CN105203664A - 一种酒中edta的lc-ms/ms正离子模式检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食品（尤其是酒类）中EDTA的LC-MS/MS正离子模式检测方法，包括如下步骤：S1.待测样品预处理：S11.吸取待测样品于可密闭的容器中，加入20.0mg/L的苯硼酸溶液和10%胺类甲醇溶液（优选为10%异丁胺甲醇溶液），密闭混匀处理；S12.步骤S11得到的溶液过0.1μm～0.5μm微孔滤膜，得滤液；S2.取滤液至进样瓶，再加入胺类甲醇溶液，充分摇匀后，由液相色谱串联质谱测定。该方法可定性定量分析检测酒类等食品中的EDTA，稳定性好、准确、灵敏，定性限为0.0001mg/kg，定量限为0.001mg/kg；而且检测方法简单、避免了方法误差，耗时短、低能耗，推广应用前景好。

Description

一种酒中 EDTA 的 LC-MS/MS 正离子模式检测方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域。更具体地，涉及一种酒中EDTA的LC-MS/MS正离子模式检测方法。

背景技术

乙二胺四乙酸（EDTA）是一白色结晶颗粒或粉末状，难溶于水，常温下易与铁、铜、钙等多种金属的多价离子形成稳定的水溶性络合体，以防止微量的金属多价离子引起的变色、变质、及维生素C等营养物质的氧化、损失。近年来，EDTA作为一种新型的抗氧化剂添加到酒类等食品中，达到保护营养成份、增加稳定性的作用。

但是，EDTA对人体会产生多种负面作用，如刺激皮肤、黏膜、引起哮喘、皮肤发疹等等，是一种可能引起过敏的物质，被摄取后会引起钙缺乏症、血压降低、肾脏障碍、染色体异常和原生变异等一系列有害作用。

因此，对于食品中EDTA的检测，尤其是对于微量EDTA的检测，至关重要。目前，目前常用的检测方法包括高效液相色谱法、气相色谱法、离子色谱法和毛细管电泳法等，但是，都存在操作复杂、耗时长、高能耗、检测灵敏度低的问题，尤其是检测灵敏度低的问题，无法满足大部分的含有微量EDTA的食品的检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有食品中EDTA检测技术的缺陷和不足，目的是提供一种食品中EDTA的LC-MS/MS检测方法，该方法使用液相色谱-串联质谱仪检测，采用苯硼酸作为衍生剂以消除酒中糖类的基质干扰，使得质谱响应度获得显著提高，本方法尤其适用于酒中EDTA的测定。

本发明另一目的是提供所述EDTA的LC-MS/MS检测方法的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种食品中EDTA的LC-MS/MS正离子模式检测方法，包括如下步骤：

S1.待测样品预处理

S11.吸取待测样品于可密闭的容器中，加入20.0 mg/L的苯硼酸溶液和10%胺类甲醇溶液，密闭混匀处理；

S12.步骤S11得到的溶液过0.1μm～0.5μm微孔滤膜，得滤液；

S2.取滤液至进样瓶，再加入胺类甲醇溶液，充分摇匀后，由液相色谱串联质谱测定。

其中，优选地，步骤S11中，待测样品：苯硼酸溶液：胺类甲醇溶液的体积比=0.5～2：0.5～2：6～10。

更优选地，步骤S11中，待测样品：苯硼酸溶液：胺类甲醇溶液的体积比=1：1：8。

优选地，步骤S11所述混匀处理的具体方法为：800rpm/min～2000rpm/min常温恒温振荡15min～25min，或800rpm/min～2000rpm/min常温恒温涡旋2min～3min，或800W～2000W，30～80Hz条件下超声2min～3min。

更优选地，步骤S11所述混匀处理的具体方法为：1000rpm/min常温恒温振荡20min，或1000rpm/min涡旋2min，或1500W，50～60Hz条件下超声2min。

