胞活力分别为对照孔的141.9±3.4%、145.8±12.3%,二者相比差异显著(P<0.05)。40、60mg/L的OHB脂质体处理鼠成纤维细胞L92948小时后,细胞活力分别为空白孔的109.5±16.0%、124.8±9.2%,而相同磷脂浓度的空白脂质体处理后细胞活力分别为对照孔的160.4±12.3%、183.2±22.2%,二者相比差异显著(P<0.05)(图1)。本实验说明了OHB能够抑制成纤维细胞增殖。
实施例11MTT法检测OHB对食管癌细胞系EC109增殖的影响
生长状况良好的EC109细胞(购于中国预防医学科学院)用胰酶消化液处理2分钟,吸除消化液,加入新鲜培养液制成单细胞悬液,血球计数板检测细胞数量,接种于96孔板中(5×103个细胞/孔),37℃,5%CO2细胞贴壁培养24小时后去掉培养液,PBS(磷酸盐缓冲液,pH7.2)润洗2遍,更换新鲜培养液,并加入含一系列浓度梯度(OHB终浓度为5、20、40、60mg/L)过滤灭菌的OHB脂质体(Mn=2000,磷脂浓度为2g/L),每一浓度做6个平行孔;实验设置空白孔和相同磷脂浓度的空白脂质体对照孔。继续培养24小时和48小时后,检测细胞活性。每孔加入MTT(5.0g/L)10μl,37℃温育4小时,弃上清,加入DMSO100μl,振荡数分钟,30分钟内在全自动酶标仪上读取570nm处吸光值,并计算实验孔和空白对照孔的比值。
40、60mg/L的OHB脂质体处理食管癌细胞系EC10924小时后,细胞活力分别为空白孔的100.5±12.0%、113.4±5.9%,而相同浓度的空白脂质体处理后细胞活力分别为对照孔的129.2±7.6%、135.2±5.8%,二者相比差异显著(P<0.05)。20、60mg/L的OHB脂质体处理食管癌细胞系EC10948小时后,细胞活力分别为空白孔的101.5±8.3%、122.2±15.3%,而相同磷脂浓度的空白脂质体处理后细胞活力分别为对照孔的139.3±11.5%、157.8±5.8%,二者相比差异显著(P<0.05)(图2)。本实验说明了OHB能够抑制食管癌细胞增殖。
实施例12MTT法检测OHB对原代食管癌细胞增殖的影响
生长状况良好的原代食管癌细胞(传至第三代)用胰酶消化液处理2分钟,吸除消化液,加入新鲜培养液制成单细胞悬液,血球计数板检测细胞数量,接种于96孔板中(5×103个细胞/孔),37℃,5%CO2细胞贴壁培养24小时后去掉培养液,PBS(磷酸盐缓冲液,pH7.2)润洗2遍,更换新鲜培养液,并加入含一系列浓度梯度(OHB终浓度为5、20、40、60mg/L)过滤灭菌的OHB脂质体(Mn=2000,磷脂浓度为2g/L),每一浓度做6个平行孔;实验设置空白孔和相同磷脂浓度的空白脂质体对照孔。继续培养24小时和48小时后,检测细胞活性。每孔加入MTT(5.0g/L)10μl,37℃温育4小时,弃上清,加入DMSO100μl,振荡数分钟,30分钟内在全自动酶标仪上读取570nm处吸光值,并计算实验孔和空白对照孔的比值。
20-60mg/L的OHB脂质体处理食管癌细胞24小时后,细胞活力分别为空白孔的78.2±6.7%、100.3±1.8%、123.6±2.5%而相同磷脂浓度的空白脂质体处理后细胞活力分别为对照孔的125.8±5.7%、168.7±3.7%、192.0±5.4%,二者相比差异显著(P<0.05)。20-60mg/L的OHB脂质体处理食管癌细胞48小时后,细胞活力分别为空白孔的90.8±3.6%、135.6±9.2%、145.0±2.4%,而相同磷脂浓度的空白脂质体处理后细胞活力分别为对照孔的150.1±3.6%、175.4±9.2%、220.36±2.4%,二者相比差异显著(P<0.05)(图3)。本实验说明了OHB能够抑制食管癌细胞增殖。
实施例13MTT法检测OHBHHx对食管癌细胞系EC109殖的影响
