CN105175379B - 一种黄酮类物质的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种黄酮类物质的提取方法，能够高效的从茶叶中分离黄酮类物质，从而弥补现有技术的不足。本发明的方法，包括有粗提物的制备、络合物的制备和金属络合物解离步骤。本发明以茶叶为原料来提供黄酮类物质，提取物中黄酮类化合物含量达到50％以上。与已有的方法相比，不但纯化周期大大缩短，而且不影响黄酮类物质的得率和纯度。
Description
技术领域
本发明属于活性物质提取技术领域，具体涉及一种黄酮类物质的提取方法。
背景技术
茶叶中含有丰富的黄酮类化合物，黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化、抗癌、抗菌等多种生理活性及药理作用,且无毒无害,对治疗和预防肿瘤、心血管病等疾病的有显著的效果，对延缓人体的衰老有重要意义，因阳黄酮成为近年来研究、开发和利用的热点。但目前的黄酮类化合物的纯化主要有硅胶柱层析法和大孔树脂吸附法，纯化周期较长。因此，寻求一种更加方便快捷、生产周期短的纯化方法成为研究热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄酮类物质的提取方法，能够高效的从茶叶中分离黄酮类物质，从而弥补现有技术的不足。
本发明的方法，包括如下步骤：
1)粗提物的制备：
将茶叶研磨成粉后，加入水后，再加入纤维素酶进行酶解，酶解1-3h后，加入乙醇至终浓度为60-90％，进行超声波浸提，浸提3-4h后；将浸提液浓缩、干燥，制成粗提物；
2)络合物的制备
将步骤1)制成的粗提物用浓度为70～75％的乙醇溶解，制成浓度为10～20mg/mL的溶液，在搅拌条件下加入乙酸锌盐溶液；调节溶液的pH值为8～10，进行络合反应，反应结束后收集金属络合物沉淀；
3)金属络合物的解离：
将步骤2)所得金属络合物溶解于浓度为30～35％的乙醇中，加入EDTA进行解络合反应，振荡反应至沉淀完全溶解，冷却至室温，旋转蒸干，用甲醇溶解过滤，将滤液浓缩、干燥即得纯化后的茶叶黄酮类化合物。
步骤2)的络合反应温度为50～60℃，络合反应时间为30～60min。
步骤3)中EDTA的加入终浓度为15-40mg/ml，
步骤3)中解络合反应温度为55～65℃。
为了提高制成的茶叶黄酮类化合物的纯度，将步骤3)制成的茶叶黄酮类化合物用清洗液进行清洗；
所述的清洗液，为浓度为20％的乙醇丙酮水溶液，其中乙醇和丙酮的体积比为2:1。
本发明以茶叶为原料来提供黄酮类物质，提取物中黄酮类化合物含量达到50％以上。与已有的方法相比，不但纯化周期大大缩短，而且不影响黄酮类物质的得率和纯度。
具体实施方式
本发明利用紫外‐可见光谱法测定黄酮类物质的含量，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法进行显色。黄酮提取物以Al(NO3)3‐NaNO2‐NaOH体系显色后于500nm处测得总黄酮的吸光度。
使用的仪器如下：
紫外‐可见分光光度计
分析天平(分度值0.0001g)
使用的试剂如下：
三氯化铝、亚硝酸钠、氢氧化钠：分析纯
水：去离子水或二次蒸馏水
乙醇：分析纯
芦丁对照品
具体方法如下：
1、芦丁对照品溶液的制备
取芦丁对照品约20mg，精密称定，置于100mL容量瓶中，加60％乙醇适量，超声处理使之溶解，放置至室温，加60％乙醇至刻度，摇匀，即得芦丁对照品储备液。
2、标准曲线的制作
分别精密量取芦丁对照品储备液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0ml置于25mL容量瓶中，用30％乙醇补足至6ml，加5％NaNO21ml，静置6min，然后加入10％AlNO31ml，静置6min，最后加入4％NaOH10ml，30％乙醇定容后静置15min，并在500nm下测定吸光度，以芦丁对照品溶液浓度(x，mg/mL)为横坐标，吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线,得线性回归方程y＝k1x+b1。
3、供试品溶液的制备
取本品约100mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加60％乙醇适量，超声处理使之溶解，放置至室温，加60％乙醇至25ml，摇匀，即得置于25ml供试品储备液。
4、测定方法
精密量取2mL供试品储备液，置25ml容量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“用30％乙醇补足至6ml”起依法测定，吸光度记为A1。
5、黄酮含量的计算
具体公式如下：
式中A1为Al(NO3)3-NaNO2-NaOH显色法测得的总黄酮吸光度值，控制在0.2～0.8范围内，如果吸光度超过此范围，则可通过稀释样品溶液来控制，n为样品溶液的稀释倍数。k1和b1分别为AlCl3显色法标准曲线的斜率和截距，W为样品中黄酮的质量分数(％)，m为样品的称样量(mg)。