最优选地，步骤S11所述混匀处理的具体方法为：1000rpm/min常温恒温摇床振荡20min。

优选地，步骤S12所述微孔滤膜的孔径为0.2 μm。

优选地，步骤S13所述滤液和胺类甲醇溶液的体积比为0.05～0.2：0.4。

更优选地，步骤S13所述滤液和胺类甲醇溶液的体积比为0.1：0.4。

另外优选地，上述胺类甲醇溶液为伯胺、仲胺或叔胺甲醇溶液。

更优选地，上述胺类甲醇溶液为伯胺甲醇溶液。

最优选地，上述胺类甲醇溶液为异丁胺甲醇溶液。

进一步具体地，作为一种可实施的优选方案，步骤S2所述液相色谱串联质谱测定的条件如下：

（1）色谱条件：

1）色谱柱：Phenomenex Gemini C18，粒径5 μm，50 mm×4.6 mm；

2）进样量：2 μL；

3）柱温：35 ℃；

4）流速：0.2 mL/min；

5）流动相：水10v/v%，甲醇80 v/v%，0.1%异丁胺甲醇溶液10 v/v%；

6）洗脱条件：平衡5 min，等度洗脱5 min；

（2）质谱条件：

1）离子化方式：电喷雾电离；

2）扫描方式：正离子扫描；

3）检测方式：多反应监测，即MRM；

雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求；

4）监测离子对如下表所示：

表中的*为定量离子对。

利用本发明的检测方法检测EDTA的过程中，当需要定量检测EDTA含量时，以标准品的特征离子中信号响应高且无干扰的离子为定量离子，进行外标法定量分析（定量离子对为293.0/160.1）；以标准溶液的响应峰面积为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程（标准曲线应至少包含5个浓度点，包括零点）；依据测定的待测样品响应峰面积，在标准曲线上查出或回归方程计算出样品中EDTA的含量。

具体的计算方法为：根据标准曲线数据及样品的峰面积数据，通过软件处理可以得到样品中EDTA的质量浓度，单位为mg/L，而我国GB2760-2011规定饮料中EDTA的残留量是以EDTA-2Na计，故样品中EDTA-2Na的质量浓度（mg/kg）按如式（1）计算：

（1）

式中：

W——样品中每1 kg待测样品中EDTA-2Na的残留量，单位为毫克(mg/kg)；

C——样品待测溶液中EDTA-2Na的浓度，单位为毫克每升（mg/L)；

ρ——样品的密度，单位为千克每升（kg/L)；

f——测定时稀释倍数；

1.274——EDTA-2Na与EDTA的摩尔质量比。

另外，当只需定性检测EDTA时，在相同测试条件下，样品中待检测物质与同时检测的标准品应具有相同的保留时间，偏差在±2.5%之内；样品中待确证的化合物的二对特征离子的相对丰度比应与同时检测的标准品一致，相对误差在±30%。样品的LC-MS/MS数据符合下列要求时，可判定为阳性：

a：在相同试验条件下，样品中待测物质与标准品具有相同的保留时间，偏差在±2.5 %以内；

b：监测离子的信噪比应≥3；

c：如果达到前两项要求，则计算3个不同的比值。并且在样品含量对应的水平下同时计算被测物标准响应离子的比值，对未知样品阳性结果的定性鉴定，所得到的离子比率应在如表2规定范围内；

表2 所应用的各种质谱相对离子强度最大允差

另外，由于本方法中用到易燃有毒化学品，例如甲醇，应避免吸入其蒸汽或直接与皮肤接触，处理此类物质时可在通风橱内操作，必要时可佩带防护手套、防护镜或防毒面具。

为了更准确稳定的控制检测质量，每一测定批次应使用已知量的样本做测定结果的控制试验，做空白样品和添加5.00 mg/kg水平标准的空白样品；被测物中EDTA的回收率正常范围应在60.0～120%，变异系数<30%。

