CN105142662B - Idh1 r132h突变阳性癌症治疗或诊断的手段与方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤治疗及诊断领域。具体而言，本发明涉及一种包含至少8个以连续氨基酸序列形式存在于I型人异柠檬酸脱氢酶中的氨基酸长度的肽，其中所述肽的至少一个氨基酸在与132位点相对应的位点上由R置换为H，用于预防和/或治疗癌症。本发明进一步预想为包含所述肽的药剂。另外，本发明涉及一种诊断具有以下特点癌症的方法：至少一些癌细胞的基因组发生突变，导致具有R132H突变的IDH1突变体表达，该方法包括如下步骤：使用包含至少10个以连续氨基酸序列形式存在于IDH1中的氨基酸长度的肽接触怀疑患有该肿瘤受试者的血液样本，其中在允许免疫系统成分特异性结合到肽上并能确定免疫系统的上述成分是否结合到肽上的一段时间和条件，所述肽的至少一个氨基酸在与132位点相对应的位点上由R置换为H，其中如果确定发生结合就可以诊断癌症。本发明还提供实施该方法的试剂盒和装置。

Description

IDH1 R132H突变阳性癌症治疗或诊断的手段与方法
本发明涉及肿瘤治疗及诊断领域。具体而言，本发明涉及一种包含至少8个氨基酸长度的作为I型人异柠檬酸脱氢酶(IDH1)中连续氨基酸序列形式存在的肽，其中该肽的至少一个氨基酸在与132位点相对应的位点上由R置换为H，用于预防和/或治疗癌症。本发明进一步设想为包含所述肽的药剂。另外，本发明涉及一种诊断具有以下特点癌症的方法，其中至少有一些癌细胞的基因组发生突变，导致具有R132H突变的IDH1突变体的表达，该方法包括如下步骤：使包含至少10个氨基酸长度的作为IDH1中连续氨基酸序列存在的肽与怀疑患有该种肿瘤的受试者的血液样本在使得免疫系统成分特异性结合到该肽的条件下接触一段时间，并且确定该免疫系统成分是否结合到肽上，其中如果确定发生了结合，则诊断为癌症，其中，该肽的至少一个氨基酸在与132位点相对应的位点上由R置换为H。本发明还提供了实施该方法的试剂盒和装置。
成胶质细胞瘤(GBM)序列分析的一个意外发现是，编码胞质NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶(IDH1)的基因发生突变(Parsons 2008,Science 321(5897):1807-12)。最近的研究报道称IDH1基因突变导致约70％的间变性胶质瘤和12％的成细胞胶质瘤132位点的氨基酸置换(Balls 2008,Acta Neuropathol 116(6):597-602,Yan 2009,N Engl J Med.360(8):765-73,Watanabe 2009,Am J Pathol.174(4):1149-53,De Carli 2009,N Engl JMed.360(21):2248,Ducray 2009,N Engl J Med.360(21):2248,Hartmann 2009,ActaNeuropathol.118(4):469-74,Ichimura 2009,Neuro Oncol.11(4):341-7,Sanson 2009,JClin Oncol.27(25):4150-4)。
异柠檬酸脱氢酶通过把NADP+还原成NADPH，催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸。突变影响属于进化保守区域的氨基酸序列第132位氨基酸精氨酸，其位于异柠檬酸结合位点。报道的突变都是杂合型的，而且未检测到提示蛋白质失活的改变，例如剪切位点或无义突变，从而引发对突变激活性质的猜测。然而，酶活性的测定表明突变的灭活作用(Yan2009,N Engl J Med.360(8):765-73)。然而，IDH1在癌症的发生和/或发展中的作用仍然捉摸不定。
IDH1在世界卫生组织(WHO)分级II及III级弥散性胶质瘤中发生突变的频率高。93％的IDH1突变特点是氨基酸发生置换R132H(Hartmann 2009,Acta Neuropathol.118(4):469-74)。
