CN105209014A - 含有肉毒杆菌神经毒素的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有肉毒杆菌毒素和黏多糖的药物组合物及其应用，该药物组合物具有增强的药理活性和持久的肉毒杆菌毒素效果。

Description

含有肉毒杆菌神经毒素的药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及药物，即，涉及在临床实践(优选地，在心脏内科中用于治疗心律失常)中应用的含有肉毒杆菌神经毒素的药物组合物的制备。
背景技术
目前，最常用的肉毒杆菌神经毒素为A型肉毒杆菌神经毒素(A型肉毒杆菌毒素)。这种神经毒素是在肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)菌株存在下的发酵过程中产生的。
在临床实践中，基于A型肉毒杆菌毒素的少量药物例如保妥适(Botox)、丽舒妥(Dysport)、Kseomin(Xeomin)或Lantoks(Lantox)已被应用。这些药物在许多国家有注册治疗应用，以及还有一些目前正在被开发并且还没有注册的治疗应用(ShengChen,2012,Toxins,ClinicalUsesofBotulinumNeurotoxins:CurrentIndications,LimitationsandFutureDevelopments,4,913-939)。由美国食品药品监督管理局(FDA)提供的备有证明文件的应用包括：在眼科中：斜视的治疗；在神经科中：眼睑痉挛、面肌痉挛、痉挛性斜颈(颈肌张力障碍)、慢性偏头痛(头痛)、逼尿肌过度活动、成人和2岁以上儿童的局部肌肉痉挛(包括脑瘫和痉挛)、腋窝多汗、多涎的治疗；在美容医学科中：面部皱纹的消除；在泌尿科中：下尿路疾病的治疗；在肠胃科中：胃肠道疾病的治疗；在耳鼻咽喉科中：痉挛性发音困难的治疗。
目前，基于A型肉毒杆菌毒素的药物的以下应用正在被研究：在牙科中：颞下颌关节功能紊乱的治疗；在神经科中：慢性肌肉骨骼疼痛和糖尿病神经病变的治疗；在妇产科中：阴道痉挛的治疗；在创伤和一般的外科手术中：伤口愈合的改善；在心脏内科中：心律失常的治疗。
心律失常是一组广泛而复杂的心脏疾病。该疾病唯一有效的、合理的手术治疗是射频消融治疗(使用高频电流灼烧心脏的心律失常性区域)。然而，这种方法并不是足够有效的(低于60％)，而且具有很高的例如心包积血、经食道瘘管(transesophagealfistula)、消融后遗症(post-ablation)、心房扑动、膈神经麻痹性痴呆和附壁血栓等并发症的风险，该风险高于30％(Cammetal.,2010,GuidelinesforthemanagementofatrialfibrillationEuropeanHeartJournal,31,2369–2429)。
最近的公开出版物致力于使用肉毒杆菌神经毒素进行心律失常的治疗，但是针对心房纤维性颤动的抑制效果的持续时间不会超过一周(Ohetal.,2011,BotulinumToxinInjectioninEpicardialAutonomicGangliaTemporarilySuppressesVagallyMediated.AtrialFibrillation.CircArrhythm.Electrophysiol.,4,560-565)。这种效果的持续时间在临床实践中是不可接受的。
目前，基于肉毒杆菌毒素的药物的制造商均在参与稳定性药剂的应用的开发以加强毒素的货架期和其传递至靶向器官的有效性，该稳定性药剂为例如各种蛋白质、氨基酸、多糖和其它成分。
含有选自A、B、C、D、E、F或G和S不同血清型的肉毒杆菌的肉毒杆菌神经毒素以及选自聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸或聚鸟氨酸所组成的组中的聚胺酸(polyamineacid)的药物组合物已经被开发(专利申请RU2011125775A；WO2010/07842)。
含有6pg至30ng的量的，具有大约50-250单位的LD50(致死剂量，50％)的生物活性的A型肉毒杆菌毒素以及其它成分的其它药物组合物已经被开发(专利RU2453333C2，WO2008/000490)，所述其它成分例如pH缓冲液、赋形剂、稀释剂、冷冻保护剂和/或稳定剂，选自透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇。
然而，这些已知的组合物并不具有持续作用，也不增加肉毒杆菌毒素的治疗效果，并且不旨在用于治疗心律失常。那些制剂在心脏的组织中不具有足够的接触(exposure)以实现最佳效果，并且活性物质可能会快速消除而全身循环。
含有：(a)浓度为每1mL溶液50-10000单位LD50的肉毒杆菌神经毒素复合物(A、B、C、D、E、F或G型)或高纯度肉毒杆菌神经毒素(A、B、C、D、E、F或G型)，(b)含有0.005-0.02体积％的量的表面活性剂(SAS)，优选聚山梨醇酯80的稳定性试剂，(c)浓度为0.15-0.3M的作为结晶剂(crystallineagent)的氯化钠，(d)浓度为10-20mM的二糖，优选为蔗糖，(d)维持pH值为5.5-7.5的缓冲液，主要为组氨酸，以及水的液体药物组合物也已经被开发(专利RU2407541C2，WO2006/005910)。然而，这些已知的组合物不旨在用于治疗心律失常疾病，而且据说诱导对肉毒杆菌毒素的稳定性效果，没有任何关于持续作用或者降低治疗剂量和副作用的任何明示或建议或者。
因此，对于治疗心律失常，特别是心房纤维性颤动的能够导致持续效果以及能够限制潜在副作用的新策略具有重要的需求。
发明内容
