CN104026153B - 抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂及其制备方法，利用纤维素酶活性高、同时能够抑制芦蒿连作土壤中丝核菌、镰刀菌等土传病原菌的枯草芽孢杆菌菌株和里氏木霉菌株，生产芦蒿秸秆分解菌剂。该菌剂能够加速芦蒿连作土壤中芦蒿秸秆残茬的分解速度，同时抑制秸秆残茬上病原微生物的繁殖增生，降低芦蒿连作障碍的危害。菌剂中功能微生物数量≧2×10⁸cfu?g^-1，含水量小于15%，有机质含量大于35%。试验表明，芦蒿连作障碍发病严重地块，施用芦蒿秸秆残茬分解菌剂后，相较于不使用分解菌剂土壤，芦蒿秸秆分解失重率提高80.9%，下茬芦蒿发病率降低75%，芦蒿产量增116%；该秸秆分解菌剂能够很好的抑制芦蒿的连作病害。

Description

抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂及其制备方法，属于微生物技术领域。

背景技术

芦蒿（Artemisia selengens Turcz.）又名萎蒿、藜蒿、水蒿、柳蒿、香艾、狭叶艾，为菊科蒿属多年生草本植物。芦蒿以鲜嫩茎杆供食用，是广受喜爱的蔬菜之一，是我国冬春蔬菜市场供应的主要野菜品种之一。

随着芦蒿集约化生产的发展，种植一亩芦蒿可为农民增收数万元，部分乡镇为单位的蔬菜种植基地，芦蒿种植面积占当地耕地面积的60%左右。土壤长期种植一种作物容易造成连作障碍，表现为作物生长缓慢、病虫害严重、作物产质量下降等，尤其是土壤传播的病害，随着土壤中病原菌的一茬一茬的积累，病害会越来越严重，最终造成作物的绝收，给种植户造成很大的损失。随着种植年限和种植强度的增加，不少芦蒿种植基地已经出现很严重的连作障碍现象。刚开始是三五株芦蒿发病，接下来就是成片的芦蒿植株死亡，发病的田块即使停种或者轮作一季，第二年种植芦蒿还会出现类似的植株发病症状。

作物的残茬（落叶、土壤中根茎和秸秆等）是土传病原菌的主要附着物，而且据报道，残茬腐解物能够促进病原微生物的生长，病原菌随着植物残茬在土壤中的分解腐烂，进一步在土壤中增生和定殖，威胁到下茬植物的生产。

因此，加速作物连作系统中残茬的分解速度、同时抑制分解过程中病原微生物的生长，是有效地减少土传病害的治本方法。

随着社会发展，对食品安全的要求越来越高，来源于土壤的微生物菌株生产的微生物菌剂，高效无公害，具有十分广阔的应用前景。

迄今为止，没有发现涉及本发明主题的文献报道。

发明内容

目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂，能够抑制芦蒿连作土壤病原微生物繁殖和增生，该菌剂中的功能微生物能够在土壤中大量存活和定殖，在分解芦蒿秸秆等残茬的过程中抑制土壤病原微生物的生长和繁殖，有效缓解芦蒿连作障碍对芦蒿产业的危害。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂，其特征在于：所述芦蒿秸秆分解菌剂为枯草芽孢杆菌D9（Bacillus subtilis D9）和里氏木霉（Trichoderma reesei）菌株通过发酵工艺生产，产品有效菌落形成单位（cfu）≥2×10⁸ cfu•g^-1，含水量<15%。

所述枯草芽孢杆菌D9（Bacillus subtilis D9）2014年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏号为CGMCC NO.9170，简称为枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170。

所述的枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170的主要生物学特性为：菌落为白色、边缘不整齐、表面干燥不透明，革兰氏染色阳性，具运动性，通过电镜观察，杆状，芽孢中生，两端钝圆。