生长状况良好的EC109细胞(购于中国预防医学科学院)用胰酶消化液处理2分钟,吸除消化液,加入新鲜培养液制成单细胞悬液,血球计数板检测细胞数量,接种于96孔板中(5×103个细胞/孔),37℃,5%CO2细胞贴壁培养24小时后去掉培养液,PBS(磷酸盐缓冲液,pH7.2)润洗2遍,更换新鲜培养液,并加入含一系列浓度梯度(OHBHHx终浓度为5、20、40、60mg/L)过滤灭菌的OHBHHx脂质体(Mn=2800,含12mol%3-羟基己酸,磷脂浓度为2g/L),每一浓度做6个平行孔;实验设置空白孔和相同磷脂浓度的空白脂质体对照孔。继续培养24小时和48小时后,检测细胞活性。每孔加入MTT(5.0g/L)10μl,37℃温育4小时,弃上清,加入DMSO100μl,振荡数分钟,30分钟内在全自动酶标仪上读取570nm处吸光值,并计算实验孔和空白对照孔的比值。
40、60mg/L的OHBHHx脂质体处理食管癌细胞系EC10924小时后,细胞活力分别为空白孔的103.8±8.1%、101.7±7.2%,而相同磷脂浓度的空白脂质体处理后细胞活力分别为对照孔的128.7±5.8%、145.8±6.3%,二者相比差异显著(P<0.05)。20、60mg/L的OHBHHx脂质体处理食管癌细胞系EC10948小时后,细胞活力分别为空白孔的129.2±7.6%、135.2±5.8%,而相同磷脂浓度的空白脂质体处理后细胞活力分别为对照孔的139.3±11.5%、157.8±5.8%,二者相比差异显著(P<0.05)(图4)。本实验说明了OHBHHx能够抑制食管癌细胞增殖。
实施例14MTT法检测OmclHA对食管癌细胞系EC109增殖的影响
生长状况良好的EC109细胞用胰酶消化液处理2分钟,吸除消化液,加入新鲜培养液制成单细胞悬液,血球计数板检测细胞数量,接种于96孔板中(5×103个细胞/孔),37℃,5%CO2细胞贴壁培养24小时后去掉培养液,PBS(磷酸盐缓冲液,pH7.2)润洗2遍,更换新鲜培养液,并加入含一系列浓度梯度(OmclHA终浓度为5、20、40、60mg/L)过滤灭菌的OmclHA脂质体(Mn=2300,含有1.6mol%3-羟基己酸,24.6mol%3-羟基辛酸,71.2mol%3-羟基癸酸和2.6mol%3-羟基十二酸,磷脂浓度为2g/L),每一浓度做6个平行孔;实验设置空白孔和相同磷脂浓度的空白脂质体对照孔.继续培养24小时和48小时后,检测细胞活性。每孔加入MTT(5.0g/L)10μl,37℃温育4小时,弃上清,加入DMSO100μl,振荡数分钟,30分钟内在全自动酶标仪上读取570nm处吸光值,并计算实验孔和空白对照孔的比值。
40、60mg/L的OmclHA处理食管癌细胞系EC10924小时后,细胞活力分别为空白孔的105.6±10.5%和115.0±8.9%,而相同磷脂浓度的空白脂质体处理后细胞活力分别为对照孔的128.7±5.8%、145.8±6.3%,二者相比差异显著(P<0.05)。OmclHA脂质体处理食管癌细胞系EC10948小时后,和相同磷脂浓度的空白脂质体处理无统计学差异(图5)。
实施例15Annexin V-FITC检测OHB对小鼠成纤维细胞L929细胞凋
亡的影响
0.25%胰酶溶液消化细胞,调节待测细胞的浓度为5×105-1×106个/ml。取1ml细胞,1000rpm,4℃离心10分钟,弃上清。加入1ml冷的PBS,轻轻震荡使细胞悬浮离心,重复两次。将细胞重悬于200μlBinding Buffer。加入10μl Annexin V-FITC和5μlPI(北京宝赛试剂),轻轻混匀,避光室温反应15分钟。加入300μlBinding Buffer,在1小时内上机(Beckman Coulter Epics XL流式细胞仪)检测。结果显示,成纤维细胞经过40mg/L的OHB(Mn=2000,磷脂浓度为2g/L)处理24h和48h后,凋亡率分别较空白处理组高1.2%和1.9%,死亡率分别增加了8.42%和8.67%,具有统计学差异(图6)。说明OHB促进了细胞的凋亡和死亡。