本发明涉及对治疗心律失常有效的肉毒杆菌神经毒素的药物组合物，特别是具有高治疗效果、延长的持续效果和减少的副作用。
发明人意外地发现，本发明的组合物实现了提高A型肉毒杆菌毒素的药理学活性，已经通过单一剂量实现了期望的治疗效果，延长了肉毒杆菌毒素的效果，同时降低了肉毒杆菌毒素的副作用。进一步地，当维持在溶液中以待使用时，本发明的组合物允许制备成具有用于直接进入临床的个性化药物所需的性质并且呈现出延长活性的组合物。
本发明的第一方面提供了一种含有肉毒杆菌毒素，特别是A型肉毒杆菌毒素和选自由壳聚糖和那曲肝素所组成的组中的黏多糖，以及药学上可接受的赋形剂的组合物，所述壳聚糖和那曲肝素采用1：(103-109)，优选1：(106-108)的重量比，该组合物具有以下成分：
肉毒杆菌毒素1-200U/mL
黏多糖0.1-50mg/mL
盐水0.1-50mL。
本发明的第二方面涉及根据本发明的药物制剂用作药剂。
本发明的第三方面涉及根据本发明的组合物在制备用于预防和/或治疗心律失常特别是心房纤维性颤动和动脉性高血压的药物制剂中的应用。
本发明的第四方面涉及在需要所述组合物的受试者中预防和/或治疗心律失常特别是心房纤维性颤动或动脉性高血压的方法，该方法包括在所述受试者中给药根据本发明的药物制剂。
本发明的第五方面涉及药用试剂盒，该药用试剂盒包括隔室形式的第一室或一系列室以及第二室或一系列室，其中，第一室或一系列室包括根据权利要求1-13中任意一项所述的组合物，第二室或一系列室包括具有使用说明书的注射用注射器。
本发明的第六方面涉及根据本发明的组合物的制备的药用试剂盒，该药用试剂盒包括隔室形式的第一室或一系列室以及第二室或一系列室，其中，第一室或一系列室包括肉毒杆菌毒素溶液，第二室或一系列室包括具有使用说明书的壳聚糖粉末和任选的用于制剂制备的小瓶。
附图说明
图1示出了如实施例9中所描述的由大鼠股骨肌肉的电刺激阈值(以伏特为量度)的变化表示的本发明的药物组合物相比于商业的制剂(Xeomin)以及相比于含有肉毒杆菌毒素和另一种黏多糖的对比制剂的效果。A：制剂№2(-壳聚糖)；B：制剂№6(-那曲肝素)；C：对比制剂№11(-透明质酸钠)；D：对比制剂№4(-肝素)；(-----)Xeomin。
图2示出了如实施例11中所描述的由大鼠股骨肌肉的电刺激阈值(以伏特为量度)的变化表示的本发明的药物组合物相比于根据专利RU2407541描述的含有二糖和A型肉毒杆菌毒素的组合物的效果和其持续时间。
图3示出了如实施例13中所描述的由大鼠股骨肌肉的电刺激阈值(以伏特为量度)的变化表示的在不同壳聚糖浓度下的本发明的两个药物组合物与商业的组合物(Xeomin)的对比效果。(---Xeomin)，(—-制剂№1)，(....制剂№2)。
图4示出了如实施例12中所描述的对比注射[VisipaqueTM(碘克沙醇)]至包括前右(A)、右下(B)和左上GP(C)的心外膜脂肪垫的图。导管输出针进入心包腔空间(D)。
图5示出了如实施例11所描述的由大鼠股骨肌肉的电刺激阈值(以伏特为量度)的变化检测的诱导AF的刺激阈值。(....基线)，(---Xeomin)，(-制剂№2)
图6示出了将本发明的组合物给药至四个主要的心外膜脂肪垫的可视区域的例子。A：第一心外膜左心房脂肪垫位于右上肺静脉(PV)的前方，并且与右前神经节丛(GP)相对应；B：第二心外膜脂肪垫位于右下肺静脉的下后方，并且与右下GP相对应；C：第三脂肪垫位于左上PV和左下PV的前方(在PVs与左心耳(LAA)之间)，并且与马歇尔束(Marshalltract)GP和左上GP相对应；以及D：第四脂肪垫位于左下PV的下方并向后延伸，并且与左下GP相对应。针尖在直接视觉控制下手工置于脂肪垫的心外膜表面的几处位置，以确保最佳注射。
具体实施方式
术语“肉毒杆菌毒素”指的是选自A、B、E、F和G型肉毒杆菌毒素的任意类型。肉毒杆菌毒素(BTX)通过阻断来自神经肌肉接头的突触前末梢的乙酰胆碱的释放而起作用。已经描述了由肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)的不同菌株产生的七种不同的抗原性肉毒杆菌毒素(BTX-A、B、C、D、E、F和G)。人类神经系统易受5种血清型毒素(BTX-A、B、E、F、G)的影响而不受2种血清型毒素(BTX-C、D)的影响。肉毒杆菌神经毒素作为150kDa的无活性多肽被产生，其被胰蛋白酶样细菌蛋白酶切割以生成双链(di-chain)活性形式的毒素。单链与双链毒素的比例取决于毒素的血清型和细菌菌株是否表达适当的蛋白酶。100-kDa重(H)链和50-kd轻(L)链通过热不稳定的二硫键和非共价键力结合在一起。该H链和L链在加热和沸腾下解离，从而使毒素失活，因为神经毒性需要H链和L链两者。
术语“A型肉毒杆菌毒素”指的是基于A型肉毒杆菌毒素的可商购获得的任何产品，其能够根据本发明被应用，例如，“BOTOXTM”、“DysportTM”、“KseominTM”、“LantoksTM”等。
A血清型肉毒杆菌毒素通常具有大约150kDa的分子量，并且是由通过二硫键连接的重链和轻链组成的双链多肽形式的蛋白质。在人体中，重链引起与突触前胆碱能神经末梢的固定和毒素的细胞摄取。轻链作为锌肽链内切酶并且切割负责膜融合的特定蛋白而被认为是负责毒性作用。在破坏细胞内的膜融合的过程中，肉毒杆菌毒素阻断突触间隙中乙酰胆碱的释放。神经肌肉传递中的肉毒杆菌毒素的全效应阻断神经肌肉传递，而且事实上是切除神经肌肉。在其它外周胆碱能突触中，肉毒杆菌毒素还具有引起减少流涎和出汗的活性。A血清型肉毒杆菌毒素能够通过如在专利US7189541(肉毒杆菌毒素生产方法)；专利US6818409(肉毒梭菌毒素的分离和纯化)中所描述的肉毒梭菌细菌培养物中纯化和分离而得到，或者如专利US6967088(可溶性重组肉毒杆菌毒素蛋白质)中所描述的重组产生。
