SU1717156A1 - Штамм бактерий BacILLUS SUвFILIS дл получени препарата против возбудителей заболеваний хлопчатника - Google Patents

Abstract

Использование: микробиологическа  промышленность, получение средств защиты растений, в частности хлопчатника, от возбудителей заболеваний. Штамм выращивают на сусло-агаре при рН 6.8-7,0 в течение 7-10 сут .при 28-32°С, смывают выросшие колонии физиологическим раствором и готов т суспензию с тиром (2-3)v «10 кл./мл. В суспензию внос т криолро- тектор (сахарозожелатиновую среду) и лио- филизируют. Дл  обработки сем н хлопчатника лифилизированную культуру разбавл ют водой до содержани  5,0«10 - 1, кл./м . Дл вбработки 1 т сем н хлопчатника используют 500-700 л рабочей суспензии. Препарат на основе штамма позвол ет защитить хлопчатник от возбудителей кормовой гнили на 93-94%, вертициллезного вилта на 85.2-86%. 7 табл.. со С

Description

Изобретение относитс  к сельскому хоз йству , а именно к защите растений хлопчатника от поражени  фито патогенными грибами.i

В качестве наиболее распространён-: ного метода предупреждени  грибных болезней хлопчатника используетс  протравливание сем н химическими препаратами (формалином, бропокотом, бропЬко- том с ксантаном, бропокотом с ГМТД). Известен способ предпосевной обработки сем н хлопчатника синтетическим препаратом с целью повышени  сем н.

Однако химические способы имеют р д существенных недостатков: высока  токсичность дл  человека и животных, накапливание в почве и растени х остаточных количеств  довитых веществ, сложна  технологи  протравливани , неэффективность против загнивани  сем н, гнили проростков и корневой гнили всходов; высока  сто- имостьидр.;

Известны биологические способы борьбы с различными болезн ми растений, в том числе вызываемыми грибами. Способ борьбы с черной ножкой, корневой гнилью, шей- ковой гнилью основан на использовании препарата из Irichoderma ha rzlanum T - 315 (АТСС № 20671).;

Однако они не эффективны дл  защиты растений хлопчатника от таких болезней, как вертициллеэный вилт, фузариозное ув дание и др.

Наиболее близким к изобретению  вл етс  способ применени  Bacillus polymyxa 9А дл  защиты растений от вертициллезноXI xl

сл о

го ув дани . В. polymyxa 9A, выделенна  из корней растений картофел , росших на участках , сильно зараженных Vertlclllium dahllae. обладает способностью подавл ть развитие вертициллезного ув дани  на таких культурах, как картофель и хлопчатник. В. polymyxa может быть использована в форме водных и неводных препаратов. Водные препараты содержат 105 - 109 кл/мл, а пасты Ю9 кл/мл. Неводные препараты включают дусты, смачивающие порошки , гранулы, эмульгоконцентраты. Рабочие составы могут примен тьс  в виде растворов , гранул, дуста. Чаще всего составы используют дл  непосредственной обработки семен и семенного материала, хот  не исключаетс  возможность обработки почЪы вокруг посадочного материала.

Однако данный способ не включает предупреждение таких болезней хлопчатника, как черна  корнева  гниль и фузариозное ув дание.

. Целью изобретени   вл етс  получение нового штамма бактерий, обладающего более широким спектром действи  к возбудител м заболеваний хлопчатника.

Поставленна  цель достигаетс  использованием дл  предпосевного увлажнени  сем н хлопчатника суспензии полученной новой живой культуры Bacillus subtilis 26D с содержанием 5 108 - 1«109 кл/мл, примен емой в количестве 0,5-0,7 л на 1 кг сем н при экспозиции 12-18 ч.

Штамм В.subtilis 26D получен из внутренних тканей стебл  здорового растени  хлопчатника в лабораторных услови х. После предварительной обработки и стерилизации поверхности стебл  стерильным скальпелем снимали кору, и небольшие кусочки стебл  помещали на поверхность питательного агара (картофельного агара) в чашку Петри. Чашки инкубировали при 28°С в течение 5-7 сут.

Штамм идентифицирован по определителю Берги (1984), на основании работ Gordon (1973), депонирован в коллекции- Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохоз йственной микробиологии под NS 128. Штамм В. subtilis 26D имеет следующие основные культурально-морфологические и биохимические признаки. Грамположитель- ные подвижные аэробные спорообразую- щие палочки с закругленными концами, продуцирующие каталазу. Образуют эндоспоры , не раздувающие клетку. Размер клеток - 1.9x0,5 мкм; в мазках 18 ч культуры клетки расположены одиночно, попарно, реже в цепочки. Споры в клетке расположены центрально, размер спор 0,9x0,5 мкм.

