CN105194504B - 舒更胶囊在制备具有神经保护作用药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种藏药舒更胶囊在制备具有神经保护作用药物中的应用，属于医药领域。本发明克服了现有技术应用方面的技术偏见，通过动物实验发现，舒更胶囊能显著增强细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低PC12神经细胞受损伤程度，降低大量一氧化氮(NO)所致神经细胞的损伤，对谷氨酸所致神经细胞损伤具有一定的修复保护作用。临床资料则显示，舒更胶囊对于帕金森病患的精神、行为和情绪(UPDRS‑I)评分、日常生活活动(UPDRS‑II)评分及生活质量评分量表(PDQ)评分均有显著改善，其中联合用药及长期用药的效果尤为显著。

Description

舒更胶囊在制备具有神经保护作用药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种藏药舒更胶囊在制备具有神经保护作用药物中的应用，属于医药领域。

背景技术

神经细胞属于高度分化细胞，本身无再生能力。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质，主要在谷氨酸受体的介导下实现其在脑内的众多功能。但是细胞间隙中谷氨酸浓度过高时会对神经元产生毒性，导致神经元的退化、衰老及死亡，而氧化应激是谷氨酸神经毒性作用的主要机制，谷氨酸的神经毒性可能通过氧化应激和自由基机制引起神经细胞的变性、凋亡和丢失。目前越来越多的研究发现，非正常水平的谷氨酸在许多神经和精神疾病(包括脑缺血、癫痫、阿尔茨海默病( AD) 、帕金森病(PD)、精神分裂症、皮克病等)的病因学和病理生理学过程中发挥了重要的传递作用。帕金森病(PD)是常见的神经退行性疾病，调查显示：55岁以上的中国人中约有170多万PD患者，其患病率达1％。帕金森病临床表现为运动迟缓、静止震颤和强直自主神经功能的障碍和痴呆。研究显示，帕金森病的病理变化与脑内多种神经元退行性变和死亡有关，李霞等在《帕金森病小鼠前庭神经核内谷氨酸和谷氨酸受体1的表达》(《中国医科大学学报》 2008年第37卷第2期,181-183页)一文中指出，PD小鼠前庭神经核内谷氨酸表达增加，同时谷氨酸受体表达减少。多人实验研究也发现氧自由基对帕金森病的发病起重要作用。目前帕金森病的治疗仍然是针对其症状的控制，尚无有效延缓疾病进程的手段。临床上以多巴胺类替代治疗为主，但会产生运动障碍、强直、不可预期的“开-关”现象等副作用，且无法阻止神经元继续死亡及修复已损伤的神经元。因此保护及修复已损伤的多巴胺神经细胞是治疗PD病的核心问题。

舒更胶囊为一种藏药，可调和气血，安神。用于妇女更年期综合征引起的烦躁不安，头昏乏力，失眠。但文献、专利等方面均未发现其具有神经保护作用及用于治疗帕金森病的研究。

发明内容

本发明的目的是提供舒更胶囊在制备具有神经保护作用药物中的应用。

术语说明：

舒更胶囊是《中华人民共和国卫生部药品标准》中记载的药品名称，标准号为WS-11010(ZD-1010)-2002，市场可购。

本发明是通过如下技术方案实现的：

舒更胶囊在制备具有神经保护作用药物中的应用。

优选的，本发明所述的应用，其用法用量为口服，一次3～4粒，一日3次。

优选的，舒更胶囊在制备具有保护谷氨酸所致神经损伤的药物中的应用。

优选的，舒更胶囊在制备具有保护自由基所致神经损伤的药物中的应用。

进一步优选的，舒更胶囊在制备治疗帕金森病药物中的应用。

本发明所述的应用，舒更胶囊单独使用或联合其他具有神经保护作用的药物共同使用。

优选的，在制备治疗帕金森病药物中的应用，舒更胶囊单独使用或联合美多芭片使用。

本发明所述的应用，使用时间一个月以上，优选3个月以上。

本发明所述的美多芭片为常规市场可购产品。

有益效果：

在舒更胶囊的应用治疗领域，人们熟知其调和气血，安神。用于妇女更年期综合征引起的烦躁不安，头昏乏力，失眠。

本发明克服了上述应用方面的技术偏见。本发明通过实验研究发现，舒更胶囊可显著保护谷氨酸造成的PC12细胞损伤，可显著降低受损伤PC12细胞培养液中LDH的漏出量，增强SOD活性，对谷氨酸所致PC12细胞损伤后产生的自由基具有一定的清除作用。临床研究发现，舒更胶囊对于帕金森病患的精神、行为和情绪(UPDRS-I)评分、日常生活活动(UPDRS-II)评分及生活质量评分量表(PDQ)评分均有显著改善，特别对日常活动和生活质量提升尤为显著，其中联合用药及长期用药的效果更好。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质，下面将通过药理和临床研究来进一步说明舒更胶囊具有神经保护作用的用途及其对帕金森病的改善作用。