本发明上述的检测方法在检测酒或低糖类非酒精饮料中EDTA含量方面的应用，也应在本发明的保护范围之内。

优选地，是在检测酒中EDTA含量方面的应用。

最优选地，所述酒为葡萄酒、啤酒或白酒。

本发明具有以下有益效果：

本发明检测方法对待测样品的预处理方法具有以下显著的优势：

（1）正离子模式实现了EDTA的准确检测；

（2）解决了高糖含量基质效应；

（3）一步法处理解决了现有方法耗时长、高能耗的问题，以及高浓度无机盐基质的问题。

本发明方法的样品预前处理仅需要量取三种既定浓度的物质（包括样品、伯胺溶液和苯硼酸），而且三种溶液的总用量只需0.5～1.5 mL（具体视实际进样瓶的需求），即可实现高达90%～105%的回收率，既快速，准确度又高，定性检测限为0.0001mg/kg，定量检测限为0.001mg/kg，应用本方法可以解决现有方法检测限过高，无法测定低浓度EDTA的问题。

另外，本发明检测手段也无需应用复杂的分离萃取手段，避免了方法误差。

而且，本发明检测过程不需要使用 Fe(III) (b)和 Cu(II)无机盐，避免了难挥发物质对质谱检测仪以及检测结果的影响。

附图说明

图1为标准品的MRM离子色谱图。

图2为EDTA的线性曲线。

图3为伯胺、仲胺、叔胺以及空白溶剂解螯合后离子对峰面积比较。

图4为EDTA的强螯合物 Fe(III) (a)和Cu(II) (b)对检测结果的影响。

图5为麦芽糖对检测结果的影响。

图6为苯硼酸对检测结果的影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例所用到的仪器和设备：

（1）液相色谱-质谱/质谱联用仪：API4000 Q TRAP（AB SCIEX公司，美国）；

（2）电子天平：精确到0.01 mg，0844cf0173-1（华南国家计量测试中心广东省计量科学研究院）；

（3）水浴摇床：（上海安普科学仪器公司）；

（4）微孔滤膜：0.2 μm（上海安普科学仪器公司）；

（5）移液枪：5 mL, 1000 μL, 100 μL, Transferpette^® S（Brand公司，德国）；

（6）带螺盖耐热试管或者其他能够密封的耐热试管：20 mL；

（7）注射器：1 mL, 2 mL。

以下实施例所用到的试剂与溶液：

（1）水为去离子水；

（2）EDTA：购自国家标准物质研究中心，纯度为≥99.99%，结构为：；

（3）异丁胺：色谱纯；

（4）苯硼酸：色谱纯；

（5）0.1%异丁胺-甲醇溶液：量取异丁胺1.00 mL，加甲醇定容至1000 mL，充分摇匀备用；

（6）10%异丁胺-甲醇溶液：量取异丁胺50.00 mL，加甲醇定容至500 mL，充分摇匀；

（7）100.0 mg/L苯硼酸储备溶液：准确称取苯硼酸5.0 mg，溶于水中，完全溶解后定容至50 mL，4℃低温下保存，保存期为三个月；

（8）20.0 mg/L苯硼酸溶液：准确量取100.0 mg/L苯硼酸储备溶液10.0 mL，加水定容至50 mL；

（9）250.0 mg/L EDTA标准储备溶液：准确称取EDTA标准品12.5 mg，用10%异丁胺甲醇溶液溶解并定容至50 mL，4℃低温下保存，保存期为三个月；

（10）EDTA的中间液：用10%异丁胺-甲醇溶液逐级稀释EDTA标准储备溶液，制成浓度为50.00 mg/L、25.00 mg/L、10.00 mg/L、5.00 mg/L、2.50 mg/L、0.50 mg/L、0.25 mg/L、0.1 mg/L和0.05 mg/L的各级EDTA中间液。

实施例 1 待测样品中 EDTA 的 LC-MS/MS 测定方法

1、待测样品预处理

（1）用1000 μL移液枪吸取1.00 mL待测啤酒样品，置于带密闭的耐热试管，加入1.00 mL的20.0 mg/L苯硼酸溶液和8.00 mL的10%异丁胺甲醇溶液，置于水浴摇床中常温恒温振荡20.0 min；

