CN105177004B - 山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用 - Google Patents
山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105177004B CN105177004B CN201510645673.7A CN201510645673A CN105177004B CN 105177004 B CN105177004 B CN 105177004B CN 201510645673 A CN201510645673 A CN 201510645673A CN 105177004 B CN105177004 B CN 105177004B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mir171d
- hickory nut
- plant
- arabidopsis
- florescence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000899834 Obovaria olivaria Species 0.000 title claims abstract description 38
- 108091028180 miR171d stem-loop Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title claims abstract description 31
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 claims description 33
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 8
- 230000011890 leaf development Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 12
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 5
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 229920000297 Rayon Polymers 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000758789 Juglans Species 0.000 description 2
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000056139 Brassica cretica Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 241000723418 Carya Species 0.000 description 1
- 240000004875 Carya cathayensis Species 0.000 description 1
- 235000005663 Carya cathayensis Nutrition 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 244000147058 Derris elliptica Species 0.000 description 1
- 244000264601 Juglans mandschurica Species 0.000 description 1
- 235000014075 Juglans mandschurica Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 240000005373 Panax quinquefolius Species 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000031016 anaphase Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005314 correlation function Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008124 floral development Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical class OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用。应用山核桃miR171d，有望人为地调控植物的花期或叶片发育。
Description
技术领域
本发明涉及基因功能领域，更具体地涉及山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于动植物中，含有茎环结构的miRNA前体,经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子(18-25个核苷酸)。miRNA通过在转录水平或者转录后水平对基因组上的靶基因抑制其翻译或者切割靶基因来调控基因表达，在基因表达中起负调控其靶基因作用。miRNA在植物从成花诱导到花器官特征属性形成的整个花发育过程均发挥着关键作用。
山核桃(Carya cathayensis Sarg.)属胡桃科山核桃属植物，雌雄同株，主要分布于浙江西部地区以及安徽地区，是我国特有的名优干果和木本油料树种，是山区农民脱贫致富的重要途径；然而，山核桃从种子播种到结果需要10余年的时间，从而较大程度抑制了山核桃的产量，如何缩短童期促进早实是山核桃研究者亟待解决的难题。