实验例1：对谷氨酸导致PC12细胞株化学损伤后的保护作用

一、实验材料

1、样品及其制备

细胞系：PC12细胞系(来源：Rattus norvegicus肾上腺嗜铬细胞瘤，南京凯基生物科技发展有限公司)；

试剂：H-DMEM细胞培养基(Hyclone，赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)；胎牛血清(以色列Bioind)；胰酶细胞消化液(碧云天),青霉素链霉素混合液双抗，注射用顺铂(齐鲁制药有限公司)，柠檬酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司)，多聚甲醛(solarbio)，L-谷氨酸(Klonetech，Japan)，复方丹参滴丸(天津天士力制药股份有限公司，20111119)。

舒更胶囊各样品简称对照如下：

舒更胶囊(青海金诃藏药，批号20111219)

舒更胶囊石油醚提取部位(舒石，自制)

舒更胶囊乙醇提取部位(舒醇，自制，小鼠口服给药后取血清为样品“舒血”)

舒更胶囊水提部位(舒水，自制)

舒更胶囊超微粉300目(舒粉，自制)

1)舒更胶囊石油醚提取部位的制备：

取舒更胶囊内容物40g，置于索氏提取器中加500ml石油醚提取2h，药渣A待用，石油醚提取液减压浓缩并继续干燥，得到舒更胶囊石油醚提取部位1.42g。

2)舒更胶囊乙醇提取部位的制备：

取上述药渣A，加入350ml70％乙醇提取2次，第一次2h，第二次1h，所得药渣B待用，合并两次乙醇提取液，滤过后减压浓缩并继续干燥，得到舒更胶囊乙醇提取部位4.65g。

3)舒更胶囊水提部位的制备：

取上述药渣B，加入350ml水提取2次，第一次2h，第二次1.5h，合并两次水提液，滤过后减压浓缩并继续干燥，得到舒更胶囊水提部位6.36g。

4)舒更胶囊超微粉的制备：

取舒更胶囊内容物，超微粉碎成300目，即得。

5)含药血清的制备：

取舒更胶囊乙醇提取部位，制成最大浓度水混悬液，口服喂饲小鼠5只，给药量为0.0236g/g体重，30min后摘取眼球，不抗凝取血，3000rpm离心15分钟分离血清备用，即为样品(舒血)。

2、实验仪器

立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50FBS,上海申安)；双人单面净化工作台(SW-CJ-1C，苏州净化)；二氧化碳培养箱(BB16μV/BB5060μV，HERAE US)；台式离心机(H3，Sigma)；酶标仪(Multiskan MK3,Thermo Scientific)；电热恒温鼓风干燥箱(101，上海鹏顺科学仪器有限公司)；倒置显微镜(XDS-1B，重庆光学仪器厂)；水浴恒温振荡器(SHZ-82，金坛市医疗仪器厂)；移液器(Gilson，Eppendorf)；培养瓶(Corning)；96孔板(Costar,USA)。

二、实验方法

以谷氨酸制备PC12细胞化学损伤模型，采用噻唑蓝(MTT)法于570nm处测定吸收值，观察候选药物对PC12细胞损伤的修复作用。使用SOD、NO、LDH、MDA试剂盒检测各指标含量，阐明各药的作用机理。

造模：30mmol/l的谷氨酸(此为加样终浓度，溶于不完全培养基中)作用于PC12细胞24h。

分组：空白组、化学损伤模型组、化学损伤+药物组、化学损伤+阳性对照药组。因96孔板数目限制，样品量较大时采用两个板同时培养检测，每板各设模型组空白组和阳性对照组，以保证结果的可靠性和一致性。

三、实验内容和步骤

1、细胞培养

从超低温冰箱中取冻存的PC12细胞复苏于培养瓶中，以含10％胎牛血清的H-DMEM培养基培养。待PC12细胞生长至80％融合时，以0.25％的胰酶细胞消化液(含0.02％EDTA)进行消化，以1×104个细胞每孔接种于96孔板中，调零孔不加细胞。

2、细胞损伤

待96孔板中的细胞长满单层后，弃掉培养基，无菌PBS液清洗2遍，除调零组、空白对照组外，每孔加入终浓度为30mmol/l的谷氨酸(溶于不完全培养基中)于培养箱内培养24h，即造成PC12细胞损伤模型。