上述类型癌症及伴有IDH1 R132H的其他类型癌症的有效治疗是高度期求的，因为这些癌症是最常见的侵略性癌症，且预后效果差。
上述癌症类型目前的诊断方法，特别是确定癌症是否伴有IDH1 R132H突变的诊断方法，主要是基于基因组DNA测序方法或免疫组化染色方法(参见，例如EP 2 256 214 A2)。但是，这两种技术都需要适当的癌组织样本，这种样本只能通过繁琐、有潜在危险的活检获得。因此，这些癌症类型的可靠、有效的诊断方法也是期求的。
本发明要解决的技术问题可认为是提供符合上述需求的治疗及诊断的手段与方法。技术问题通过权利要求书及以下所述的实施例得到解决。
因此，本发明涉及一种包含至少8个以连续氨基酸序列形式存在于I型人异柠檬酸脱氢酶(IDH1)中的氨基酸长度的肽，其中该肽的至少一个氨基酸在与132位点相对应的位点上由R置换为H，用于预防和/或治疗癌症。
文中所用的术语“肽”是指有机小分子，其中氨基酸是通过肽键共价偶联。与多肽(蛋白质)相比，肽仅由2至约100个氨基酸组成。由于分子量小，肽通常是生物可利用的分子，即它们能进入有机体的大多数组织中，甚至可进入细胞中。本发明中肽为包含至少8个氨基酸的长度。因此，肽的长度可基本由至少8个至约100个氨基酸组成，最好为从至少8个至约50个氨基酸、从至少8个至约40个氨基酸、从至少8个至约35个氨基酸、从至少8个至约30个氨基酸、从至少8个至25个氨基酸、从至少8个至约20个氨基酸、从至少8个至约15个氨基酸或从至少8个至约10个氨基酸组成。在本文中使用的术语“大约”是指氨基酸的数量，它与准确数字差+/-一个，即加或减一个氨基酸。最好目的为准确的数字。
文中所用的术语“I型异柠檬酸脱氢酶”或“IDH1”是指生理上参与催化异柠檬酸氧化脱羧从而生成α-酮戊二酸和CO2的柠檬酸循环的一种酶。反应需要把NAD+转化成NADH。本发明首选酶的另一种异型体利用NADP+而非NAD+作为辅助因子在细胞质以及线粒体或/和过氧化物酶体中催化相同的反应。此处提到的IDH1最好是人IDH1，其氨基酸序列由Kim等人披露(Kim 1995,Biochem J 308(Pt1):63-68)或通过NCBI/Genbank登录号CAG46496.1,GI:49456351；CAG38738.1,GI:49168486；CAG38553.1,GI:49065470；或AAH12846.1,GI:15277488获取。但是，该术语也包括具有所述特定氨基酸序列的上述人IDH1的变异体。这些变异体通常可以是直系同源体、旁系同源体或同系物。此处提到的变异体其氨基酸序列最好不同于上述特定氨基酸序列，有至少一个氨基酸取代、增加和/或缺失。该变异体氨基酸序列的整个长度最好有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％是与上述特定氨基酸序列相同。等同度最好能通过比较窗口比较两个最优对齐的序列来确定，其中与参考序列(不包含增加或缺失)相比，比较窗口的氨基酸序列片段的最优对齐可能包含增加或缺失(例如缺口或突出部分)。百分比的计算是通过确定两个序列出现相同氨基酸残基位点的数量得到匹配位点的数量，然后用比较窗口的总位点数量除以匹配位点数量，再把结果乘以100得到序列等同度的百分比。可以用局部地同源性算法(Smith and Waterman Add.APL.Math.2:482(1981))、同源性对齐算法(Needleman andWunsch J.Mol.Biol.48:443(1970))、相似性查找方法(Pearson and LipmanProc.Natl.Acad Sci.(USA).1988,85:2444(1988))，这些算法的计算机化实施(GAP,BESTFIT,BLAST,PASTA,and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI)或目测比较序列的最优对齐。鉴于这两个序列已经确定进行比较，最好使用GAP和BESTFIT确定它们的最优对齐，从而确定等同度。最好是，缺口权重和缺口权重长度的默认值分别为5.00和0.30。变异体最好有以上提到的、基本上与上述人IDH1免疫学性质相同的酶活性。