术语“壳聚糖”是指通过甲壳素又称聚(N-乙酰-D-氨基葡萄糖)的部分实质上(partialtosubstantial)碱性N-脱乙酰化获得的甲壳素衍生物，所述壳聚糖是一种天然产生的生物聚合物，能够从甲壳纲动物例如虾、蟹和其它海洋甲壳纲动物(包括北极虾(Pandalusborealis))的壳以及真菌的细胞壁(例如举例为在Kumar,2000,reactiveandFunctionalPolymers,46(1),1-27以及Yogeshkumar,2013,InternationalJournalofResearchinPharmaceuticalandBiomedicalSciences,4(1),312-331；Davis等,1984,J.Gen.Microbiol.,130(8)：2095-102.中所描述的)中提取。
作为一种天然材料，壳聚糖由于其与细胞外基质(ECM)的成分葡糖氨基葡聚糖(GAGs)的结构相似，已经在这一领域内被广泛地研究。壳聚糖，甲壳素部分脱乙酰的衍生物，是一种由葡萄糖胺和N-乙酰氨基葡萄糖单元通过β(1-4)糖苷键连接而组成的线性多糖。壳聚糖与血管内膜的聚合物保护层(lining)由于结构而相似，而且壳聚糖具有与人体组织完全的生物相容性，以低毒为特征(ChaoDengetal.,2010,Macromol.Symp.,297,138–146)。
根据一种具体的实施方式，本发明的壳聚糖蟹壳来源的，并通过机械粉碎和脱乙酰化处理后得到。
根据另一种具体的实施方式，本发明的壳聚糖具有约85-100％的脱乙酰度。
根据另一种具体的实施方式，本发明的壳聚糖具有约100kDa至约1000kDa的平均分子量(Mw)。
术语“肝素”是指具有抗凝直接作用的黏多糖，以及具有与肉毒毒素的分子量相当的分子量。它能够从捣碎的牛肺中提取或如Linhardtetal.,2012,Curr.Opin.Pharmacol.,12(2)：217–219中所描述的重组产生。
术语“那曲肝素”是指具有抗凝直接作用的黏多糖，为低分子肝素，具有比肉毒杆菌毒素的分子量少一个以上的数量级的分子量。它能够从哺乳动物组织中分离(专利US2884358)或从UDP糖前体(作为葡萄糖醛酸残基和N-乙酰-D-氨基葡萄糖残基交替的聚合物)而合成(HazardousSubstancesDataBank())。
组合物
本发明提供了用于治疗受试者的药物组合物和方法，所述受试者优选为哺乳动物受试者，最优选为患有心律失常特别是心房纤维性颤动的人类患者，或有发展为心律失常特别是心房纤维性颤动的风险的人类患者。
在具体的实施方式中，本发明提供了本发明的药物组合物用于作为的药剂。
本发明的药物组合物可以进一步含有一种或多种药学上可接受的其它成分，例如稳定剂、抗菌剂、缓冲液、着色剂、佐剂等。
根据本发明的组合物与常规使用的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂一起置于药物组合物和其单位剂量的形式中，并且这种形式可以作为固体(如移植物或填充胶囊)或液体(如溶液、悬浮液、乳液、酏剂)或以通过注射或持续输注以用于肠胃外(包括皮下)使用的无菌注射液形式填充有它们的胶囊被应用。可注射的组合物通常基于可注射的无菌盐水或磷酸盐缓冲盐水或本领域内已知的其它可注射用的载体。这些药物组合物及其单位剂型可以含有常规比例的成分，有或者没有其它的活性化合物或组成部分(principles)，以及那些单位剂型可以含有任何合适的、有效量的、与预期被应用的剂量范围相应的活性成分。根据一种具体的实施方式，根据本发明的组合物是可注射的。
进一步的材料和制剂加工技术等列出在Remington’s的第5部分“TheScienceandPracticeofPharmacy”,22ndEdition,2012,UniversityoftheSciencesinPhiladelphia,LippincottWilliams&Wilkins中，其内容通过引用合并于本文中。
根据一方面，优选使用盐水(例如0.9％的氯化钠)作为药学上可接受的赋形剂。本发明的组合物可以任选地含有其它成分例如pH缓冲剂、赋形剂、稀释剂、冷冻保护剂和/或稳定剂。
根据一方面，本发明的组合物含有根据权利要求1-4中任意一项所述的组合物，其中，肉毒杆菌神经毒素优选A型肉毒杆菌毒素与黏多糖的重量比为约1：1.5×107至约1：5×107，例如1：4.4×107。
根据另一方面，本发明的组合物含有根据权利要求1-4中任意一项所述的组合物，其中，肉毒杆菌神经毒素优选A型肉毒杆菌毒素与黏多糖的重量比为约1：1.5×107至约1：5×107，例如1：76×107。
根据一方面，1次注射过程中本发明的组合物含有约20UI至200UI剂量的肉毒杆菌毒素(通常为50UI)，优选A型肉毒杆菌毒素。
根据另一方面，本发明的组合物为2000μL的注射过程体积的剂量的形式。
给药模式
本发明的组合物可以以任意方式进行给药，具体包括在治疗心房纤维性颤动的情况下的心外膜区(特别是在主要的心外膜脂肪垫的可视区域)。在具体的实施方式中，可以使用不同的给药途径的组合。例如通过血管内导管注射的心肌内给药、血管内灌注进入供养靶器官的动脉(心脏、肾脏)的方法能够用于本发明组合物的给药。
药物组合物的准确剂量是本领域技术人员根据包括药代动力学性质、患者情况和特征(性别、年龄、体重、健康状况、尺寸)、症状的程度、同期治疗、治疗的频率和预期的效果的各种因素能够容易确定的。
根据一种实施方式，本发明的组合物在冠状动脉旁路移植手术之前或开始时进行给药。根据一种实施方式，在手术的主要阶段之后，将本发明的组合物注射至四个主要的心外膜脂肪垫的整个可视区域中(例如如图6所示的)。
根据进一步的实施方式，本发明的组合物以约50U/mL的肉毒杆菌毒素剂量在至少一个心外膜脂肪垫中进行给药，优选在每一个脂肪垫中进行给药。