3、加药修复

弃掉培养基，用无菌PBS液清洗2遍，给药组每孔分别加入含筛选药物终浓度依次为100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml的DMEM培养基100μl，每个浓度的药物加6孔。以不含药物的DMEM培养基为空白对照组，阳性对照组加入不同浓度的复方丹参滴丸的无血清DMEM培养基100μl。然后将细胞置入37℃、5％CO2培养箱中继续培养24h。

4、指标测定

4.1MTT法测定细胞存活率

弃掉培养基后每孔加入100μl无血清DMEM培养基，再于每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl于培养箱内避光反应4h。弃掉培养基加入100μlDMSO用酶标仪于570nm测定OD值，计算细胞存活率：

计算公式：细胞存活率(％)＝(用药组或模型组A570/对照组A570)×100％。

4.2一氧化氮(NO)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量测定

给药后24小时用无菌管收集细胞上清液，离心20分钟(2000r/min)，仔细收集上清液，按试剂盒说明书操作测定LDH、NO含量。

给药后24小时弃去上清，加2％Trion-100X，于4℃静置12小时后混匀细胞悬液，离心20分钟(2000r/min)，仔细收集上清液，按试剂盒说明书操作测定MDA、SOD含量。

四、实验结果

所有数据以X±SD表示，单因素方差分析及LSD多组均数两两比较组间差异的显著性，P<0.05为差异显著

1、舒更胶囊对损伤的PC12细胞存活率的影响

表1舒更胶囊对损伤的PC12细胞存活率影响的结果(n＝8)

注：*表示P<0.05

表1结果表明，终浓度为1μg/ml的候选药物中，舒醇，舒粉，舒水，舒石的细胞存活率与相应模型组相比，有显著性差异。在终浓度10μg/ml的候选药物中，舒醇，舒粉的细胞存活率和模型组相比，有显著性差异。

2、舒更胶囊对LDH、NO、MDA、SOD含量的影响

2.1舒更胶囊对体外培养的PC12细胞NO含量的影响

表2舒更胶囊各提取部位及含药血清对PC12细胞的NO含量测定结果(n＝3)

注：*P<0.05

表2结果表明，终浓度1μg/ml以及10μg/ml的舒醇和舒石以及10μg/ml的舒水与模型组有显著性差异；给药血清中，舒浸与空白血清组相比，有显著差异。

2.2舒更胶囊对体外培养的PC12细胞LDH含量的影响

表3舒更胶囊各提取物及含药血清LDH含量测定结果(n＝3)

注：*P<0.05

表3结果表明，舒粉1μg/ml、10μg/ml、舒醇10μg/ml、舒水10μg/ml及含药血清舒浸可显著降低受损伤PC12细胞培养液中LDH的漏出量。

2.3舒更胶囊对体外培养的PC12细胞SOD含量的影响

表4舒更胶囊各提取物及含药血清SOD含量测定结果(n＝3)

注：*P<0.05

表4结果表明，舒石1μg/ml、舒水1μg/ml、舒石10μg/ml、舒水10μg/ml与模型组比较，均有显著性差异。

2.4舒更胶囊对体外培养的PC12细胞MDA含量的影响

表5舒更胶囊各提取物及含药血清MDA含量测定结果(n＝3)

注：*P<0.05

表5结果表明，各组与模型组比较，均无显著性差异。

3、舒更胶囊体外药理试验研究结论

表6舒更胶囊各制剂结果一览表

+表示该制剂或提取物与模型组相比，有显著的统计学意义(P<0.05)。

3.1对细胞存活率的影响

MTT法测定PC12细胞存活率结果表明，终浓度为1μg/ml的候选药物中，舒醇，舒粉，舒水，舒石的细胞存活率与相应模型组相比，有显著性差异。在终浓度10μg/ml的候选药物中，舒醇，舒粉的细胞存活率与相应模型组相比，有显著性差异。阳性对照药复方丹参滴丸以27mg/ml终浓度给药，在各组别中细胞存活率最高。其它各组未见显著性差异，或者显著低于模型对照组。