本发明的肽应包含至少一个氨基酸在与132位点相对应的位点上由R置换为H。肽最好可以包含至少8个氨基酸以连续氨基酸序列形式存在于人IDH1作为唯一的氨基酸置换，如本发明其他地方所述的一样，在人IDH1的132位点相对应的位点上由R置换为H。但是，肽可以包含进一步的置换，最好为一个或两个额外的置换或甚至更多置换。
本发明的肽最好有至少8个氨基酸是以连续氨基酸序列形式存在于人IDH1中。因此，本发明的肽基本上是由人IDH1来源的氨基酸序列组成或可能由包含人IDH1来源的一段8个或更多个氨基酸以及不存在于人IDH1的其他段氨基酸的氨基酸序列组成。
本发明肽的长度最好是由8个至40个氨基酸组成，肽的长度是由8个至35个氨基酸、8个至30个氨基酸、8个至25个氨基酸、8个至20个氨基酸、8个至15个氨基酸或8个至约10个氨基酸组成，它们是以连续氨基酸序列形式存在于人IDH1中。
通常肽准确的氨基酸数量以及人IDH1氨基酸序列来源的氨基酸数量可以由专业人员根据设想用途确定。在本发明背景下，技术人员清楚知道免疫反应可以通过改变肽的总长度或靶IDH1来源的一段连续氨基酸长度进行优化。
本发明的肽最好包括或基本上系由下列氨基酸序列组成的群组中选出的氨基酸序列组成：
a)由与氨基酸118至132相对应的氨基酸组成的一个氨基酸序列(序列编号：1)；
b)由与氨基酸120至134相对应的氨基酸组成的一个氨基酸序列(序列编号：2)；
c)由与氨基酸122至136相对应的氨基酸组成的一个氨基酸序列(序列编号：3)；
d)由与氨基酸124至138相对应的氨基酸组成的一个氨基酸序列(序列编号：4)；
e)由与氨基酸126至140相对应的氨基酸组成的一个氨基酸序列(序列编号：5)；
f)由与氨基酸128至142相对应的氨基酸组成的一个氨基酸序列(序列编号：6)；
g)由与氨基酸130至144相对应的氨基酸组成的一个氨基酸序列(序列编号：7)；
h)由与氨基酸132至146相对应的氨基酸组成的一个氨基酸序列(序列编号：8)；以及
i)由与氨基酸123至142相对应的氨基酸组成的一个氨基酸序列(序列编号：9)。
文中所用术语“癌症”是指有机体受损细胞非期望增长、侵入以及一定条件下的转移所导致的任何恶性肿瘤。细胞产生癌症是基因受损，通常丧失控制细胞分裂、细胞迁移行为、分化状态和/或细胞死亡机制的能力。大多数癌症形成肿瘤，但是一些血液相关癌症，如白血病则不会。最好,所述癌症的特点是至少一些癌细胞的基因组发生突变，导致具有R132H突变的IDH1突变体表达。癌症是否如之前规定的那样在至少一些癌症细胞中发生突变可以由本领域技术人员通过基于PCR和/或基于测序的检测技术确定。而且，在本发明其他地方提到的方法也适用。
最好所述癌症是肿瘤，其次是神经胶质瘤。据报道，神经胶质瘤通常是由细胞甚至含有上述IDH1突变的细胞组成。上述神经胶质瘤最好是WHO II级或WHO III级星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、少突星形细胞瘤、成胶质细胞瘤或神经胶质肉瘤。
此外，文中提到的癌症首选，也最好是，急性髓性白血病、骨髓增生异常综合症或胚胎发育不良性神经上皮性肿瘤。上述类型癌症的伴随症状为本领域所熟知，可由本领域技术人员立即确定。各类癌症的详细情况可参见标准医学教科书，如Pschyrembl或Stedman。
文中所用术语“预防”是指阻止文中所述疾病的发生。该预防最好是在使用本发明肽后的某一特定时间窗口达到。上述时间窗口最好是至少1年、2年、5年、10年或接受上述预防治疗受试者剩余的全部寿命。由此可见，文中提到的预防治疗不可能在所有接受治疗的受试者中都成功。但是，按照设想，预防治疗至少对接受治疗的具有统计学意义的一部分受试者有效。例如一组受试者中具有统计学意义的一部分人能否成功地进行预防最好是用在文中其他地方详细讨论的统计学检验方法确定。