所述的抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将里氏木霉接种到木霉液体培养基，进行液体发酵生产里氏木霉发酵液，其发酵生产的条件为：培养温度25-30℃，溶氧通气量范围为30～100％，110-170rpm，发酵后期菌丝球全部打碎成菌丝片段，里氏木霉发酵液菌株的菌落形成单位≥0.5×10⁸cfu•ml^-1；

2）将稻壳、秸秆粉和麦麸按照30：40：30比例混合，按照1:1.2-1.5的比例添加水，121℃灭菌30min，制成木霉固体发酵培养基，冷却到室温后按照10%的接种量接种里氏木霉发酵液，20-25℃培养30天，每3-5天翻动固体发酵培养基，发酵结束形成里氏木霉固体发酵菌种；

3）将枯草芽孢杆菌D9接种到液体发酵培养基制得枯草芽孢杆菌发酵液，其发酵生产的条件为：初始pH范围为6.5-7.2，培养温度35-37℃，溶氧通气量范围为30～100％，120-180rpm，发酵18h，枯草芽孢杆菌发酵液中芽孢数量≥2×10⁸cfu•ml^-1；

4）将制得的枯草芽孢杆菌发酵液按照10%比例接种到固体发酵培养基，发酵温度为37℃，发酵培养时间为5天，发酵过程中每10-20小时翻动一次，发酵结束获得枯草芽孢杆菌D9固体发酵菌种；

5）将里氏木霉固体发酵菌种和枯草芽孢杆菌D9菌固体发酵菌种按照1:1质量比彻底的混合，用粉碎机粉碎，按照30%质量比添加粉碎碳酸钙粉，彻底混匀，基质含水量低于15%，包装即得抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂。

所述的抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂的制备方法，其特征在于：所述木霉液体培养基配制方法为：土豆淀粉5g，玉米淀粉20g，蔗糖10g，pH值自然，自来水1000ml，115℃灭菌30min。

所述的抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂的制备方法，其特征在于：枯草芽孢杆菌D9的液体发酵培养基配制方法为：葡萄糖3.5g、玉米淀粉8.5g、黄豆粕25g、碳酸钙3g、硫酸铵1g、硫酸锰0.2g、磷酸二氢钾0.35g、硫酸镁0.2g，自来水1000ml，115℃灭菌0.5h。

所述的抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂的制备方法，其特征在于：枯草芽孢杆菌D9的固体发酵培养基的配置方法为：将麸皮80g、稻壳10g、玉米粉5g、豆饼粉5g、硫酸铵0.8g、硫酸镁0.3g、硫酸锰0.1g彻底混合，按照1：1.2的比例添加自来水，121℃灭菌30min。

有益效果：本发明提供的抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂，通过具有高效分解芦蒿秸秆能力和抑制芦蒿土传病原菌能力的微生物固体发酵，采用一定的工艺生产，本发明的微生物菌剂与目前市场上的产品相比具有如下优点：1）该微生物菌剂能够快速的分解芦蒿收获后土壤中的芦蒿残茬，在分解残茬的过程中能够有效的抑制芦蒿土传病原微生物生长和繁殖。2）芦蒿连作土壤施用本品2-5kg/亩，芦蒿秸秆残茬分解速度增加19.2-80.9%，土壤病原微生物在秸秆残茬分解过程中，数量减少10.3-52.1%。3）由于菌剂是生物菌株通过一定的工艺生产，完全没有化学杀菌剂使用所带来的一系列问题，安全环保，有利于蔬菜安全生产。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌D9对镰刀菌的拮抗作用；

图2为枯草芽孢杆菌D9对立枯丝核菌的拮抗作用；

图3为芦蒿连作土壤微生物菌剂抑制连作障碍效果的盆钵实验；

图4为不同处理对芦蒿连作地秸秆分解效果；

图5为不同处理对芦蒿发病率的影响；

图6为不同处理对芦蒿产量的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。

（一）功能微生物菌株的获取

在芦蒿连作田块，选择发病率较重田块中生长最好的植株，采集该植物根际土壤，低温保存，采用马丁氏培养基分离真菌，牛肉膏蛋白胨培养基分离细菌，高氏一号培养基分离放线菌。