组合
根据本发明，本发明的药剂可以单独进行给药，或者与在预防和/或治疗心律失常特别是心房纤维性颤动或动脉性高血压中有用的助剂(co-agent)联合给药，例如选自I类、II类、III类抗心律失常药物的助剂(如普鲁卡因胺、胺碘酮(amidaron)、索他洛尔)。
本发明包括在预防或治疗心律失常，特别是心房纤维性颤动或动脉性高血压中有用的其他治疗/预防方案助剂之前、同时或随后，将治疗有效量的药物制剂给药至个体(例如，联合方案)。与所述助剂同时给药的药物制剂可以在相同或不同的组合物中通过相同或不同的给药途径进行给药。
患者
在一种实施方式中，根据本发明的患者为患有选自心律失常特别是心房纤维性颤动和动脉性高血压疾病的患者。
在另一种实施方式中，本发明的患者为处于患有选自心律失常特别是心房纤维性颤动的疾病的风险中的患者，例如经历冠状动脉旁路移植(CABG)手术、心脏瓣膜手术或其它心脏直视手术的患者，其在术后早期具有30％的患心房纤维性颤动的风险(Filardoetal.,2009,Circ.Cardiovasc.Qual.Outcomes,2:164–169)。
在一种具体的实施方式中，根据本发明的患者为患有心律失常的患者。
在另一种具体的实施方式中，根据本发明的患者为患有动脉性高血压的患者。
根据本发明的应用
根据本发明的一方面，提供了通过使用本文描述的制剂或组合诱导受试者中心律失常特别是心房纤维性颤动降低的方法。
根据本发明的另一方面，提供了通过使用本文描述的制剂或组合诱导需要其的受试者中肾素释放减少和/或血压下降的方法。
根据本发明的制剂或组合以有效诱导心律失常下降和/或血压下降的量和给药方案进行给药。
在本发明的另一种具体实施方式中，提供了用于预防、抑制或治疗心律失常特别是心房纤维性颤动或动脉性高血压的方法，所述方法包括对需要其的受试者给药治疗有效量的根据本发明的药物制剂。
根据另一方面，由于由本发明的制剂实现的主要效果是阻断来自神经系统的突触前末梢的神经介质的释放，而且在人体的其它区域中这些突触组合物之间没有主要的组织学和细胞学差异，因此本发明的制剂能够被用于仅使用肉毒杆菌毒素的不同的药物领域，即不仅是用于心律紊乱的治疗。
根据一方面，本发明的制剂被给药至心肌内的GPs以及心外膜脂肪垫中。
本发明的制剂的制备方法
本发明的组合物可以通过以预计比例将所述成分的水溶液混合制备。
本发明的制剂的优点是其能够由纯的A型肉毒杆菌毒素或由基于A型肉毒杆菌毒素的商购产品制备，该商购产品允许来自直接进入临床实践的可获得的组分的需要的溶液的制备。
本发明的制剂允许实现A型肉毒杆菌毒素在效果上的增强，同时降低全身效应以及产生免疫耐受(本发明的物质使用黏多糖从靶点位置创造分子的机械保护以及肉毒杆菌毒素分子的延迟分布)的副作用。壳聚糖分子是中性的并且机械地覆盖肉毒杆菌毒素的免疫反应中心(KatherineBowmanetal.,2006,Int.J.Nanomedicine,1(2):117–128)。
本发明的肉毒杆菌毒素组合物的优点是其将允许减少必要的治疗剂量，同时增加药物效果的持续时间以及减少副作用，如未使用的肌肉的不期望的去神经(undesirabledenervation)以及全身效应(systemiceffect)的发展。
另外的优点是在临床中基于应用目标直接由能够微调所需性能的商购的产品制备该组合物的可能性。心房纤维性颤动的治疗需要组合物的心外膜给药，其中，壳聚糖的优选性质是延长肉毒杆菌毒素(A型肉毒杆菌毒素和壳聚糖的重量比为1：4.4×107)的释放。动脉性高血压的治疗需要组合物的肾动脉输注，其中，壳聚糖的优选性质是提高肉毒杆菌毒素对近肾小球膜的粘接性能(A型肉毒杆菌毒素和壳聚糖的重量比为1：4×105)。
随着活性成分的重量比例增加(本发明的A型肉毒杆菌毒素/黏多糖)至超过1：109，制备在治疗上可接受的可注射的制剂是困难的。例如，在A型肉毒杆菌毒素/黏多糖的比例等于1：109以及40U的肉毒杆菌毒素活性(相当于1ng)时，壳聚糖的必要量为1g，这导致50mL的注射体积，壳聚糖的临床相关注射浓度为2％。这个量对于治疗是过度的。随着活性成分在组合物(A型肉毒杆菌毒素/黏多糖)中的重量比例减少至低于1：103，组合物的效果明显降低，并且接近A型肉毒杆菌毒素的传统制剂的效果。
在另一种实施方式中，提供了药用试剂盒，该药用试剂盒包括隔室形式的第一室或一系列室以及第二室或一系列室，其中，第一室或一系列室包括本发明的组合物，第二室或一系列室包括具有使用说明书的注射用注射器。
以下将以更详细的方式来描述阐述本发明的实施例，并参考附图表示的实施方式作。
实施例
本发明通过如下实施例进行阐述。
实施例1：含有重量比为1：4.4×10 7 的A型肉毒杆菌毒素和壳聚糖的药 物组合物(№1)的制备
在所有实验中，为了制备A型肉毒杆菌毒素的溶液，使用了由MERZPHARMAGmbH&Co.,KGaA(德国)生产，登记号LSR-004746/08的A型肉毒杆菌毒素商业制剂“KseominTM”，助剂：蔗糖和人血清白蛋白；或者由兰州生物制品研究所(中国)生产，登记号LSR-001587/08的“LantoxsTM”，助剂：明胶、葡聚糖和蔗糖。
在这两种情况下，使用装有100单位的肉毒杆菌毒素的小瓶。在每一个小瓶中，加入1000μL的无菌盐水。使用得到的溶液与通过下述方法得到的壳聚糖溶液进行混合。使用由“Bioavanta”生产的药物“Chitosol”(Koltsovo,NovosibirskRegion，该壳聚糖的脱乙酰度至少为90％，它的平均分子量为～500kDa并且由蟹壳制备)进行不同的壳聚糖溶液的制备。为了制备100mL的2.2％的Chitosol溶液，将1.1g的琥珀酸(siccineacid)和0.9g的氯化钠溶解在100mL的微波炉加热下的蒸馏水中。在所述酸和盐彻底溶解之后，分批(smallportions)并且在加入的每一批彻底溶解之前引入2.2g的Chitosol，每一批通过托盘混合以及粉碎。