При культивировании штамма на МПА в течение 24 ч при образуютс  складчатые колонии в зкой консистенции, телесного цвета, кра  колонии изрезаны, На среде

Громыко (сусло-агар + МПА 1:1), рН 6,8-7,0 после 24 ч термостатировани  при 37°С образует кремово-белые колонии, складчатые, с кратерообразным центром, консистенци  в зка , кра  колонии изрезанные. Культура

0 ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, галактозу, лактозу, маннит, сахарозу с образованием кислоты без газа; не разлагает дульцйт, рамнозу. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауера, гидро5 лизует крахмал, желатину, не гидролизует мочевину; утилизирует цитрат, не использует пропионат. Не растет в анаэробных услови х , не образует включени  поли- / -оксимасл ной кислоты на среде МПА с

0 глюкозой.; не образует индол и сероводород . Не обладает лецитиназой, коагулазой, гиалуронидазой, Патогенными свойствами (токсическими, токсигенными, вирулентными ) при парентеральном и пероральном вве5 дении белым мышам не обладает.

Проверка безвредности осуществл лась следующим образом.

Лабораторным животным вводили фильтрат культуральной жидкости В.

0 subtilis 26D, выращенной в течение 10 сут на м со-пептонном бульоне при 28°С; суспензии клеток В. subtilis 26D, выращенной на м со-пептонном агаре при 28°С в течение 24 ч, суспензии инактивированных про5 греванием клеток В. subtilis 26D, выращенной в течение 24 ч на МПА при 28°С.

Проверку патогенности осуществл ли на белых мышах весом 18-20 г. Животным

0 вводили суспензии и фильтраты в желудок через зонд и в инъекци х.

В табл. f представлены результаты исследовани  токсичности фильтрата культуры В, subtilis 26D после роста на МПБ (токси5 генность культуры).

В табл. 2 приведены результаты введени  животным МПБ (контроль).

В табл. 3 приведены результаты исследовани  вирулентности культуры В. subtilis

0 26D, выращенной на МПА при 28°С в течение 24 ч.

В табл. 4 приведены результаты исследовани  токсичности инактивированных клеток культуры В. subtilis 26D.

5 Наблюдени  за животными проводили на прот жении 15 дней после окончани  курса инъекций или перорального введени . В период наблюдени  все животные были активны, хорошо поедали пищевые рационы , физиологические отправлени  у них не

нарушались, поведенческие реакции были обычными, изменений со стороны шерстного покрова не отмечалось. Динамика изменени  массы тела животных в опыте и контроле была сходной. Все подопытные и контрольные животные после окончани  срока наблюдени  были умерщвле ы, вскрыты, их органы подвергнуты макроскопическому изучению.

Результаты вскрыти  показали следую- щее.

Сердце обычной формы и величины, у подопытных животных такое же, как и у контрольных . Легкие по объему, строению долей у опытных и контрольных животных одинаковые; поверхности легких гладкие, доли легко отдел ютс  друг от друга, спа ек не отмечено. Желудок, петли тонкого и толстого кишечника внешне обычные, признаков воспалительных изменений не отмечено. При вскрытии просвета виден неизмененный (такой же. как и у контрольных животных) рисунок слизистых. Печень темно-красного цвета, среднего кровенаполнени , не увеличена. Доли отделены друг от друга, поверхности гладкие. Почки по размерам и форме, не отличаютс  у контрольных и опытных животных, поверхности гладкие, на разрезе виден четкий рисунок коркового и мозгового вещества. Селезенка не увеличена, обычной консистенции. На разрезе пульпа умеренно полнокровна, темно-красного цвета.

Введение суспензии живых, а также инактивированных клеток 24-часовой куль- туры В. subtilis 26D перорально в дозах 0,5- 1,0 млрд. микробных - клеток и внурибрюшинно в дозах 0,5-1,0 млрд. микробных клеток на мышь не вызвало у животных каких-либо признаков заболевани . Изучение внутренних органов животных не. вы вило у них признаков патологического процесса и изменений, регистрируемых макроскопически.

Введение мышам фильтрата среды рос- та (после культивировани  штамма В. subtilis 26D на м со-пептонном бульоне) не вы вило у животных патологического процесса , регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних ор- ганов животных.

Таким образом, полученные данные дают основание отнести изученный штамм к 4-му классу по классификации, приведенной в Методических указани х МЗ СССР, Главного санэпидуправлени  Постановка исследований дл  обосновани  предельно допустимых концентраций производственных штаммов и на их основе готовых форм препаратов..., т.е. к микроорганизмам,

практически не обладающим аллергенным и общетоксическим действием.

Культура В. subtilis 26D пересеваетс  на среде Громыко (сусло-агар + МПА 1:1), сусло-агаре, среде Гаузе № 2; рН 6,8-7,0. Растет при 10-50°С, температурный оптимум 37°С.

Хранитс  культура на среде Громыко, либо среде Гаузе М 2, либо картофельном агаре в течение 2-3 мес при комнатной температуре , а под слоем стерильного минерального масла на указанных выше средах -неменее 1-2лёт. В лиофильновысушенном состо нии культура хранитс  до 3 лет и более . Дл  этого штамм В. subtilis 26D выращивают на среде Громыко или среде Гаузе № 2, или сусло-агаре в течение 5-7 сут при 28 или 37°С. С агаризованной среды биомасса снимаетс  физиологическим раствором . В качестве защитной среды используетс  сахарозо-желатиновый наполнитель . Температура замораживани  не выше -25°С, режим высушивани  от -25°С до 32°С в течение 32 ч.