上述马丁氏培养基配制方法为（以配制1L培养基为例）：蛋白胨5g，葡萄糖10g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄ 0.5g，琼脂20g，水1000ml，pH自然，1%孟加拉红水溶液3.3ml，115℃灭菌30min，临用时每100ml培养基中加1%链霉素液0.3ml。上述牛肉膏蛋白胨培养基配制方法为（以配制1L培养基为例）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH=7.2，自来水1000ml，121℃灭菌20min。上述高氏一号培养基的配制方法为（以配制1L培养基为例）：可溶性淀粉20g、KNO₃ 1g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄ 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO₄ 0.01g、pH值自然，配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少量水中加热，使淀粉溶解，然后加入其它成分，补足水分至1000ml，121℃灭菌20min。

分离出来的菌株用PDA培养基进一步扩大培养。真菌培养条件为： 25℃，培养4天。放线菌用高氏一号的培养条件为： 33℃，培养48h。细菌的培养条件为： 35℃，培养18h。上述PDA培养基的配置方法为（以配制1L培养基为例）：取200g洗净去皮的马铃薯切成小块，沸水煮20min，用2层纱布过滤，滤液中加入20g葡萄糖，水分补充至1000ml，20g琼脂，115℃灭菌30min。

以芦蒿连作土壤中立枯丝核菌和镰刀菌作为生物防治的目标菌株，采用平皿对峙培养，能够显著抑制立枯丝核菌和镰刀菌的微生物菌株选择备用。

采用滤纸培养基进一步测定分离出来的菌株，纤维素酶活性最高的菌株选择留用。上述滤纸培养基配方为：(NH₄)₂SO₄ 1g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄ 0.7g，NaCl 0.5g，琼脂20g，纯净水 1000ml ，滤纸条1片。

从健康芦蒿根际分离出来的、能够抑制立枯丝核菌和镰刀菌菌株并且能够高效分解纤维素和芦蒿秸秆残茬的菌株属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），编号D9，对立枯丝核菌和镰刀菌抑制效果分别如图1和图2所示。主要生物学特征为：菌落为白色、边缘不整齐、表面干燥不透明，革兰氏染色阳性，具运动性，通过电镜观察，菌体杆状，芽孢中生，两端钝圆。生理生化测试显示，接触酶阳性，氧化酶阴性，V-P反应阳性，能利用甘露醇、麦芽糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、柠檬酸盐，能还原硝酸盐成亚硝酸盐，不能利用丙二酸盐。能水解淀粉、明胶和酪素。16S rRNA序列进化分析显示该菌株和枯草芽孢杆菌相似度为99%。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏号为CGMCC NO.9170，简称为枯草芽孢杆菌CGMCC NO.9170。

里氏木霉菌株由河海大学农业环境研究所提供，菌株5天发酵液纤维素酶活为33.6U•ml^-1，能够快速的腐解水稻秸秆、小麦秸秆、芦蒿秸秆。

（二）菌剂生产

1）将里氏木霉接种到木霉液体培养基，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度25-30℃，溶氧通气量范围为30～100％，110-170rpm，发酵后期菌丝球全部打碎成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥0.5×10⁸cfu•ml^-1；木霉液体培养基为：土豆淀粉5g，玉米淀粉20g，蔗糖10g，pH值自然，自来水1000ml，115℃灭菌30min。

2）将稻壳、秸秆粉和麦麸按照30：40：30比例彻底的混合，按照1:1.2-1.5的比例添加水，121℃灭菌30min，制成木霉固体发酵培养基，冷却到室温后按照10%的接种量接种步骤1）里氏木霉发酵液，20-25℃培养30天，每3-5天翻动固体发酵培养基，发酵结束形成木霉固体发酵物。