在脉冲模式(600W的功率下1/6时间)下的微波炉中加热1小时。为了排除附聚物(agglomerates)的形成，将溶液在超声洗洁器中处理10分钟(在加入壳聚糖之后)。
通过在1mL的配有Luer-LokTip系统的注射器中混合100μL的A型肉毒杆菌毒素溶液(含有10U或0.25ng的A型肉毒杆菌毒素)和400μL的2.75％的壳聚糖溶液(含有11mg的壳聚糖)以制备所述药物组合物。结果得到的液体药物组合物含有以下成分：
A型肉毒杆菌毒素20IU/mL(0.5ng/mL)
壳聚糖22mg/mL
盐水0.5mL。
实施例2：含有重量比为1：1.76×107的A型肉毒杆菌毒素和壳聚糖的药物组合物(№2)的制备
通过在2mL的注射器中混合以制备药物组合物。制备溶于400μL的盐水的100单位的肉毒杆菌毒素溶液(其含有100U，或2.5ng的A型肉毒杆菌毒素)，并将其用于与1600μL的2.75％的壳聚糖溶液(含有44mg的壳聚糖)混合。
结果得到的液体药物组合物含有以下成分：
A型肉毒杆菌毒素50IU/mL(1.25ng/mL)
壳聚糖22mg/mL
盐水多至2mL。
实施例3：含有重量比为1：1.6×107的A型肉毒杆菌毒素和肝素的药物组合物(№3)的制备(不在本发明范围内的对比制剂)
使用浓度为5000IU/mL的肝素溶液(产品来自Synthesiscompany，Kurgan，俄罗斯，药物登记号PN000116/01)。1单位的肝素等于0.0077mg的国际标准肝素，即1mg含有130IU(PershynGN，GvozdevaEITextbookofPharmacology-Moscow:Medgiz，1961-s.405)。
通过混合100μL的A型肉毒杆菌毒素溶液(含有10U或0.25ng的A型肉毒杆菌毒素)、104μL含有4mg的肝素的肝素溶液(～520IU)以及500μL的盐水以制备药物组合物。该药物组合物含有：
A型肉毒杆菌毒素20IU/mL(0.5ng/mL)
肝素1040IU/mL(8mg/mL)
盐水0.5mL。
实施例4：含有重量比为1：5.3×106的A型肉毒杆菌毒素和肝素的药物组合物(№4)的制备(不是本发明的对比制剂)
类似于实施例3的方法将300μL的A型肉毒杆菌毒素溶液(含有30U或0.75ng的A型肉毒杆菌毒素)、104μL含有4mg的肝素的肝素溶液(～520IU)以及500μL的盐水进行混合以获得药物组合物。该药物组合物含有：
A型肉毒杆菌毒素60IU/mL(1.5ng/mL)
肝素1040IU/mL(8mg/mL)
生理盐水多至500μL。
实施例5：含有重量比为1：8×106的A型肉毒杆菌毒素和那曲肝素的药物组合物(№5)的制备
使用浓度为9500IU/mL的速避凝(fraxiparine)(那曲肝素)的溶液(SanofiWinthropIndustry，法国，登记号PN012486/01)进行实验。1单位的低分子肝素-那曲肝素(平均分子量为4000-7000Da)的作用已经被认为等于1单位的肝素，即0.0077mg。
通过混合100μL的A型肉毒杆菌毒素溶液(含有10单位或0.25ng的A型肉毒杆菌毒素)、27μL含有2mg的那曲肝素的那曲肝素溶液(～260IU)以及多至500μL的盐水以制备药物组合物。该药物组合物含有：
A型肉毒杆菌毒素20IU/mL(0.5ng/m)
那曲肝素520IU/mL(4mg/mL)
盐水0.5mL。
实施例6：含有重量比为1：2.67×106的A型肉毒杆菌毒素和那曲肝素的药物组合物(№6)的制备
通过混合300μL的A型肉毒杆菌毒素溶液(含有30单位或0.75ng的A型肉毒杆菌毒素)、27μL含有2mg的那曲肝素的那曲肝素溶液(～260IU)以及500μL的盐水以制备药物组合物。该药物组合物含有：
A型肉毒杆菌毒素60IU/mL(1.5ng/mL)
那曲肝素520IU/mL(4mg/mL)
盐水0.5mL。
实施例7：含有重量比为1：2×108的A型肉毒杆菌毒素和壳聚糖的药物组合物(№10)的制备
类似于实施例1的方法，在盐水中制备5％的壳聚糖溶液。使用10mL的该溶液溶解100U的A型肉毒杆菌毒素(含有100ng或2.5单位的A型肉毒杆菌毒素以及500mg的壳聚糖)。结果得到的液体药物组合物含有以下成分：
A型肉毒杆菌毒素10IU/mL(0.25ng/mL)
壳聚糖50mg/mL
盐水多至10mL。
实施例8：含有A型肉毒杆菌毒素和透明质酸钠的药物组合物的制备(不是本发明的对比例)
通过在1mL的配有系统Luer-LokTip的注射器中混合100μL的A型肉毒杆菌毒素溶液(含有20U或0.5ng的A型肉毒杆菌毒素)和400μL的1％的透明质酸钠(含有4mg的透明质酸钠，Sigma-aldrichcat#53747)以制备药物组合物。结果得到的液体药物组合物含有以下成分：
A型肉毒杆菌毒素20U/mL(0.5ng/mL)
透明质酸钠10mg/mL
生理盐水补足0.5mL体积。
实施例9：获得的药物组合物的生物测试
本发明的药物组合物(№1-6)的有效性和安全性测试与相同剂量(以单位表示)的溶于盐水的A型肉毒杆菌毒素的商业制剂溶液以及与相同剂量(以单位表示)的含有A型肉毒杆菌毒素和其它非壳聚糖和肝素(№3和4)的黏多糖的药物组合物溶液进行比较。
这项研究在《良好实验室操作(GoodLaboratoryPractice)》的框架下进行(与动物处理的法律和道德标准相一致)，并且在当地伦理委员会批准下进行。每项实验采用两组10只实验动物，Wistar大鼠。每组在右大腿中注射用0.9％的氯化钠溶液(盐水)稀释的A型肉毒杆菌毒素；药物组合物(№1-6)在左大腿进行给药。