以下结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
1)粗提物的制备：
将产自崂山的茶树叶子烘干研磨成粉并过40目筛，得到100g的茶叶粉末，加入300ml的水进行溶解后，加入纤维素酶在30℃下进行酶解2h，其中纤维素酶用量为10U/g(茶叶)。酶解结束后，加入乙醇至浓度为70％，然后置于功率为250W的超声波设备中处理30min，再置于50℃水浴条件下浸提3h。将浸提液进行旋转蒸发浓缩、干燥，即得到粗提物。
2)金属络合物的制备
将步骤1)所得茶叶黄酮类化合物的粗提物用70％乙醇溶液配制成浓度为15mg/mL的溶液，用磁力搅拌器边搅拌边加入浓度为5mg/mL的乙酸锌溶液100ml，设置络合反应温度为55℃，用10％NaOH溶液调pH值为8，反应30min后，收集沉淀，该沉淀即为茶叶黄酮-金属络合物。
3)茶叶黄酮-金属络合物的解离
将步骤2)所得茶叶黄酮-金属络合物均匀分散溶解于浓度为30％的乙醇溶液中，按0.15g/g茶叶黄酮-金属络合物加入EDTA，设置解络合反应温度为65℃，振荡反应至沉淀完全溶解，冷却至室温，旋转蒸干，用甲醇溶解过滤，将滤液浓缩、干燥即得纯化后的含有茶叶黄酮类化合物的干粉。
按照黄酮的检测方法对最后制备的干粉进行测定，结果表明其最终获得的提取物中黄酮类物质的质量百分比含量为58.2％。
实施例2
1)粗提物的制备：
将产自崂山的茶树叶子烘干研磨成粉并过40目筛，得到100g的茶叶粉末，加入300ml的水进行溶解后，加入纤维素酶在25℃下进行酶解2h，其中纤维素酶用量为10U/g(茶叶)。酶解结束后，加入乙醇至浓度为90％，然后置于功率为250W的超声波设备中处理30min，再置于50℃水浴条件下浸提3h。将浸提液进行旋转蒸发浓缩、干燥，即得到粗提物。
2)金属络合物的制备
将步骤1)所得茶叶黄酮类化合物的粗提物用70％乙醇溶液配制成浓度为15mg/mL的溶液，用磁力搅拌器边搅拌边加入浓度为5mg/mL的乙酸锌溶液100ml，设置络合反应温度为55℃，用10％NaOH溶液调pH值为8，反应30min后，收集沉淀，该沉淀即为茶叶黄酮-金属络合物。
3)茶叶黄酮-金属络合物的解离
将步骤2)所得茶叶黄酮-金属络合物均匀分散溶解于浓度为30％的乙醇溶液中，按0.15g/g茶叶黄酮-金属络合物加入EDTA，设置解络合反应温度为65℃，振荡反应至沉淀完全溶解，冷却至室温，旋转蒸干，用甲醇溶解过滤，将滤液浓缩、干燥即得纯化后的含有茶叶黄酮类化合物的干粉。
按照黄酮的检测方法对最后制备的干粉进行测定，结果表明其最终获得的提取物中黄酮类物质的质量百分比含量为56.1％。
为了提高制成的茶叶黄酮类化合物的纯度，将步骤3)制成的含有茶叶黄酮类化合物的干粉用清洗液进行清洗。使用的清洗液为浓度为20％的乙醇丙酮水溶液，其中乙醇和丙酮的体积比为2:1。对最终的终获得的提取物进行分析，提取物中黄酮类物质的质量百分比含量为升高为67.3％；且换算后黄酮类物质的总量没有变化，表明用清洗液进行清洗后明显提高了纯度。
上述清洗液中有机溶液的组成及配比进行了优化，实验结果表明，如果使用更低浓度的乙醇丙酮水溶液，则不会导致纯度发生变化，而使用更高浓度的有机溶剂，则会导致黄酮类物质的流失，导致得率下降。
Claims (5)
1.一种黄酮类物质的提取方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)粗提物的制备：
将茶叶研磨成粉后，加入水后，再加入纤维素酶进行酶解，酶解1-3h后，加入乙醇至终浓度为60-90％，进行超声波浸提，浸提3-4h后；将浸提液浓缩、干燥，制成粗提物；
2)络合物的制备
将步骤1)制成的粗提物用浓度为70～75％的乙醇溶解，制成浓度为10～20mg/mL的溶液，在搅拌条件下加入乙酸锌盐溶液；调节溶液的pH值为8～10，进行络合反应，反应结束后收集金属络合物沉淀；将金属络合物用清洗液进行清洗；其中清洗液是浓度为20％的乙醇丙酮水溶液，其中乙醇和丙酮的体积比为2:1；
3)金属络合物的解离：
将步骤2)清洗后的金属络合物溶解于浓度为30～35％的乙醇中，加入EDTA进行解络合反应，振荡反应至沉淀完全溶解，冷却至室温，旋转蒸干，用甲醇溶解过滤，将滤液浓缩、干燥即得纯化后的茶叶黄酮类化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)的络合反应温度为50～60℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)的络合反应时间为30～60min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中EDTA的加入终浓度为15-40mg/ml。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中解络合反应的温度为55～65℃。
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