实施例16Annexin V-FITC检测OHBHHx对原代食管癌细胞凋亡的
影响
0.25%胰酶溶液消化细胞,调节待测细胞的浓度为5×105-1×106个/ml。取1ml细胞,1000rpm,4℃离心10分钟,弃上清。加入1ml冷的PBS,轻轻震荡使细胞悬浮离心,重复两次。将细胞重悬于200μlBinding Buffer。加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI(北京宝赛试剂),轻轻混匀,避光室温反应15分钟。加入300μlBinding Buffer,在1小时内上机(Beckman Coulter Epics XL流式细胞仪)检测。结果显示,原代食管癌细胞(传至第三代)经过40mg/L的OHBHHx(Mn=2800,含12mol%3-羟基己酸,磷脂浓度为2g/L)处理24h和48h后,凋亡率分别较空白处理组高4.3%和1.7%,死亡率分别增加了8.5%和10.5%,具有统计学差异(图7)。说明OHBHHx促进了细胞的凋亡和死亡。
实施例17Annexin V-FITC检测O3HB4HB对人原代食管癌细胞
EC109细胞凋亡的影响
0.25%胰酶溶液消化细胞,调节待测细胞的浓度为5×105-1×106个/ml。取1ml细胞,1000rpm,4℃离心10分钟,弃上清。加入1ml冷的PBS,轻轻震荡使细胞悬浮离心,重复两次。将细胞重悬于200μlBinding Buffer。加入10μlAnnexin V-FITC和5μlPI(北京宝赛试剂),轻轻混匀,避光室温反应15分钟。加入300μlBinding Buffer,在1小时内上机检测。结果显示,成纤维细胞经过40mg/L的O3HB4HB(Mn=2100,含有7mol%4-羟基丁酸,磷脂浓度为2g/L)处理后24h和48h后,凋亡率分别较空白处理组高3.1%和2.5%,死亡率分别增加了6.0%和6.5%,具有统计学差异(图8)。说明O3HB4HB促进了细胞的凋亡和死亡。
实施例18流式细胞术检测OHB对小鼠成纤维细胞L929细胞周期的
影响
胰酶消化细胞,1ml培养液吹匀,1000rpm离心10分钟;弃去上清,PBS清洗2次,0.5ml PBS吹匀;5ml注射器将细胞吸起并吹入5ml70%预冷的乙醇中,4℃固定过夜;1000rpm离心10分钟收集固定细胞,PBS清洗2次;0.5ml PBS重悬细胞并轻轻吹匀(防止细胞破碎);加入1.5μl RNase A至终浓度为10μg/ml,37℃消化30分钟;加入0.25ml PI溶液至终浓度为10μg/ml,冰浴中避光染色30分钟;上机(Beckman Coulter Epics XL流式细胞仪)检测,通过软件分析流式细胞仪收集到的细胞群体。结果显示,成纤维细胞经过40mg/L的OHB(Mn=2000,磷脂浓度为2g几)处理24h和48h后,G0/G1期细胞数分别比空白脂质体处理组增加了10.1%和12.0%,具有统计学差异(图9),说明了OHB抑制成纤维细胞增殖的部分原因是延长了细胞的G1期所致。
实施例19流式细胞术检测O3HB4HB对食管癌细胞系EC109细胞周
期的影响