麻醉：乙醚
注射体积：每条大腿0.5mL。
给药方法：肌内注射，三个注射点(大腿的背部、大腿的内侧(medial)、大腿的外侧)，每处0.16mL。
制剂的比较通过评价大腿肌肉响应电刺激的降低进行。在整个时间进程中比较肌内电刺激的阈值最小变化。电刺激阈值的测量通过在肌内使用两个无菌钢微电极和ERA300设备(Biotronic，USA)进行。在测量过程中，这些微电极以约4mm的深度被临时肌内插入至大鼠大腿的外侧区，各个电极彼此相距10mm。例如，如果组合物№1的肌内电刺激的最小阈值为4.0±0.2V，并且对照组的为2.0±0.12V，那么组合物№1在测量时的生理效应相对于肉毒杆菌毒素商业制剂的生理效应增加了2倍。
在注射之前，在不同组的实验动物中观察到整体的高活性(在鼠笼中的活动)。
在注射程序后的第一天，将动物暴露在用于镇静的药物的残留氛围中。
在注射一周之后，观察到在所有大鼠中下肢瘫痪，但是上肢可以运动(肉毒杆菌毒素作用的临床证据)。组合物的肌内电刺激的最大阈值为：№1：4.0±0.1V(对照组为2.5±0.1V，初值为1.5±0.1V)，№2：10.0±0.4V(对照组为3.0±0.1V，初值为1.0±0.1V)。
在注射两周之后，观察到在所有大鼠中下肢瘫痪，但是上肢可以运动。大鼠体重降低，并且表现出厌食和厌水。组合物的肌内电刺激的最大阈值为：№1：6.0±0.3V(对照组2.5±0.2V)，№2：10.0±0.5V(对照组2.3±0.1)。
在注射3周之后，观察到在所有大鼠中下肢瘫痪，但是上肢可以运动。大鼠活动的力度增加。它们活跃地喝水并且正常进食。组合物的肌内电刺激的最大阈值为：№1：4.0±0.1V(对照组2.0±0.1V)，№2：5.0±0.2V(对照组1.8±0.1)。
在注射4周之后，大鼠客观地(objectively)活跃并且仅有下肢(lowerextremities)仍然观察到瘫痪。组合物的肌内电刺激的最大阈值为：№1：4.0±0.2V(对照组2.0±0.12V)，№2：5.0±0.3V(对照组2.0±0.2)。
组合物№3-6，在注射后的第一周没有观察到最大效果，但是在第二周观察到了；但是，与对照组的差异的绝对值不像壳聚糖情况下那样大。因此，在第二周，对比组合物№3.的肌内电刺激的最大阈值为1.8±0.1V(对照组2.3±0.1V，初值为1.0±0.1V)，组合物№5：2.2±0.1V(对照组1.5±0.1V，初值为1.2±0.1V)以及对比组合物№11：1.5±0.1V(对照组2.6±0.2V，初值为1±0.1V)。
相比于商业制剂，可能肝素相当牢固地持有A型肉毒杆菌毒素以防止它的生物效应，然而相反，低分子那曲肝素加强了肉毒杆菌毒素的作用。它还进一步地通过对比制剂4显著效果的缺失(与本发明的制剂№6相比)得到了支持。
本发明的组合物的潜在毒性通过对实验动物的内部器官进行组织学检测的组织形态学研究进行评价。通过显微分析福尔马林固定的以及用石蜡包埋的肝、肾、脾、心、骨骼肌和脑的组织样本，没有发现病变的形态学信号。因此，结论为测试剂量下的A型肉毒杆菌毒素以及本发明的药物组合物在实验动物的组织和器官上没有损害性影响。
实施例10：通过注射含有A型肉毒杆菌毒素的药物组合物至心外膜脂肪垫以抑制心房纤维性颤动的诱导的研究
该测试使用药物组合物№2.在包括10只狗的小组中进行，含有左心房的右中心神经节丛的心外膜脂肪垫通过右侧开胸进行分配(allocated)。
在实验组(5只狗)中，在两个右侧脂肪垫中分别引入1mL的50U的A型肉毒杆菌毒素+壳聚糖(100单位的A型肉毒杆菌毒素2mL，组合物№2)的溶液。在对照组(5只狗)中，在两个脂肪垫中分别引入1mL的50单位的A型肉毒杆菌毒素+0.9％的氯化钠(100IU的A型肉毒杆菌毒素2mL)。
在注射1、2、3和4周之后，使用或不使用颈迷走神经刺激评价电生理效应。通过颈迷走神经刺激，在两组狗中均出现心房纤维性颤动。这一效应通过在两组中以如上描述的剂量和区域给药肉毒杆菌毒素测试溶液和肉毒杆菌毒素对照溶液而被阻断。在对照组中，在注射后的第8天(观察期间)迷走神经的阻断效应消失。在实验组中，注射后，迷走神经的阻断效应持续超过30天。因此，通过使用本发明的组合物№2将肉毒杆菌毒素注射至左心房的心外膜脂肪垫，颈迷走神经刺激诱导的心房纤维性颤动的临时抑制延长至超过30(不少于4倍)天。
这些结果表明使用本发明的A型肉毒杆菌毒素药物组合物能够增加毒素的药理学活性并且降低必要的单一剂量以实现期望的治疗效果，这将允许降低肉毒杆菌毒素的副作用。组合物№6.获得了相似的结果，对比制剂4和对比制剂11不能实现该效果(图1)。
实施例11：本发明的组合物的效果与二糖组合物的效果的对比
本发明的含有肉毒杆菌毒素和壳聚糖(№2)药物组合物与含有二糖的注册的商业组合物(对比制剂№11)的有效性和持续性效果的对比按照如下进行以及。对比制剂№11含有：
а)A型肉毒杆菌神经毒素(20U/mL(0.5ng/mL))
b)稳定性药剂吐温80(0.02体积％)
c)浓度为20mM的蔗糖
d)维持pH为5.5-7.5的组氨酸缓冲液
e)生理盐水(0.9％氯化钠的盐水)加至体积为0.5mL。
在注射后，大鼠大腿肌肉的肌内电刺激的阈值采用前述方法测量。
组1-制剂№2
组2-对比制剂№11
结果如图2所示：组1和组2的肌内电刺激的最大阈值分别为：组1：9.8±0.3V，初值1.2±0.1V，组2：2.6±0.1V，初值1.0±0.1V。
2周之后：组1：10.0±0.4V，组2：2.5±0.1V。
4周之后：组1：5.0±0.2V，组2：2.0±0.1V。
6周之后：组1：3.3±0.2V；组2中的刺激阈值降低至接近初值(1.5±0.1V)。