（2）用1.0 mL注射器过0.2 μm微孔滤膜；

（3）取0.20 mL以上溶液至进样瓶，再加入0.80 mL10%异丁胺甲醇溶液，充分摇匀后，由液相色谱串联质谱测定。

此处需要强调的是，加入苯硼酸进行衍生化反应时，必须摇床振荡足够长时间以保证啤酒中的糖类与苯硼酸充分反应，最大限度减弱糖类的基质干扰，提高EDTA的质谱响应度，获得准确实验结果。

另外，同时用1.00 mL 12%的乙醇水溶液代替待测啤酒样品，按照相同的方法处理，作为空白试验（对照组）。

2、标准工作溶液的制备

（1）分别取1.00 mL的50.00 mg/L、25.00 mg/L、10.00 mg/L、5.00 mg/L、2.50 mg/L、0.50 mg/L、0.25 mg/L、0.1 mg/L和0.05 mg/L的各级EDTA中间液，置于带密闭的耐热试管，加入1.00 mL的20.0 mg/L苯硼酸溶液和8.00 mL的10%异丁胺甲醇溶液，置于水浴摇床中60 ℃恒温振荡20.0 min；

（2）用1.0 mL注射器过0.2 μm微孔滤膜；

（3）取0.20 mL以上溶液至进样瓶，再加入0.80 mL10%异丁胺甲醇溶液，充分摇匀后得到浓度分别为1.00 mg/L、0.50 mg/L、0.20 mg/L、0.10 mg/L、0.05 mg/L、0.01 mg/L、0.005 mg/L、0.002 mg/L和0.001 mg/L的EDTA标准工作溶液，由液相色谱串联质谱测定。

3、仪器参数及测定条件

（1）色谱条件：

1）色谱柱：Phenomenex Gemini C18（粒径5 μm，50 mm×4.6 mm），或相当者；

2）进样量：2 μL；

3）柱温：35 ℃；

4）流速：0.2 mL/min；

5）流动相：水10%，甲醇（5.1）80%，0.1%异丁胺甲醇溶液（5.5）10%；

6）洗脱条件：平衡5 min，等度洗脱5 min。

（2）质谱条件：

1）离子化方式：电喷雾电离；

2）扫描方式：正离子扫描；

3）检测方式：多反应监测（MRM）；

雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求。

4）监测离子对如表1所示。

表1 EDTA监测离子对

注：*为定量离子对。

4、色谱分析

吸取2 μL试样注入液相色谱-质谱/质谱联用仪，在上述质谱条件下测定试样的响应峰面积（应在仪器检测的线性范围内）。按ESI⁺选择离子模式进样，对标准进行扫描，得到标准品的MRM离子色谱图，如附图1所示。

5、定性定量测定

（1）定性标准

在相同测试条件下，样品中待检测物质与同时检测的标准品应具有相同的保留时间，偏差在±2.5%之内；样品中待确证的化合物的二对特征离子的相对丰度比应与同时检测的标准品一致，相对误差在±30%。

（2）定量方法

以各标准品的特征离子中信号响应高且无干扰的离子为定量离子，进行外标法定量分析（定量离子对为293.0/160.1）。以标准溶液的响应峰面积为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。标准曲线应至少包含5个浓度点（包括零点）。依据测定的待测样品响应峰面积，在标准曲线上查出（或回归方程计算出）样品中EDTA的含量。

6、结果的计算

（1）定性的确证分析

样品的LC-MS/MS数据符合下列要求时，可判定为阳性：

a：在相同试验条件下，样品中待测物质与标准品具有相同的保留时间，偏差在±2.5 %以内。

b：监测离子的信噪比应≥3。

c：如果达到前两项要求，则计算3个不同的比值。并且在样品含量对应的水平下同时计算被测物标准响应离子的比值，对未知样品阳性结果的定性鉴定，所得到的离子比率应在如表2规定范围内。