胰酶消化细胞,1ml培养液吹匀,1000rpm离心10分钟;弃去上清,PBS清洗2次,0.5ml PBS吹匀;5ml注射器将细胞吸起并吹入5ml70%预冷的乙醇中,4℃固定过夜;1000rpm离心10分钟收集固定细胞,PBS清洗2次;0.5ml PBS重悬细胞并轻轻吹匀(防止细胞破碎);加入1.5μl RNase A至终浓度为10μg/ml,37℃消化30分钟;加入0.25ml PI溶液至终浓度为10μg/ml,冰浴中避光染色30分钟;上机检测,通过软件分析流式细胞仪收集到的细胞群体。结果显示,食管癌细胞EC109经40mg/L的O3HB4HB(Mn=2100,含7mol%4-羟基丁酸,磷脂浓度为2g/L)处理24h和48h后,G0/G1期细胞数分别比空白脂质体处理组增加了11.3%和12.7%,具有统计学差异(图10),说明了O3HB4HB抑制食管癌细胞增殖的部分原因是延长了细胞的G1期所致。
实施例20流式细胞术检测OmclHA对原代食管癌细胞细胞周期的影
响
胰酶消化细胞,1ml培养液吹匀,1000rpm离心10分钟;弃去上清,PBS清洗2次,0.5ml PBS吹匀;5ml注射器将细胞吸起并吹入5ml70%预冷的乙醇中,4℃固定过夜;1000rpm离心10分钟收集固定细胞,PBS清洗2次;0.5ml PBS重悬细胞并轻轻吹匀;加入1.5μl RNase A至终浓度为10μg/ml,37℃消化30分钟;加入0.25ml PI溶液至终浓度为10μg/ml,冰浴中避光染色30分钟;上机检测,通过软件分析流式细胞仪收集到的细胞群体。结果显示,原代食管癌细胞(传至第三代)经过40mg/L的OmclHA(Mn=2300,含有1.6mol%3-羟基己酸,24.6mol%3-羟基辛酸,71.2mol%3-羟基癸酸and2.6mol%3-羟基十二酸,磷脂浓度为2g/L)处理后24h和48h后,G0/G1期细胞数分别比空白脂质体处理组增加了7.1%和6.7%(图11),无统计学差异。
实施例21钙成像法检测寡聚3-羟基丁酸(OHB)对小鼠成纤维细
L929胞内钙离子浓度的影响
消化后的小鼠成纤维细胞L929在含有圆形玻片的六孔板中爬片培养,细胞完全贴壁后,移去培养孔中的原培养液,用PBS液冲洗细胞1遍,加入10μmol/LFluo-4染料液150μl,置于37℃的CO2培养箱里避光孵育30min。将染色后的细胞用Hanks液冲洗3遍,加入600μlHanks液后置于激光共聚焦显微镜(Zeiss Meta510)20倍可见光下寻找区域及层面。选择488nm氩离子激光,观察染色的细胞的某一层面的荧光图像。连续扫描40张荧光图象,灌流加脂质体包裹的寡聚3-羟基丁酸溶液(终浓度1g/L)继续扫描。相同的条件下用对照药物处理。
钙离子浓度检测结果显示,脂质体包裹的OHB能够引起成纤维细胞胞内钙离子荧光强度的突然升高了400%,在这个水平维持了24秒,而后钙离子荧光强度逐渐下降到原来水平,荧光强度从出现变化到恢复持续时间102秒,而对照组空白脂质体的加入却几乎没有引起钙离子荧光强度的任何变化,两者形成显著性差异(图12),这个现象在很多重复实验中得到验证,结果显示了OHB可以引起成纤维细胞胞质内钙离子浓度的短暂增加
为研究OHB引起胞内钙离子浓度升高的机理,研究胞内增加的钙离子是来源于胞外溶液,还是来源于胞内钙库的释放,分别使用含有Ca2+的Hanks溶液以及无钙的Hanks溶液进行实验。结果显示,在含有钙离子的Hanks液中,加入寡聚体之后,引起荧光强度升高400%,而在无钙的Hanks液中,加入寡聚体,同样是荧光强度增加,却只是升高了100%,但是荧光强度下降比较缓慢,两者荧光强度从出现变化到恢复持续时间相同(图12)。我们可以推测这种现象的原因是虽然胞外没有钙离子,但是寡聚3-羟基丁酸借助脂质体,被运送到细胞内,启动了胞内钙库的释放信号。
为了证实这种升高是由于药物OHB刺激了细胞膜上的钙通道及胞内相关受体信号,还是由于OHB本身引起的胞内钙离子浓度增加,使用有钙的Hanks液作为细胞外液,首先加入内质网的的钙释放通道阻断剂普鲁卡因结果显示在使用普鲁卡因后,仍然观察到细胞中钙离子荧光强度增加了90%,持续了90秒恢复(图13),由此可以推测胞内钙离子不仅来源于钙库,还来源于胞外。Hanks液中又添加了细胞膜钙离子通道阻断剂氯化镧,仍然观察到细胞中钙离子荧光强度的增加,但是增加幅度已经下降到60%,持续了90秒才恢复(图13),显示了OHB还具有携带钙离子进入细胞的能力。