После хранени  под минеральным маслом или в лиофилизированном состо нии культура образует однотипные колонии: на МПА - складчатые, в зкой консистенции, телесного цвета, кра  колонии изрезанные.

Антагонистические свойства. Антагонистическую активность В. subtilis 26D по отношению к фитопатогенным грибам определ ли методом отсроченного антагонизма , а именно радиальных штрихов. Штамм-антагонист засевали в центре чашки Петри на среду Гаузе №2. инкубировали при 28°С в течение 72 ч, затем радиальными штрихами подсевали тест-культуры, суспензии которых готовили в физиологическом растворе с содержанием 0,5 млрд. спор в 1 мл. Учет результатов проводили по величине зоны задержки роста тест-штамма в миллиметрах .

В табл. 5 приведены данные по антагонистической активности В. subtilis 26D по отношению к некоторым фитопатогенным грибам.

Как видно из приведенных в табл. 5 данных , штамм В. subtilis 26D обладает выраженной антифунгальной активностью в отношении грибов - возбудителей корневых гнилей, фузариозного ув дани , вертицил- лезного вилта.

Культуру В. subtilis 26D использовали дл  получени  препарата.

Препарат на основе В. subtilis 26D представл ет собой лиофилизированную взвесь культуры в физиологическом раство- ое NaCI с добавлением защитной среды, В

качестве защитной среды использовали 1% желатины и 1%сахарозы. Культуру В. subtilis 26D выращивали на среде сусло- агар (рН 6,8-7,0) в течение 7-10 сут при 28- 32°С. С агаризованной среды биомассу смывали физиологическим раствором Nad и готовили суспензию, содержащую 2-3-1011 клеток в 1 мл, Суспензию соедин ли с наполнителем (сахарозо-желатиновой средой ). Полученную взвесь разливали в емкости из нержавеющей стали по 300 мл и замораживали при -(25-30)°С в течение не менее 24 ч. Проводили лиофилизацию в камере в режиме от (-30) до 32°С в течение 32 ч. Высушенную биомассу помещали в полиэтиленовые пакеты и укупоривали гор чим способом.

Дл  обработки сем н хлопчатника бактериальную лиофилизированную культуру за 1-2 ч до начала обработки раствор ли в небольшом количестве водопроводной воды с целью оживлени  бактериальных спор и клеток. Затем из маточного раствора готовили рабочую суспензию, довод  титр до 5, - 1,0«109 кл/мл. Дл  обработки 1 т сем н необходимое приготовление 500-700 л рабочей суспензии. Обработку сем н производили либо в имеющейс  емкости, либо в специально приготовленной зацементированной  ме. Обработку начинали за 12-18 ч до начала сева. В емкость засыпали до 1 т сем н и поливали вручную из лейки. Необходимое количество рабочей суспензии использовали в 2-3 приема с интервалом в 4-6 ч, чтобы семена хорошо впитали раствор. Вслед за каждым увлажнением сем н их

тщательно перелопачивали и накрывали брезентом. Последнее увлажнение проводили перед посевом. Если посев задерживалс , семена подсушивали, рассыпав их слоем в 5-10 см, а непосредственно перед

внесением в грунт их увлажн ли водой.

Результаты предпосевной обработки сем н хлопчатника с целью предупреждени  поражени  растений грибными болезн ми , повышени  всхожести представлены

в табл. 6.

Вли ние В. subtilis 26D на прорастание сем н и пораженность корневыми гнил ми. В табл. 7 приведены результаты предпосевной обработки сем н хлопчатника с

целью предупреждени  поражени  растений корневыми гнил ми, вертициллезным вилтом, повышени  урожайности.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о высокой эффективности

предлагаемого способа дл  предпосевной обработки сем н хлопчатника.

Claims (2)

1. Формула изобретени  Штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИ- ИСХМ 128 дл  получени  препарата против возбудителей заб -еваний хлопчатника .

   Т а б л и ц а 1

   35

   Таблица 2

   При. ме-чание.1. В качестве тест-культур использовали штаммы фитопатогенных грибов, изолированные из пораженных растений хлопчатника, выращенных в различных районах Таджикской ССР. Штамм Fusarium oxysporum 6365 получен из коллекции Института микробиологии и вирусологии АН УССР.
2. 2. Врем  наблюдени  зон лизиса фитопатогенных грибов 3-10 сут.

   Та блица 6 Вли ние В. subtills 26D на прорастание сем н и пораженность корневыми гнил ми

   Таблица 3

   Таблиц а 4

   Таблица 5

   Та б л и ц а 7

   Вли ние В. subtllls 26D на пораженность растений хлопчатника . корневыми гнил ми, вертициллезным вилтом, повышение урожайности