表2 所应用的各种质谱相对离子强度最大允差

（2）定量的计算公式及表述

根据标准曲线数据及样品的峰面积数据，通过软件处理可以得到样品中EDTA的质量浓度，单位为mg/L，而我国GB2760-2011规定饮料中EDTA的残留量是以EDTA-2Na计，故样品中EDTA-2Na的质量浓度（mg/kg）按如式（1）计算：

（1）

式中：

W——样品中每1 kg待测样品中EDTA-2Na的残留量，单位为毫克(mg/kg)；

C——样品待测溶液中EDTA-2Na的浓度，单位为毫克每升（mg/L)；

ρ——样品的密度，单位为千克每升（kg/L)；

f——测定时稀释倍数；

1.274——EDTA-2Na与EDTA的摩尔质量比。

7、检测方法评价

（1）相关系数

线性曲线如图2所示，线性曲线在EDTA含量为0.001mg/kg～1mg/kg的浓度范围内，响应值与质量浓度呈良好的线性关系。所得标准品的回归方程为 y=4.56×10⁶x-4032，相关系数为0.994。

（2）测定限

实验以空白测量的3倍标准差为测定低限，10倍标准差为定量检测限，平行测定3次取平均值，得出所建立的液相色谱-串联质谱法的检出限。

如上，回归系数R ²> 0.99，测定结果显示，该方法的定性限（三倍信噪比）为 0.0001 mg/kg，定量限（10倍信噪比）为0.001 mg/kg，应用本方法可以解决现有方法检测限过高，无法测定低浓度EDTA的问题。

（3）回收率

另外，针对不同类型的酒类样品，准确量取已知EDTA含量的供试样品，再分别加入一定量的EDTA标准样品5.00 mg/L、10.00 mg/L、25.00 mg/L，按上述方法，计算出样品的峰面积，计算加标回收率，结果如表3所示。

由该实验结果得到，各种酒中EDTA的平均回收率范围在75.6%～97.2%之间。

表3 不同基质中EDTA不同添加水平回收率

（4）精密度

测定同一啤酒样品中EDTA含量（添加浓度为5.00 mg/L、10.00 mg/L、25.00 mg/L），反复测定5次，根据样品的峰面积，计算该测定方法的精密度。

实验结果如表4所示，本方法检测的变异系数小于10%。

表4 EDTA测定方法的精密度

实施例 2 不同酒类样品中 EDTA 的测定

1、（1）利用实施例1所述待测样品预处理的方法预处理各类酒类样品后，再按照实施例1所述的仪器参数及测定条件，进行液相色谱串联质谱测定，最后计算出待测酒类样品中的EDTA含量。

所用各种酒类样品均为市购。

（2）根据现有国际标准对酒样品质量的鉴定，GB2760-2011规定饮料中EDTA残留量不得超过30 mg/kg，如果所测样品中EDTA-2Na质量浓度的计算结果超过30 mg/kg则可鉴定为不合格产品。

2、检测结果如表5所示，测定了几十个进出口和国产啤酒、葡萄酒的样品，发现虽然这些样品都符合国际标准，但是大部分存在添加的情况，对人体健康存在潜在影响，值得引起警惕。

表5 不同进出口和国产啤酒、葡萄酒的样品的实测值

注：表中“合格*”是指EDTA符合目前的GB2760-2011标准。

实施例 3 伯胺类物质对测定结果的影响——正离子模式实现 EDTA 的准确检测

1、本发明检测方法对样品的预处理中，应用伯胺类物质对EDTA-过度金属进行解螯合，避免了溶液中金属离子对EDTA含量的干扰。

在LC/MS-MS中应用了正离子和负离子两种电离模式下，Q1扫描中都检测不到EDTA-金属螯合物，说明EDTA-过度金属被解螯合了，同时通过实验证明胺类化合物的解螯合能力，结果为伯胺>仲胺>叔胺，如附图3所示。

其次，应用不同浓度的Fe(III) 和 Cu(II)进行干扰实验时，样品中EDTA的回收率为88%～105%之间，如附图4所示，说明这两种与EDTA具有强螯合力的金属离子对回收率没有显著影响，可见其它弱结合能力的低浓度金属更加不会对结果产生影响。