3.2对SOD含量的影响

舒石1μg/ml、舒水1μg/ml、舒石10μg/ml及舒水10μg/ml与模型组比较，均有显著性差异。

3.3对MDA含量的影响

各样品与模型组比较未见显著性差异。

3.4对NO含量的影响

终浓度1μg/ml以及10μg/ml舒醇、舒石、10μg/ml舒水与模型组有显著性差异；含药血清舒浸与空白血清组相比，有显著差异。

3.5对LDH含量的影响

舒粉1μg/ml、10μg/ml，舒醇10μg/ml、舒水10μg/ml，以及含药血清舒浸与模型组比较均有显著性差异。

3.6舒更胶囊的综合结论

MTT法细胞活性筛选结果证实：与模型组比较，舒更胶囊醇提部位、超微粉、水提部位在适合浓度下对谷氨酸导致的PC12细胞损伤具有显著的修复作用。与模型组比较，舒更胶囊石油醚提取部位和水提部位能显著增强细胞SOD活性。提示以上药物，对谷氨酸所致PC12细胞损伤后产生的自由基具有一定的清除作用。

舒粉1μg/ml、10μg/ml、舒水10μg/ml，舒醇10μg/ml浓度的样品，以及含药血清舒浸可降低培养液中LDH的漏出量，提示以上各筛选药物可降低PC12神经细胞受损伤程度，对谷氨酸所致神经细胞损伤具有一定的修复保护作用。

舒更胶囊乙醇提取部位含药血清能显著减少细胞培养液中NO含量，降低大量NO所致神经细胞的损伤。

实验例2：临床资料

1、一般资料

自2010年5月至2013年2月，筛选收治帕金森病(简称PD)患者95例，病程1年到20年。全部病例均经体格检查及头颅CT或核磁等多项检查，并结临床症状确诊，且无严重肝、肾、心等脏器功能不良。随机分为联合组33例，其中，男21例，女12例，年龄：49-76岁，平均年龄63.8±8.8岁，平均病程11±5.6年；对照组32例，其中，男20例，女12例，年龄：49-76岁，平均年龄62.1±7.7，平均病程11.1±5年；单独组32例，其中，男21例，女11例，年龄：49-76岁，平均年龄63.8±8.8年，平均病程11±5.6年。

PD认知障碍入选标准：

(一)入选标准：1、符合英国PD脑库帕金森病的诊断标准。2、在已明确PD诊断的基础上，由患者本人/知情者提供或临床医师观察到的认知功能的逐渐下降。3、基于正式的神经心理测试或总体认知功能量表明确的认知功能损害。4、认知功能损害并不足以显著干扰功能独立性，尽管执行复杂的功能性任务时可能会出现轻微的困难。

(二)排除标准：1、符合运动障碍协会(MDS)特别小组提出的帕金森病痴呆的诊断。2、其他可引起认知功能障碍的原因(如：谵妄，卒中，严重抑郁，代谢异常，药物副作用，头部外伤)。3、PD相关的共患病(如：运动障碍或严重的焦虑，抑郁，白天过度嗜睡，或精神障碍)，从临床医师的角度，这些状态严重影响认知功能测试。

二、疗效评价标准：评定标准：用PD统一评分量表(UPDRS)第III部分和Heohn-Yahr(HY)分级量表评估患者的运动症状严重程度。用PD统一评分量表(UPDRS)第II部分和日常生活能力问卷(ADCS-ADL)评估患者的日常生活能力。用PD统一评分量表(UPDRS)第I部分评估患者精神、行为和情绪。应用简易智能量表(MMSE)作为筛选手段，蒙特利尔认知评估量表(MOCA)对轻度认知功能障碍进行评定。Fuld物体记忆测验(FOM)评定短时记忆，言语流畅性测验(RVR)评定长时记忆和语言功能；积木测验(BD)评定空间结构能力；数字广度测验(DS)评定注意与瞬间记忆。用汉密尔顿抑郁量表(HRSD)和汉密尔顿焦虑量表(HAMA)评估患者的抑郁和焦虑状况。

(三)治疗方法：联合组以美多芭片(每片0.25g，每次服1/2片，每日3次，一周后改为每次1/2片，每日2次，餐后1个半小时服)为基础治疗，同时加服舒更胶囊(青海金诃藏药生产，每粒0.3克)，一次4粒，一日3次。具有发热、颅压高、严重感染、高血压、糖尿病等症状或体征者给予相应处理；对照组以美多芭片(每片0.25g，每次服1/2片，每日3次，一周后改为每次1/2片，每日2次，餐后1个半小时服)为基础治疗，同时加服安慰剂；单独组服用舒更胶囊(青海金诃藏药生产，每粒0.3克)，一次4粒，一日3次，同时加服安慰剂。分别于治疗后1个月、3个月和6个月进行评定。