模式植物miR171d的相关功能研究很早就有报道。2002年David P.Bartel等从拟南芥幼苗和花中分别克隆了大量的小RNAs，Northern分析发现ath-miR171d在花中表达量较高；2002年James C.Carrington等的研究发现，miR171d在拟南芥、水稻和烟草的花中积累量相对比较高，而在叶和茎秆中表达量较少或不能被检测到；2005年Vincent L.Chiang等发现miR171d在毛果杨茎杆中特异表达，可能参与了木质组织的形成，木质组织机械损伤胁迫导致ptr-miR171d下降；miR171d在小麦的各种组织中都有表达，特别是根中相对较高(孙其信，2007)；2009年薛红卫等对水稻miRNA做了表达谱分析，得出osa-miR171dg/h在水稻根中选择性优先表达。可见miR171d在不同植物的各个组织中表达及功能是有差异的。山核桃miR171d的功能作用尚未知晓。
发明内容
本发明提供了山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用。
山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用，所述山核桃miR171d的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述植物是拟南芥或烟草。
优选地，所述植物是拟南芥。
获得山核桃miR171d转基因植株的具体方法包括：将包含所述山核桃miR171d的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。
由于山核桃成熟miR171d本身序列很短，只有21bp，而其前体序列相对较长，连接到载体上，有利于转化实现，优选地，所述前体基因的碱基序列如SEQIDNO.2所示。
本发明提供了山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用。应用山核桃miR171d，有望人为地调控植物的花期或叶片发育，具体地，有望人为地调控山核桃的花期或叶片发育。
附图说明
图1为山核桃花芽的总RNA
图2为山核桃miR171d前体的中间载体菌液PCR检测
图3为山核桃miR171d前体的表达载体菌液PCR检测
图4为山核桃miR171d转基因拟南芥植株的抗性筛选
图5为山核桃miR171d转基因拟南芥的PCR检测
图6为野生型、拟南芥miR171d突变体和山核桃miR171d转基因拟南芥的叶片数目统计
图7为观察到的野生型、拟南芥miR171d突变体和山核桃miR171d转基因拟南芥叶片的表型
图8为观察到的野生型、拟南芥miR171d突变体和山核桃miR171d转基因拟南芥的表型
具体实施方式
1.材料
1.1实验材料
山核桃花芽采自浙江省杭州市临安板桥村，选取不同株山核桃树进行采样。样品采下后立即液氮保存，带回实验室并放置在-80℃冰箱保存待用。另外，购买转了拟南芥miR171d的拟南芥突变体种子(购于美国ABRC)。
1.2实验试剂与仪器
DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、Marker和TRIzol试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒及DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。PCR仪为美国PE9700PCR仪，超净工作台购自苏州诚净净化科技有限公司。
1.3引物合成及测序
引物合成及测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
2.方法
2.1山核桃花芽总RNA的提取
采用改良CTAB+Trizol法提取花芽样品总RNA，步骤如下：
(1)在10mL离心管中加入3mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液(10％CTAB，10％PVP40，1.0M Tris-HCl(pH 8.0)，5M NaCl，0.6M EDTA(pH8.0))，加入200μLβ-巯基乙醇；
(2)取-70℃保存的花芽2g，放入液氮充分预冷的研钵中，于液氮中充分研磨至百色粉末；
(3)将白色粉末迅速转入预热的提取液中，立即充分振荡混匀，65℃水浴30min，期间振荡3-4次；
(4)在混合物中加入等体积的25:24:1(酸性饱和酚：氯仿：异戊醇)，约3ml。混合均匀后14000rpm离心10min(常温)；
(5)取上清转入新的10ml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)上下颠倒混匀，12000rpm4℃离心10min后取上清；
(6)重复步骤4一次，直至中间层消失；
(7)上清转移至1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇后放置于-20℃冰箱冷冻30min。12000rpm4℃离心10min弃掉上清，沉淀加入65℃预热好的SSTE400μL溶液至全溶；
(8)溶液中加入1mLTRIzol试剂，室温静置5min。再加入200μL氯仿摇匀，室温静置2-3min；
(9)4℃12000rpm离心15min；
(10)吸取上清，加入等体积异丙醇，室温静置10min；
(11)4℃12000rpm离心10min，弃掉上清，肉眼可见RNA沉于管底；
(12)加入1mL预冷的75％乙醇洗涤沉淀，温和振荡，8000rpm4℃离心5min，弃掉上清；
(13)重复步骤11，并将沉淀真空干燥7-10min；加入适量DEPC水溶解沉淀，-80℃保存备用。
2.2cDNA合成
使用TAKARA试剂盒Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit，详细内容如下：