3）将枯草芽孢杆菌D9接种到液体发酵培养基，其发酵生产的条件为：初始pH范围为6.5-7.2，培养温度35-37℃，溶氧通气量范围为30～100％，120-180rpm，发酵18h，发酵液中芽孢数量≥2×10⁸cfu•ml^-1；枯草芽孢杆菌D9液体发酵液配方为：葡萄糖3.5g、玉米淀粉8.5g、黄豆粕25g、碳酸钙3g、硫酸铵1g、硫酸锰0.2g、磷酸二氢钾0.35g、硫酸镁0.2g，自来水1000ml，115℃灭菌0.5h。

4）将麸皮80g、稻壳10g、玉米粉5g、豆饼粉5g、硫酸铵0.8g、硫酸镁0.3g、硫酸锰0.1g彻底混合，按照1：1.2的比例添加自来水，121℃灭菌30min，制成枯草芽孢杆菌D9的固体发酵培养基。将步骤3）枯草芽孢杆菌发酵液按照10%比例接种到固体发酵培养基，发酵温度为37℃，发酵培养时间为5天，发酵过程中每10-20小时翻动一次，发酵结束获得枯草芽孢杆菌D9固体发酵物。

5）将步骤2）和4）的里氏木霉固体发酵菌种和枯草芽孢杆菌D9菌固体发酵菌种按照1:1质量比彻底的混合，用粉碎机粉碎，按照30%质量比添加粉碎碳酸钙粉，彻底混匀，基质含水量低于15%，包装出厂即为具有抑制芦蒿土传病害的芦蒿秸秆分解菌剂。

（三）芦蒿连作土壤中秸秆残茬分解和抑病试验

1.盆栽实验

实验选用种植芦蒿5年连作土壤，每年“冬春”芦蒿和“伏秋”芦蒿种植间歇，主要种植玉米、大豆等作物。芦蒿发病率较高的年份，“伏秋”芦蒿发病率约为60%，芦蒿减产约80%。

试验设置2个处理，分别为：

处理1，对照处理，土壤不使用分解菌剂；

处理2，分解菌剂处理，土壤施用分解菌剂1g/kg土壤。

种植品种为碎叶蒿，盆钵（直径25cm，高18cm）放入5kg连作土壤（包括土壤中上茬芦蒿的落叶、根和秸秆等残茬），土壤施用50g猪粪堆肥，1.0g尿素，温室温度23-35℃，湿度60-100%。

实验结果如图3所示，对照处理的平均株高为25cm，鲜重5.3g，发病率为39%，上季秸秆腐烂失重率为46%；使用秸秆腐熟剂的处理芦蒿的平均株高为52cm，单株平均鲜重为35g，发病率为12%，上季秸秆腐烂失重率为83%；秸秆腐熟剂能够有效的增加连作土壤中芦蒿的株高、鲜重，加速土壤中芦蒿残茬的分解，降低芦蒿的发病率。

2.田间试验

试验大棚种植芦蒿5年，每年“冬春”芦蒿和“伏秋”芦蒿种植间歇，主要种植玉米、大豆等作物。芦蒿发病率较高的年份，“伏秋”芦蒿发病率约为60%，芦蒿减产约80%。

试验设置3个处理，分别为：

处理1，对照处理，土壤不使用分解菌剂；

处理2，分解菌剂处理，土壤施用分解菌剂5kg/亩；

处理3，多菌灵处理，50%可湿性粉剂1000倍液，每隔30天喷施一次。

种植品种为碎叶蒿，小区面积100平方米。5月初，在留种田块挖取植株移栽到试验大棚，行距30厘米，株距30厘米，每穴栽种2株，栽后踏紧，浇透水。施用有机肥1000kg/亩作为基肥，追施25kg尿素。

芦蒿连作地秸秆分解失重率如图4所示，施用秸秆分解菌剂处理秸秆失重率比对照处理高80.9%（p>0.05），喷施多菌灵对秸秆失重率没有显著影响（p>0.05）。

芦蒿累积的发病率如图5所示，对照处理芦蒿发病率显著的高于施用分解菌剂和喷施多菌灵的处理，分解菌剂处理和喷施多菌灵处理的芦蒿发病率之间没有统计学差异（p>0.05）。施用分解菌剂处理发病率降低了75%。