(四)治疗效果：

1、精神、行为和情绪(UPDRS-I)评分：治疗组经治疗后，精神、行为和情绪积分较对照组有明显改善，统计学具有显著性意义(P＜0.05)，见表7。

2、日常生活活动(UPDRS-II)评分：治疗组经治疗后，日常生活活动积分较对照组有明显改善，统计学具有显著性意义(P＜0.05)，见表8。

3、帕金森病生活质量评分量表(PDQ)评分：治疗组经治疗后，帕金森病生活质量评分量表积分较对照组有明显改善，统计学具有显著性意义(P＜0.05)，见表9。

表7精神、行为和情绪(UPDRS-I)评分比较(x±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与单独组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

表8日常生活活动(UPDRS-II)评分比较(x±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与单独组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

表9帕金森病生活质量评分量表(PDQ)评分比较(x±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与单独组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

(五)小结：

使用舒更胶囊治疗后，对于帕金森病患的精神、行为和情绪(UPDRS-I)评分、日常生活活动(UPDRS-II)评分及生活质量评分量表(PDQ)评分均有显著改善，特别对日常活动和生活质量提升尤为显著，其中联合用药的效果明显好于单用西药或单用舒更胶囊。整体而言，服用1个月后，单独组、联合组效果与对照组比较，效果并不明显；而3个月乃至6个月后，单独组及联合组的效果优势非常突出，个别指标上单独组的效果甚至优于对照组，这也与中药治本但起效慢的常识相一致。

典型病例

1、杨某，女，64岁，病程4年。患者时有手足颤抖，略有认知障碍，症状时轻时重。曾去数家医院治疗，症状曾略有缓解但未坚持治疗。随后，手足、头部颤抖症状逐渐加重，难以持物，睡眠差，健忘，生活难以自理。后采用舒更胶囊进行治疗，具体为：以美多芭片(每片0.25g，每次服1/2片，每日3次，一周后改为每次1/2片，每日2次，餐后1个半小时服)为基础治疗，同时加服舒更胶囊(青海金诃藏药生产，每粒0.3克)，一次4粒，一日3次，其它采用对症治疗。

经治疗2月后，患者手足颤抖基本消失，头部震颤明显减轻，睡眠、健忘症状有所改善。继续服用2月，诸症状基本消失，生活能够自理；继续服药2月以巩固疗效，症状未曾复发。

2、吴某某，男，72岁，病程6年。患者头部震颤严重，足部颤抖无力，无法行走，少气懒言，健忘失眠，同时血压、血糖偏高。曾多方诊治，效果并不明显。后采用舒更胶囊进行治疗，具体为：以美多芭片(每片0.25g，每次服1/2片，每日3次，一周后改为每次1/2片，每日2次，餐后1个半小时服)为基础治疗，同时加服舒更胶囊(青海金诃藏药生产，每粒0.3克)，一次4粒，一日3次；控制血压用吲哒帕胺等，其它采用对症治疗措施。

经治疗3个月后，患者头部和手部震颤基本消失，足部颤抖显著减轻，能行走，乏力、少气懒言、健忘失眠有所好转，饮食转佳。继续服用2个月，诸症状基本消失，继续服药以巩固疗效，1年后随访症状未曾复发。

以下实施例均能实现上述实验例的效果。

实施例所使用的舒更胶囊为青海金诃藏药药业股份有限公司生产的产品。

实施例1、舒更胶囊在制备治疗帕金森病药物中的应用

其用法用量为：口服，一次4粒，每粒0.3克，一日3次，同时联合服用美多芭片。

实施例2、舒更胶囊在制备治疗帕金森病药物中的应用

其用法用量为：口服，一次4粒，每粒0.3克，一日3次。

实施例3、舒更胶囊在制备具有神经保护作用药物中的应用

其用法用量为：口服，一次4粒，每粒0.3克，一日3次。

实施例4、舒更胶囊在制备具有神经保护作用药物中的应用

其用法用量为：口服，一次3粒，每粒0.3克，一日3次。

实施例5、舒更胶囊在制备具有保护谷氨酸所致神经损伤药物中的应用

其用法用量为：口服，一次3粒，每粒0.3克，一日3次。

实施例6、舒更胶囊在制备具有保护自由基所致神经损伤药物中的应用

其用法用量为：口服，一次4粒，每粒0.3克，一日3次。

Claims (5)

1.舒更胶囊在制备治疗帕金森病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，特征在于，其用法用量为口服，一次3～4粒，一日3次。

3.根据权利要求1或2所述的应用，特征在于，舒更胶囊单独使用或联合其他具有神经保护作用的药物共同使用。

4.根据权利要求3所述的应用，特征在于，舒更胶囊单独使用或联合美多芭片使用。

5.根据权利要求1所述的应用，特征在于，使用时间1个月以上。