(1)在经过DEPC处理过的PCR管中配置下列反应体系:
(2)65℃保温5min，冰上迅速冷却。(模板RNA变性)
(3)再次配置反应体系如下：
(4)缓慢摇匀。
(5)42℃反应30-60min。
(6)95℃5min酶失活后，冰上冷却。
2.3前体序列的引物设计
依据前体序列：
CTTCAGCTATCACTGCATGGTATTTTTCTTTCAACCTAGCTAGCTTCTTGTTGATTTCTTCTTTTTATCATCGAGTCTTTTTACTTTGATCCTCCGAAATATATGTAGCTTTTGCATATATATATATATGTTCCTTCATGGCCGTGTTCATGATCATTGGGAATACGTGCAAGAAGATCAGGGATTCCAGGAGTATACATATGTGAAATAGCTACTTTGATATTGGCCTGGTTCACTCAGACGAAAAACAAAGCAGTCAATGGGGAGTGTACGTCACTAGCTTTTCTTTTCTTTTCTAATTTGATTGAGCCGTGCCAATATCTCAGTGCTCTTTCATTTCTTCCGGACTCTCATCACTACAATACTTGAGGCCGAGATCAACATACCAATCAAAACGTTTGATAATTTATCTTCGATAATGGGAAAATTAGTTTCATTATATATGCGTTGTGGGCTTCATTTGTTATTAATCTCATGCAGTTTTTCTATTTGATTATTCATGAGTTCTCATGCAGCAAAGAAGGTGCTGCTTTTGGCTTCAGC，使用Primer Primer 5.0设计引物，引物两端分别加上酶切位点KpnI和XbaI，正向引物：5’-GGGGTACCGCTAGCTTCTTGTTGATTTC-3’,反向引物：5’-GCTCTAGATAATAACAAATGAAGCCCAC-3’克隆所需序列。
2.4PCR扩增反应
以山核桃cDNA为模板扩增，反应体系如下：
PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min。30个循环后，72℃延伸10min。PCR反应完成后4℃暂时保存，其中退火温度可根据Tm值进行调整。
2.5琼脂糖凝胶电泳检测与胶回收
将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为TAE(40mM Tris-乙酸盐，1mM EDTA)，核酸燃料为EB。紫外光检测电泳结果并回收PCR产物。利用上海生工公司的DNA胶回收试剂盒进行胶回收，具体步骤如下：
(1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀片将含有目的DNA的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5mL离心管中。每个胶块尽量不要超过400mg，否则将会导致溶胶不完全。另外切胶过程应尽可能快，从而减少DNA在紫外线中暴露时间来降低对DNA的损伤。
(2)根据胶块的质量和浓度，每100mg琼脂糖加300～600μL的比例加入Buffer B2。
(3)置于55℃金属浴10min，期间混匀2～3次直至胶块完全溶化为止。
(4)当目的片段＜500bp时，可加入1/3体积的Buffer B2的异丙醇，混匀。若≥500bp，则此步骤可以省略。
(5)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8,000xg离心30sec。倒掉收集管中的液体，并将吸附柱放入同一个收集管中。
(6)加入500μL Wash Solution，9000xg离心30sec。再次倒掉收集管中的液体。
(7)重复一次步骤6。
(8)将带有收集管的吸附柱放入离心机，9000xg空离1min。扔掉收集管，并将吸附柱置于灭过菌的1.5mL EP管中。
(9)打开吸附柱的盖子，室温放置10min。为了去除残留的酒精，否则会严重影响回收得率和后续实验结果。
(10)在吸附膜中央加入15-30μL ddH2O。室温静置5min，9000xg离心1min。1.5mLEP管底部收集的DNA溶液即为回收的DNA，-20℃保存。
2.6 DNA回收片段与PMD-19T载体连接
根据PMD19-T载体使用说明书，在灭过菌的PCR反应管中将Vector与回收DNA片段进行T-A克隆连接，反应体系如下：
轻轻混匀后16℃过夜连接10h以上，转化DH5α感受态。
2.7连接产物转化DH5α感受态
转化感受态具体操作步骤如下：取出适量DH5α感受态细胞并至于冰上冻融。在超净工作台内向冰冷的感受态细胞中加入上述连接混合液，并用移液器吸头轻轻吸打混匀。置于冰上20min。快速平稳放入42℃水浴中60s(热激，使细胞膜开放，重组质粒进入细胞)，并迅速放入冰水混合物中，保持2min(使细胞膜关闭)。加入500μL无抗LB液体培养基，37℃恒温振荡培养1h。室温下4000rpm离心5min，弃掉上清(保留少许培养基，约50μL)。超净台内，用枪头轻轻吸打并重悬菌液，涂于氨苄抗性平板。倒置琼脂平板于37℃，平板通常在37℃温育14h。
2.8重组子的筛选和鉴定
用10μL小号枪头挑取平板上至少5个单菌落(每个菌落均做好标记)，并置于含有800μL LB培养基(含相应抗生素)的1.5mL EP管中，37℃振荡培养4h左右至培养基浑浊，并对培养基浑浊的菌样进行菌检验证，菌检验证载体构建成功的菌液取1mL送上海生工测序。利用BLAST、CLUSTAL、MEGA4.0等软件对序列进行分析。
2.9表达载体的构建
将测序获得完全正确的序列，提取质粒后用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切中间载体和表达载体pCAMBIA13011(pC13011)，再用T4连接酶连接经过双酶切的pC13011载体和miRNA171d前体片段，然后转化到大肠杆菌中提取质粒酶切验证。
2.10转化农杆菌
2.10.1电击杯的处理