实施例 4 苯硼酸对测定结果的影响——解决高糖含量基质效应

1、糖是一种粘性的高沸点物质，糖液滴所形成的水层对质谱检测器中待检物质在正负离子模式下的库伦爆炸具有强烈的负面影响，如附图5所示。

2、待测样品预处理时，按照上述实施例的样品预处理方法，使用不同浓度的苯硼酸，探索苯硼酸对测定结果的影响。

结果如附图6所示，在添加一定浓度的苯硼酸后，啤酒和葡萄酒中EDTA的回收率高达90%～105%，说明苯硼酸有效的促进了液滴的库伦爆炸，使EDTA被充分离子化而被检测出来。

因此综上所述，本发明检测方法对待测样品的预处理方法具有以下显著的优势：（1）正离子模式实现了EDTA的准确检测；（2）解决了高糖含量基质效应；（3）一步法处理解决了现有方法耗时长、高能耗的问题，以及高浓度无机盐基质的问题。

本发明方法的样品预前处理仅需要量取三种既定浓度的物质（包括样品、伯胺溶液和苯硼酸），即可实现高达90%～105%的回收率，既快速，准确度又高，而且三种溶液的总用量在0.5～1.5 mL（具体视实际进样瓶的需求）；另外，检测手段也无需应用复杂的分离萃取手段，避免了方法误差。

此外，本发明检测过程并不需要使用 Fe(III) (a)和 Cu(II) (b)无机盐，避免了难挥发物质对质谱检测仪以及检测结果的影响。

Claims (10)

1.一种食品中EDTA的LC-MS/MS正离子模式检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.待测样品预处理

S11.吸取待测样品于可密闭的容器中，加入20.0mg/L的苯硼酸溶液和10%胺类甲醇溶液，密闭混匀处理；

S12.步骤S11得到的溶液过0.1μm～0.5μm微孔滤膜，得滤液；

S2.取滤液至进样瓶，再加入胺类甲醇溶液，充分摇匀后，由液相色谱串联质谱测定。

2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S11中，待测样品：苯硼酸溶液：胺类甲醇溶液的体积比=0.5～2：0.5～2：6～10。

3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S11所述混匀处理的具体方法为：800rpm/min～2000rpm/min常温恒温振荡15min～25min，或800rpm/min～2000rpm/min常温恒温涡旋2min～3min，或800W～2000W，30～80Hz条件下超声2min～3min。

4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S13所述滤液和胺类甲醇溶液的体积比为0.05～0.2：0.4。

5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述胺类甲醇溶液为伯胺、仲胺或叔胺甲醇溶液。

6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，优选地，所述胺类甲醇溶液为伯胺甲醇溶液。

7. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述胺类甲醇溶液为异丁胺甲醇溶液。

8. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S2所述液相色谱串联质谱测定的条件如下：

（1）色谱条件：

1）色谱柱：Phenomenex Gemini C18，粒径5 μm，50 mm×4.6 mm；

2）进样量：2 μL；

3）柱温：35 ℃；

4）流速：0.2 mL/min；

5）流动相：水10v/v%，甲醇80 v/v%，0.1%异丁胺甲醇溶液10 v/v%；

6）洗脱条件：平衡5 min，等度洗脱5 min；

（2）质谱条件：

1）离子化方式：电喷雾电离；

2）扫描方式：正离子扫描；

3）检测方式：多反应监测，即MRM；

雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求；

4）监测离子对如下表所示：

表中的*为定量离子对。

9. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，当定量检测EDTA含量时，以标准品的特征离子中信号响应高且无干扰的离子为定量离子，进行外标法定量分析；以标准溶液的响应峰面积为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程；依据测定的待测样品响应峰面积，在标准曲线上查出或回归方程计算出样品中EDTA的含量。

10. 权利要求1～9任一所述的检测方法在检测酒类或低糖类非酒精饮料中EDTA含量方面的应用。