这些数据支持了本发明的含有壳聚糖和肉毒杆菌毒素的制剂比注册的含有二糖和肉毒杆菌毒素的商业组合物(如专利RU2407541中所述的)显示出更好的效果和更长的持续作用。
实施例12：使用壳聚糖+A型肉毒杆菌毒素的组合物(1：1.76×107)和商业制剂肉毒杆菌毒素抑制诱导性心房纤维性颤动的有效性和安全性
前述的动物研究表明，注射肉毒杆菌毒素至心外膜脂肪垫能够抑制诱导性心房纤维性颤动(AF)。本研究的目的在于比较使用壳聚糖+A型肉毒杆菌毒素(1：1.76×107)(本发明的制剂№2)和肉毒杆菌毒素的商业制剂将肉毒杆菌毒素心内注射至心外膜脂肪垫以及心肌内的左心房神经节丛(GP)以预防AF的效果和安全性。
在30只狗中，静脉导管通过左心房。通过高频刺激(HFS)诱发的迷走神经反射的位置被标记在电解剖标测系统(electroanatomicmappingsystem)上，并且随后用于指定注射。肉毒杆菌毒素的心肌内注射(每只10U/0.2毫升)在每只狗的7个位置处进行给药。另外，每只狗也通过心内途径3次注射至含有前右、右下和左上GP(每处50U/1mL)的心外膜脂肪垫(图4)。在注射之前评价通过诱导性HFS和AF引起的迷走神经反射，以及注射后每2周进行评价，直到标记在之前记录的图中的GP位置上通过精密导管复位以及刺激使得所有的变化回到基线。30只狗中的15只注射壳聚糖+肉毒杆菌毒素组合物(1：1.76×107)，30只狗中的另外15只注射肉毒杆菌毒素(Xeomin，德国)。
在手术(procedure)后2周，证实所有的狗的迷走神经响应彻底消除，然后在14.7±1.5周Xeomin组全部恢复至基线值，以及在20.1±1.8周壳聚糖+肉毒杆菌毒素组全部恢复至基线值(p<0.05；(图5))。在2周时，诱导AF的刺激的阈值，分别地，在Xeomin组中从基线处的4.9±0.6V增长至12.4±2.5V，以及在壳聚糖+肉毒杆菌毒素组中从基线处的5.6±1.2V增长至16.3±2.2V(p<0.05)。没有手术相关的并发症发生。
这些数据表明，通过心内途径注射肉毒杆菌毒素至心肌内GPs以及心外膜脂肪垫是可行且安全的，并提供心脏迷走神经响应的彻底消除以及显著的AF抑制。壳聚糖+A型肉毒杆菌毒素组合物(1：1.76×107)比商业的A型肉毒杆菌毒素制剂(Xeomin，德国)更有效且具有更长的持续作用。
实施例13：使用壳聚糖+A型肉毒杆菌毒素组合物(1：4.4×107)，壳聚糖+A型肉毒杆菌毒素组合物(1：1.76×107)以及商业的肉毒杆菌毒素制剂抑制动脉性高血压的效果和安全性
现有的体外研究表明，注射肉毒杆菌毒素至大鼠肾脏中抑制活性肾素的释放以及导致血压的降低(Mendezetal.,2013,Am.J.Physiol.Renal.Physiol.304:F498-F504)。本研究的目的在于对比使用本发明的制剂尤其是壳聚糖+A型肉毒杆菌毒素(本发明的制剂№1，1：4.4×107)、壳聚糖+A型肉毒杆菌毒素(本发明的制剂№2，1：1.76×107)以及商业的肉毒杆菌毒素制剂(Xeomin，德国)将肉毒杆菌毒素灌注至肾动脉以预防动脉性高血压的效果和安全性。
在9只猪中，静脉导管必然地穿过左肾动脉和右肾动脉。每只猪的肾脏通过肾内灌注给药肉毒杆菌毒素(50U/mL)(组合物№1：3只猪；组合物№2：3只猪；商业的肉毒杆菌毒素制剂：3只猪)。安慰剂组中的3只猪用1mL的生理盐水(0.9％氯化钠的盐水)灌注至每只猪的肾动脉。所有的方案均经动物护理和使用委员会的机构(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)批准，符合实验室动物护理和使用规则。在手术后1周，所有的肾脏均被移植出。将肾脏去膜并且均质。将获得的细胞在含有100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素以及5％胎牛血清的溶液中于37℃/5％CO2下在的聚-D-赖氨酸涂覆的板中(0.1mg/mL)进行孵育。细胞通过使用含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的无血清溶液更换培养液被除去血清2h。通过使用毛喉素(forskolin)(10μM)+3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(0.5mM)1h以增加细胞内cAMP的水平来刺激肾素的释放1h。在处理之后，将培养液离心以除去细胞碎片。收集上层清液于新离心管中，并在-20℃保存至处理。通过使用试剂肾素-酶联免疫吸附试剂盒(reagentReninELISAkit)(R&DSystems，USA)对上清液中刺激的肾素含量进行分析。
在灌注手术后的1周的末尾，在上清液样本中测定了肾素浓度(％)的以下平均值：本发明的制剂№1：(1：4.4×107)-2.8±0.5％；本发明的制剂№2,，(1：1.76×107)–1.5±0.2％，商业的肉毒杆菌毒素制剂(Xeomin，德国)–4.2±1.2％；安慰剂组(0.9％氯化钠的盐水)-4.8±1.4％。没有手术相关的并发症发生。
这些数据表明灌注肉毒杆菌毒素至肾动脉以用于预防动脉性高血压是可行且安全的，并且显著地降低了血压升高过程中关键酶-肾素的释放。壳聚糖+A型肉毒杆菌毒素的组合物№2(1：1.76×107)比壳聚糖+A型肉毒杆菌毒素的组合物№1(1：4.4×107)以及商业的A型肉毒杆菌毒素制剂(Xeomin，德国)更有效。
实施例14：具有不同的毒素与壳聚糖的重量比的壳聚糖和肉毒杆菌毒素的组合物的效果
在研究壳聚糖+肉毒杆菌毒素的最佳比例时，允许根据注射位置改善肉毒杆菌毒素作用效果的特征被公开。对于更高含量的壳聚糖，组合物的延长释放功能占优势。更高含量的壳聚糖对于组合物给药至脂肪组织是合适的，其中，肉毒杆菌毒素的治疗浓度能够通过缓慢释放而达到。