(1)用移液枪吸取ddH2O反复冲洗电击杯3-5次。
(2)用75％的乙醇反复冲洗电击杯3-5次。
(3)将电击杯浸泡在无水乙醇中2h，然后倒掉乙醇，置于超净工作台中让残余酒精挥发。
(4)酒精挥发完全后，盖好电击杯盖子，室温保存备用。
2.10.2电转化
采用仪器为伯乐公司GenePμLser Xcell电穿孔仪进行感受态细胞的转化。主要参数为：电脉冲2.5μF、电压2.5kV、电阻200Ω。操作步骤如下：
(1)取出保藏的农杆菌GV3101感受态细胞放置冰上融化。
(2)取1μL质粒加入到解冻的感受态细胞中，轻轻混匀。
(3)将混合液加到电击杯中(-20℃预冷)，在电脉冲为2.5μF、电压2.5kV、电阻200Ω的参数条件下电击。
(4)取出电击杯，迅速加入800μL预热的无抗的YEP液体培养基，悬浮细胞后，转移到1.5mL的离心管中。
(5)28℃，220rpm震荡培养2h左右。
(6)取30-40μL菌液，用无菌的涂布棒将菌液均匀的涂在含有相应抗生素YEP平板上，倒置放入28℃培养箱培养2-3天。
2.10.3电转化农杆菌及其检测
将酶切验证正确的pC13011-miRNA171d质粒转化到农杆菌GV3101中，再从农杆菌中提取质粒后，转化到大肠杆菌中提质粒，酶切验证。验证正确的含有pC1301-miRNA171d质粒的农杆菌，-70℃保存菌种。
2.11拟南芥遗传转化及其转基因植株纯合子的筛选
2.11.1拟南芥的种植
(1)将野生型拟南芥种子均匀撒在1/2MS固体培养基中。
(2)4℃冰箱避光春化处理3天。
(3)3天后，移至培养室培养，条件为温度23℃，光强7000-9000Lx，光照16小时，黑暗8小时。
(4)待拟南芥长出2片子叶和2片真叶后，将其移植到含基质的盆中，继续培养。
2.11.2拟南芥的遗传转化
(1)农杆菌菌液的准备：配制含有卡那霉素和利福平的YEP固体培养基，倒平板，划线以活化保存的农杆菌，28℃倒置培养2天。挑单菌落至1mL含相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养2天，再转移至100mL相同的培养基中扩大培养，直至培养液浑浊变为橙色，测其OD值达到1.2时停止培养。
(2)4000rpm，离心10min，倒掉上清液，用浸染介质悬浮菌体。
(3)浸花法转化拟南芥
a.选取开花初期的拟南芥，将花序浸入含有目的基因农杆菌的转化介质中，约10-20秒。
b.将浸染过的拟南芥植株平放于一个大容器中，避光培养24小时。
c.第二天，放置正常条件下继续培养。
d.收获拟南芥种子，干燥。
2.11.3拟南芥转基因种子的筛选及种植
(1)将转基因种子均匀撒在1/2MS的固体培养基中(培养基中潮霉素的浓度为50mg/L)。同时将野生型拟南芥种子撒在不含潮霉素培养基中，作为对照。
(2)4℃避光春化处理3天。
(3)3天后将撒有野生型拟南芥种子的培养皿打开，置于培养室中正常培养，而含有转基因种子的培养皿则避光培养。
(4)48小时后，将含有转基因种子的培养皿置于光下正常培养。转基因成功的植株就会生长，反之不生长。
(5)待拟南芥长出2-4片真叶后，移植到含有泥炭的盆中，继续培养。
(6)观察对照拟南芥(野生型拟南芥和拟南芥miR171d突变体)和山核桃miR171d转基因拟南芥的生长情况。
3.实验结果
3.1山核桃花芽总RNA提取分析
利用改良CTAB+TRizol法提取山核桃花芽总RNA，并通过紫外分光光度计测定每个RNA样品260nm及280nm的吸光度，并以此计算RNA的浓度及纯度，并在1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。所提山核桃RNA的光密度比值均在2.0-2.2之间，说明总RNA基本无糖类、酚及蛋白质的污染；电泳结果则显示RNA样品的18s和28s两条带非常清晰，可推断RNA没有降解，符合下步实验的要求(图1)。
3.2山核桃miR171d前体序列的克隆
根据所设计的引物序列，使用PCR扩增，产物经连接到pMD19-T(simple)，菌检PCR进行检测(图2)，并送到上海生工测序，验证了山核桃miRNA171d前体的存在。
3.3 miRNA171d功能验证
依据3.2中所获得前体序列，进行表达载体的构建，将miRNA171d前体序列连接到pC13011表达载体上，转化到DH5α感受态细胞中，同时对其进行菌液PCR检测(图3)，将连接成功的单克隆提取质粒，转化到土壤农杆菌GV3101中，进行拟南芥转基因。对山核桃miRNA171d转基因拟南芥植株进行抗性筛选(如图4)，将筛选出的拟南芥体取DNA，进行PCR检测(图5)。筛选到纯合后，对其表型进行观察，可以发现转基因植株在2015年3月26日-2015年4月4日期间，叶片发育受到抑制，叶片数量明显少于野生型和拟南芥miRNA171d突变体植株(图6)，而到后期叶片数量增多，转基因拟南芥植株叶片变狭长(图6、7)，同时发现，转基因植株与拟南芥miRNA171d突变体和野生型相比，花期延迟(图8)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用，包括：将包含所述山核桃miR171d的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系，其特征在于，所述山核桃miR171d的前体基因的碱基序列如SEQ IDNO.2所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510645673.7A CN105177004B (zh) | 2015-10-08 | 2015-10-08 | 山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510645673.7A CN105177004B (zh) | 2015-10-08 | 2015-10-08 | 山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105177004A CN105177004A (zh) | 2015-12-23 |