上述实验结果说明OHB促进胞内钙离子浓度的增加途径是多样的,不仅能够通过钙离子通道内流引起胞内钙离子升高,也能够通过引起胞内钙库的释放升高胞内钙离子浓度。更为关键的是也能连同脂质体起到向胞内运输钙离子的作用。
实施例22钙成像法检测寡聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸(OHBHHx)对
小鼠成纤维细胞L929胞内钙离子浓度的影响
消化后的小鼠成纤维细胞L929在含有圆形玻璃片的六孔板中爬片培养,细胞完全贴壁后,移去培养孔中的原培养液,用PBS液冲洗细胞1遍,加入10μmol/L Fluo-4染料液150μl,置于37℃的CO2培养箱里避光孵育30min。将染色后的细胞用Hanks液冲洗3遍,加入600μl Hanks液后置于激光共聚焦显微镜(Zeiss Meta510)20倍可见光下寻找区域及层面。选择488nm氩离子激光,观察染色的细胞的某一层面的荧光图像。连续扫描40张荧光图象,灌流加脂质体包裹的寡聚-3羟基丁酸-3-羟基己酸溶液(终浓度1g/L)继续扫描。相同的条件下用对照药物处理。
钙离子浓度检测结果显示,脂质体包裹的OHBHHx也能够引起成纤维细胞胞内钙离子荧光信号升高了93%,而后钙离子荧光强度缓慢下降,持续96秒恢复到原来水平。而对照组空白脂质体的加入却几乎没有引起钙离子荧光强度的任何变化,两者差异性显著(图14),这个现象在很多重复实验中得到验证,OHBHHx可以引起细胞胞质内钙离子浓度的突然变化。
为研究OHBHHx引起胞内钙离子浓度升高的机理,研究胞内增加的钙离子是来源于胞外溶液,还是来源于胞内钙库的释放,在含钙的细胞外液中加入钙离子螯合剂EGTA,结果显示,在加入EGTA后,同样观察到钙图象荧光强度缓慢增加,到最高点时也没有在含有钙离子的Hanks液中荧光强度变化大(只有86%)(图14)。我们可以推测这种现象的原因是虽然胞外没有钙离子,但是OHBHHx借助脂质体,被运送到细胞内,启动了胞内钙库的释放信号。
为了证实这种升高是由于OHBHHx刺激了细胞膜上的钙通道及胞内的相关受体信号,还是由于OHBHHx本身引起的胞内钙离子浓度增加,我们在细胞外液中加入了内质网的的钙释放通道阻断剂普鲁卡因和细胞膜钙离子通道阻断剂氯化镧。结果显示在使用了氯化镧和普鲁卡因后,仍然观察到细胞中钙离子浓度的增加(图15),看来OHBHHx还具有携带钙离子进入细胞的能力。
结合上述分析,OHBHHx促进胞内钙离子浓度的增加途径是多样的,不仅能够通过钙离子通道内流引起胞内钙离子升高,也能够通过引起胞内钙库的释放升高胞内钙离子浓度。更重要的是也能连同脂质体起到向胞内运输钙离子的作用。
实施例23钙成像法检测寡聚-3羟基丁酸-4-羟基丁酸(O3HB4HB)
对SD大鼠原代心肌细胞胞内钙离子浓度的影响
按照实施例4方法分离的心肌细胞在含有圆形玻璃片的六孔板中爬片培养,细胞完全贴壁后,移去培养孔中的原培养液,用PBS液冲洗细胞1遍,加入10μmol/L Fluo-4染料液150μl,置于37℃的CO2培养箱里避光孵育30min。将染色后的细胞用Hanks液冲洗3遍,加入600μlHanks液后置于激光共聚焦显微镜(Zeiss Meta510)20倍可见光下寻找区域及层面。选择488nm氩离子激光,观察染色的细胞的某一层面的荧光图像。连续扫描60张荧光图象,灌流加脂质体包裹的寡聚-3羟基丁酸-4-羟基丁酸溶液(终浓度1g/L)继续扫描致400张。相同的条件下用对照药物处理。