相反，当组合物被给药至如肾动脉和心室肌的目标区域中时，这些区域与血液供应系统存在直接联系，这要求快速地达到治疗浓度以及增加与肉毒杆菌毒素的接触。这种需求通过减少壳聚糖的质量比来满足，这反过来又导致组合物的粘接功能占优势。
如图3中所示，当制剂中的壳聚糖的浓度增加时，即当组合物中的肉毒杆菌毒素与壳聚糖的重量比降低(从1：1.76×107(№2)至1：4.4×107(№1))时，肉毒杆菌毒素的释放比率以及图谱(profile)也改变了，并且相应的，靶向位置的有效性也改变了，而作用持续时间有轻微变化。然而，其有效性仍为商业的肉毒杆菌毒素制剂的有效性的两倍。
当进行心内膜心肌注射时，相对于在心外膜脂肪垫中的肉毒杆菌毒素注射，肉毒杆菌毒素要稀释更多倍。据此，壳聚糖+肉毒杆菌毒素的心外膜注射需要另一种浓度比(接近于1：4.4×107)，这允许获得更好的有效性和减少严重不良事件的风险，然而心内膜心肌注射需要接近于1：1.76×107的浓度比以允许获得在靶向位置中获得治疗浓度。
该事实通过比较根据实施例12中所描述的手术的1：4.4×107和1：1.76×107的浓度比的效果进行了确认。在手术后的第2周，所有的狗表现迷走神经响应被彻底消除。在第2周，分别地，诱导AF的刺激的阈值在浓度比为1：4.4×107的组中从基线处的5.1±0.8V增加至了8.3±3.1V，在浓度比为1：1.76×107的组中从基线处的4.9±1.1V增加至了15.8±2.4V(p<0.05)。

Claims (22)

1.一种组合物，该组合物含有肉毒杆菌神经毒素和选自由壳聚糖和那曲肝素所组成的组中的黏多糖，以及药学上可接受的赋形剂；其中，肉毒杆菌神经毒素与黏多糖的重量比为约1：103至约1：109。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述黏多糖为壳聚糖。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述壳聚糖具有约100kDa至约1000kDa的平均分子量(Mw)。
4.根据权利要求2或3所述的组合物，其中，所述壳聚糖具有约85％至约100％的脱乙酰度。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的组合物，其中，肉毒杆菌神经毒素与黏多糖的重量比为约1：106至约1：108。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的组合物，其中，肉毒杆菌神经毒素与黏多糖的重量比为约1：1.5×107至约1：5×107。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的组合物，其中，所述肉毒杆菌神经毒素为A型肉毒杆菌神经毒素。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的组合物，其中，该组合物中含有以下成分：
A型肉毒杆菌毒素1-200U/mL
黏多糖0.1-50mg/mL
盐水0.1-50mL。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的组合物，其中，该组合物含有约20-200UI的肉毒杆菌毒素。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的组合物，其中，所述组合物用作药剂。
11.根据权利要求1-9中任意一项所述的组合物，其中，所述组合物为药物制剂。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述组合物为可注射的制剂。
13.根据权利要求1-12中任意一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步含有至少一种I类、II类或III类的抗心律失常药物。
14.根据权利要求1-13中任意一项所述的组合物在预防和/或治疗心律失常或动脉性高血压中的应用。
15.根据权利要求14所述的组合物的应用，其中，所述组合物用于预防或治疗心房纤维性颤动。
16.根据权利要求14-15中任意一项所述的组合物的应用，其中，所述组合物被给药至心肌内的GPs、心外膜脂肪垫或肾动脉。
17.一种预防和/或治疗受试者心律失常，特别是心房纤维性颤动或动脉性高血压的方法，该方法包括在需要的所述受试者中给药根据权利要求1-13中任意一项所述的药物制剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述组合物被给药至心肌内的GPs、心外膜脂肪垫或肾动脉。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述组合物以50UI/mL的剂量在至少一个心外膜脂肪垫中进行给药。
20.根据权利要求17-19中任意一项所述的方法，其中，所述组合物与至少一种I类、II类或III类的抗心律失常药物联合给药。
21.一种药用试剂盒，该药用试剂盒包括隔室形式的第一室或一系列室以及第二室或一系列室，其中，第一室或一系列室包括根据权利要求1-13中任意一项所述的组合物，第二室或一系列室包括具有使用说明书的注射用注射器。
22.一种用于制备根据权利要求1-13中任意一项所述的组合物的药用试剂盒，该药用试剂盒包括隔室形式的第一室或一系列室以及第二室或一系列室，其中，第一室或一系列室包括肉毒杆菌毒素溶液，第二室或一系列室包括具有使用说明书的壳聚糖粉末和任选的用于制备制剂的小瓶。
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