CN105198870A

CN105198870A - 一种抑制玉米内州萎蔫病菌生长的化合物

Info

Publication number: CN105198870A
Application number: CN201510722714.8A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-10-31
Filing date: 2015-10-31
Publication date: 2015-12-30

Abstract

本发明发现对玉米内州萎蔫病菌具有抑菌和杀菌活性的化合物。其玉米内州萎蔫病菌的最小抑菌浓度MIC值为16μg/mL，最小杀菌浓度MBC值为32μg/mL。

Description

一种抑制玉米内州萎蔫病菌生长的化合物

技术领域

本发明涉及化合物的新用途，阐明药物化学结构与细菌的生物活性之间的关系，更具体的说，是探索化合物对玉米内州萎蔫病菌的抑菌和杀菌活性。

背景技术

玉米内州萎蔫病菌又称玉米细菌性萎蔫病菌，是一种造成严重农业经济损失的植物病害。1969年，该病首次在美国内不拉斯加州道森县发生，之后陆续蔓延到科罗拉多州、伊利诺斯州、爱荷华州、肯萨斯州、密歇根州、明尼苏达州、内布拉斯加州、南达科他州和威斯康星州，2000年已经扩散至加拿大的安大略湖区。萎蔫病的危害性和分布区域的扩张蔓延引起人们的重视，欧盟、加拿大等国都已经建立了该病的风险评估体系，我国也于2007年将该病菌列入进境植物检疫性有害生物名录

据报道，1976年美国内布拉斯加州由于玉米细菌性萎蔫病大发生，造成玉米损失300多万吨，损失率达50%。相关研究人员研究了42个杂交玉米品种的发病严重程度同产量损失的关系，发现该病发生严重时可使产量损失高达43%。据报道，若玉米3~5叶期发病，病情发展较快、损失大，后期发病则损失相对较小

玉米细菌性萎蔫病有两种主要表现形式，一为叶片萎蔫，二为系统枯萎。该病在叶片上最初为不连续的水渍状斑点，初为暗绿色至黑色，后变褐色，与叶脉平行，表面常有细菌溢脓。系统侵染时，维管束变色，根和近地面的茎秆干腐或水渍状褐腐。玉米幼苗和成株均可发病。细菌通过伤口侵染，也可直接通过叶片侵染或者细嫩植株的根和茎秆系统侵染引起发病。苗期侵染引起萎蔫、死亡，后期侵染造成植株矮化，叶片上出现灰白色或黄绿色条纹，条纹边缘波浪形或不规则形，有时有黑色斑点，最后干枯。玉米细菌性枯萎病与玉米细菌性萎蔫病在症状上极为相似，都表现为植株矮缩和萎蔫、病斑由不规则水渍状逐渐变为褐色、叶片卷缩枯死、有菌脓流出，目前对于二者的区分主要依赖病原菌的分离检测和鉴定。

玉米细菌性萎蔫病菌为棒杆状，不固酸，不产抱，无鞭毛，不运动，大小为0.5×1~2μm，不形成链状或菌丝体，菌体单生，不产生可溶性色素。细胞壁中含2，4-二氨基丁酸、甘氨酸、半乳糖和海藻糖。DNA中G+C摩尔含量为73.5%。病菌在营养琼脂培养基或NBY或CNS培养基上形成杏红色或橘红色菌落，圆形、黏性、隆起、有光泽且边缘整齐。在PDA培养基上，菌落白至奶油色，添加维生素Bl后可加快生长和促进橙色色素产生。

玉米细菌性萎蔫病菌有较高的寄主特异性。自然状态下，主要感染马齿形玉米、甜玉米、硬粒玉米和爆花玉米，也可侵染狗尾草和二色高粱。在人工接种条件下可侵染高粱、甘蔗、东鸭茅状摩擦草、苏丹草、甘蔗和墨西哥假蜀黍等。

玉米萎蔫病多发区的主要侵染源是地表被侵染的玉米叶、茎秆、穗轴和穗等越冬病残组织。在田间，病菌可随水流近距离传播。远距离病菌传播主要依靠玉米子粒。病菌在种子中至少存活1年，在严重感病的子粒上，病菌存在于盾片与胚乳之间的合点区及胚的附近，并从种子传给种苗引起发病。最近证实，玉米萎蔫病菌的种子感病率在17.1%~30.7%之间，真空抽滤接种，种苗发病率为0.1%~0.4%。病原菌主要通过伤口侵入，也可直接侵染健全的叶片、根和茎。风沙、冰雹、暴风雨及大风造成的伤口均有利于病原菌的侵染。美国内布拉斯加州的玉米种植区大部分是砂壤土，风暴造成伤口及喷灌是该州玉米萎蔫病发生比较严重的主要原因之一。

发明内容

本发明采用体外抗菌试验，研究化合物对玉米内州萎蔫病菌的生物活性。

本发明的具体技术方案如下：

本发明的创新点是发现化合物对玉米内州萎蔫病菌有良好的抑菌和杀菌活性，并测量得到其最小抑菌浓度MIC值和最小杀菌浓度MBC值，属于首次公开。

所述化合物结构特征如下式所示：

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步详细地说明本发明。应理解下面实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施实例1

测量最小抑菌浓度MIC值。

（1）营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121℃高压蒸汽灭菌20min待用。

（2）营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前121℃高压蒸汽灭菌20min待用。

（3）菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基l0mL，放在已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细菌培养24h，培养温度为28℃。

（4）菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取50μL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28℃。培养后，单个活细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。

计算公式为：菌液浓度=n×20×100cfu/mL

（5）药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存放于4℃冰箱保存待用。

（6）最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC）的测定：采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度MIC（MinimalInhibitoryConcentration）。MIC为最小抑菌浓度，即药物与一定浓度的菌液作用后，能够抑制可见菌生长的最低浓度。

采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、32、64、128和256μg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100μL不同浓度的药液和100μL菌液，使最终菌液浓度为1~5×10⁵cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28℃培养24h，以肉眼观察药物最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC，每个实验重复三次。

测得最小抑菌浓度MIC值为16μg/mL。

实施实例2

测量最小杀菌浓度MBC值。

（4）菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取50μL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28℃。培养后，单个活细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数；计算公式为：菌液浓度=n×20×100cfu/mL。

（6）最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC）的测定：采用微量肉汤稀释法测定最小杀菌浓度MBC（MinimalBactericidalConcentration）。在MIC基础上，从每管吸取10μL溶液，点于固体培养基上，继续按MIC培养条件下培养，以完全杀灭细菌的最低浓度为最小杀菌浓度（菌落数小于等于5）。

采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、32、64、128和256μg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100μL不同浓度的药液和100μL菌液，使最终菌液浓度为1~5×10⁵cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28℃培养24h，以肉眼观察药物最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC。将上述未见生长细菌的各孔中的肉汤取10μL接种于营养琼脂平板上，做好标记，于28℃培养24h，以仍无细菌生长的管内药物浓度记为该药的MBC，每个实验重复三次。

测得最小杀菌浓度MBC值为32μg/mL。

Claims

1.一种抑制玉米内州萎蔫病菌生长的化合物，其特征在于：

（1）结构特征如下式所示：

（2）其可作为玉米内州萎蔫病菌的抑制剂和杀菌剂；

（3）其对玉米内州萎蔫病菌的最小抑菌浓度MIC值为16μg/mL；

（4）其对玉米内州萎蔫病菌的最小杀菌浓度MBC值为32μg/mL。