钙离子浓度检测结果显示,脂质体包裹的O3HB4HB能够引起细胞胞内钙离子荧光信号的连续的波动,随着时间的延长,波动峰值逐渐减小,而对照组空白脂质体的加入却几乎没有引起钙离子浓度的任何波动变化(图16)。两者存在差异在于寡聚物所起的作用,即O3HB4HB刺激心肌细胞胞内钙离子的波动。
实施例24钙成像法检测寡聚中长链3羟基脂肪酸(OmclHA)对SD
大鼠原代心肌细胞胞内钙离子浓度的影响
细胞培养条件,荧光燃料染色,激光共聚焦显微镜参数选择和对照组设定与实施例18中相同。
激光共聚焦显微镜对钙离子信号检测结果显示,脂质体包裹的OmclHA能够引起细胞胞内钙离子荧光强度的间断性变化,而对照组空白脂质体的加入却几乎没有引起钙离子荧光强度的任何变化,两者存在明显差异(图17)。这种胞质内钙离子浓度波动是由于加入OmclHA引起。
本文中所涉及的参考文献,包括专利文件、学术论文、出版物等,均以引用的方式将其全部内容包括在本文中。
应当理解,在不偏离本发明的精神和范围的情况下,本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进,而这些均被认为落入了本发明的保护范围。
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Claims (10)
1.式(I)化合物在制备用于调节细胞内钙离子浓度的制剂中的用途,
其中:
中括号内为结构单元,各结构单元可以相同或不同;
n表示结构单元的总数,选自1~100的整数;
各结构单元的m独立地选自1~3的整数;
各结构单元的R1独立地选自C1-C9的烷基;
R2选自C1-C9的烷基。
2.根据权利要求1的用途,其中R2选自C1-C5的烷基。
3.根据权利要求2的用途,其中R2选自C1-C3的烷基。
4.根据权利要求1的用途,其中R1选自C1-C5的烷基。
5.根据权利要求4的用途,其中R1选自C1-C3的烷基。
6.根据权利要求1的用途,其中R1选自C1-C2的烷基,R2选自C1-C2的烷基。
7.根据权利要求1的用途,其中,m为1或2,并且当m=1时,R1不为甲基。
8.根据权利要求1的用途,其中,n为1~50的整数。
9.根据权利要求1的用途,其数均分子量不超过10000。
10.根据权利要求1的用途,其中所述化合物选自由以下成员构成的组:寡聚3-羟基丁酸甲酯、寡聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸甲酯、寡聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸甲酯、寡聚中长链脂肪酸甲酯。
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Non-Patent Citations (2)
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Jie Sun等.In vitro effect of oligo-hydroxyalkanoates on the growth of mouse fibroblast cell line L929.《Biomaterials》.2007,第28卷(第27期),第3896-3903页. * |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2016164911A3 (en) * | 2015-04-10 | 2016-12-15 | Colorado State University Research Foundation | Ring-opening polymerization methods and recyclable biorenewable polyesters |
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