不同处理芦蒿的产量如图6所示，施用分解菌剂处理芦蒿产量显著的高于对照和喷施多菌灵处理（p>0.05），施用分解菌剂处理芦蒿产量比对照高116%。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂，其特征在于：所述芦蒿秸秆分解菌剂为枯草芽孢杆菌D9（Bacillus subtilis D9）和里氏木霉（Trichoderma reesei ）菌株通过发酵工艺生产，产品有效菌落形成单位（cfu）≥2×10⁸ cfu•g^-1，含水量<15%；所述枯草芽孢杆菌D9于2014年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏号为CGMCC NO.9170；所述的枯草芽孢杆菌D9（保藏号CGMCC NO.9170）的主要生物学特性为：菌落为白色、边缘不整齐、表面干燥不透明，革兰氏染色阳性，具运动性，通过电镜观察，杆状，芽孢中生，两端钝圆；

所述芦蒿秸秆分解菌剂的制备方法如下：

1）将里氏木霉接种到木霉液体培养基，进行液体发酵生产里氏木霉发酵液，其发酵生产的条件为：培养温度25-30℃，溶氧通气量范围为30～100％，110-170rpm，发酵后期菌丝球全部打碎成菌丝片段，里氏木霉发酵液菌株的菌落形成单位≥0.5×10⁸cfu•ml^-1；

2）将稻壳、秸秆粉和麦麸按照30：40：30比例混合，按照1:1.2-1.5的比例添加水，121℃灭菌30min，制成木霉固体发酵培养基，冷却到室温后按照10%的接种量接种里氏木霉发酵液，20-25℃培养30天，每3-5天翻动固体发酵培养基，发酵结束形成里氏木霉固体发酵菌种；

3）将枯草芽孢杆菌D9接种到液体发酵培养基制得枯草芽孢杆菌发酵液，其发酵生产的条件为：初始pH范围为6.5-7.2，培养温度35-37℃，溶氧通气量范围为30～100％，120-180rpm，发酵18h，枯草芽孢杆菌发酵液中芽孢数量≥2×10⁸cfu•ml^-1；

4）将制得的枯草芽孢杆菌发酵液按照10%比例接种到固体发酵培养基，发酵温度为37℃，发酵培养时间为5天，发酵过程中每10-20小时翻动一次，发酵结束获得枯草芽孢杆菌D9固体发酵菌种；

5）将里氏木霉固体发酵菌种和枯草芽孢杆菌D9菌固体发酵菌种按照1:1质量比彻底的混合，用粉碎机粉碎，按照30%质量比添加粉碎碳酸钙粉，彻底混匀，基质含水量低于15%，包装即得抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂。

2.根据权利要求1所述的抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂，其特征在于：所述木霉液体培养基配制方法为：土豆淀粉5g，玉米淀粉20g，蔗糖10g，pH值自然，自来水1000ml，115℃灭菌30min。

3.根据权利要求1所述的抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂，其特征在于：枯草芽孢杆菌D9的液体发酵培养基配制方法为：葡萄糖3.5g、玉米淀粉8.5g、黄豆粕25g、碳酸钙3g、硫酸铵1g、硫酸锰0.2g、磷酸二氢钾0.35g、硫酸镁0.2g，自来水1000ml，115℃灭菌0.5h。

4.根据权利要求1所述的抑制芦蒿土传病原菌的芦蒿秸秆分解菌剂，其特征在于：枯草芽孢杆菌D9的固体发酵培养基的配置方法为：将麸皮80g、稻壳10g、玉米粉5g、豆饼粉5g、硫酸铵0.8g、硫酸镁0.3g、硫酸锰0.1g彻底混合，按照1：1.2的比例添加自来水，121℃灭菌30min。