| CN105177004B true CN105177004B (zh) | 2018-03-30 |
Family
ID=54899433
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510645673.7A Expired - Fee Related CN105177004B (zh) | 2015-10-08 | 2015-10-08 | 山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105177004B (zh) |
-
2015
- 2015-10-08 CN CN201510645673.7A patent/CN105177004B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Isolation and Identification of miRNAs in Jatropha curcas;Wang et al;《Int. J. Biol. Sci.》;20120831;418-429 * |
| LOST MERISTEMS genes regulate cell differentiation of central zone descendants in Arabidopsis shoot meristems;Silke et al;《The Plant Journal》;20101231;668–678 * |
| Over-expression of microRNA171 affects phase transitions and floral meristem determinancy in barley;Curaba et al;《BMC Plant Biology 》;20131231;摘要，第8页右栏第2-3段，图1-5，Additional file 1-7 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105177004A (zh) | 2015-12-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114480431B (zh) | 玉米ZmBES1/BZR1-10基因在提高植物耐旱性和产量中的应用 | |
| CN110373413A (zh) | 光皮桦miR169a的前体基因及其在降低植物低氮胁迫耐受性中的应用 | |
| CN109536496A (zh) | 文冠果miR169a的前体基因和及其在提前植物开花中的应用 | |
| CN104404043B (zh) | 疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子 | |
| CN110628789B (zh) | 一种抗虫低酚棉花品种的育种方法 | |
| CN109355297B (zh) | 铁皮石斛DcWOX4基因及其在提高植物茎分蘖中的应用 | |
| CN109055371B (zh) | 光皮桦miR169c的前体基因及其在提前植物开花中的应用 | |
| CN110904106B (zh) | 春兰miR159b在增强植物冷敏感性中的应用 | |
| CN105177004B (zh) | 山核桃miR171d在延迟植物花期或植物叶片发育中的应用 | |
| CN105177003B (zh) | 山核桃miR398a在降低植物重金属胁迫耐受性中的应用 | |
| CN110951771B (zh) | 春兰miR390a在控制植物根系发育中的应用 | |
| CN105255890B (zh) | 山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生组织发育中的应用 | |
| CN112662688B (zh) | 核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1在油脂合成与积累中的应用 | |
| CN115161332A (zh) | 一种刺葡萄VdERF2基因及其编码蛋白和应用 | |
| CN108866059B (zh) | 山核桃miR159a的前体基因及其在提前植物开花中的应用 | |
| CN108588069B (zh) | 桑树miR171a的前体基因及其在增强植物耐盐性中的应用 | |
| CN111304220B (zh) | 一种春兰CgWRKY3基因及其应用 | |
| CN105925602B (zh) | 山核桃miR169在提前植物花期中的应用 | |
| CN111893116A (zh) | 杨树miR167a的前体基因及其在提前植物开花中的应用 | |
| CN111961672A (zh) | 水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15的克隆及应用 | |
| CN111304198B (zh) | 春兰miR390b在控制植物营养器官发育中的应用 | |
| CN116254288B (zh) | 一种春兰MIR156b基因在调控植物开花时间中的应用 | |
| CN110964724B (zh) | 春兰miR390c在增强植物抗寒性中的应用 | |
| CN110982921B (zh) | 春兰miR159a在加快植物生命周期中的应用 | |
| CN116179590B (zh) | 一种春兰miR396基因在调控植物茎增粗中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20180330 Termination date: 20201008 |