文中所用术语“治疗”是指减轻和/或治愈文中所述疾病、阻止疾病发展或至少减轻所述疾病相关的一个症状。由此可见，文中提到的治疗不可能在所有接受治疗的受试者中都成功。但是，按照设想，治疗至少对接受治疗的具有统计学意义的一部分受试者有效。例如一群受试者中具有统计学意义的一部分人能否成功被治疗最好是用在文中其他地方详细讨论的统计学检验方法确定。
根据本发明的肽应提供用于治疗和/或预防癌症，即它应作为一种药剂生产，例如，包含在药物组合物中。该药剂或药物组合物的详情见文中别处。根据本发明使用的肽也能在治疗和/或预防癌症的方法中使用。此外，本发明还考虑受试者治疗和/或预防癌症的方法，包括给所述受试者使用文中定义的治疗有效剂量的肽。
有利的是，本发明中的研究发现，本发明的肽可用于诱发针对IDH1 R132H突变体的特异性免疫反应。相应地，表达突变IDH1的癌症细胞将受到免疫系统细胞和体液反应的攻击，形成一种专门治疗和/或预防文中所述已知与上述IDH1突变相关各类癌症的有效方法。感谢本发明的研究结果，提供了用于各类癌症的有效药剂以及癌症疫苗。
以上所做的解释和评论在以下所述的本发明实施例中作了必要的修改。
本发明涉及包含本发明的肽以及最好是药物学上可接受载体的药剂。
文中所用术语“药剂”，一方面是指含有作为药物有效化合物的上述肽的药物组合物，其中药物组合物可用治疗有效剂量治疗人类或非人类的各种疾病或失调。肽最好是以液体或冻干形式存在。药剂最好是局部或全身给药。药剂通常是肌内或皮下注射。但是，根据化合物的性质和作用方式，药剂也可以通过其他途径给药。肽是组合物的活性成分，最好是按照传统方法把药物与标准药物载体混合制备传统剂型来给药。这些方法可能包括混合、粒化及压缩，或根据情况溶解成分形成期望的制剂。最为合适的是药物学上可接受的载体或稀释剂的形态和性质由其结合的活性成分的数量、给药途径及其他已知变量决定的。
就与制剂其他成分相容、对其受体无害的意义而言，载体必须是可接受的。使用的药物载体可以是固体、胶体或液体。固体载体的示例有乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯树胶、硬脂酸镁、硬脂酸等等。液体载体的示例有磷酸盐缓冲液、糖浆、油、水、乳剂、各种类型的润湿剂等等。同理，载体或稀释剂可以是本领域所熟知的时间延迟材料，如单独或与蜡联合使用的单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯。所述适当载体包含上述载体以及为本领域所熟知的其他载体，参见，例如Remington′s Pharmaceutical SciencesMack Publishing Company,Easton,Pennsylvania.
选择稀释剂以便不影响组合物的生物活性。该稀释剂的示例有蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液及汉克溶液。此外，药物组合物或制剂也可能包含其他载体、佐剂或无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂等等。
治疗有效剂量是指本发明药剂中所使用肽的量，它能预防、减轻或治疗本说明书提及的疾病或身体状况伴有的症状。化合物的疗效和毒性可以通过标准药物学方法在细胞培养物或实验动物中确定，例如ED50(半数有效量)和LD50(半数致死量)。疗效与毒性作用之间的剂量比是治疗指数，可以用LD50/ED50比率表示。给药方案将由主治医生和其他临床因素确定。在医学领域众所周知的是，任何一位患者的用药剂量取决于许多因素，包括患者体重、体表面积、年龄、服用的特定化合物、性别、给药时间和途径、健康状况以及同时服用的其他药物。定期评估可以监测进展。文中提及的药剂至少给药一次，以便治疗、减轻或预防本说明书中列举的疾病或身体状况。然而，上述药剂可以多次给药。特定药剂是以制药领域所熟知的方式制备，并在混合物中包含上述至少一种有效化合物或以其他方式与药物学上可接受载体或稀释剂关联。为制备这些特定的药物组合物，有效化合物通常与载体或稀释剂混合。产生的制剂适合给药方式。应在处方或使用说明书中注明推荐剂量，以便根据适用人群预期调整剂量。
根据本发明的药剂也可能包含除本发明拮抗剂外的药物，这些药物在制备药剂时加入。
最终需要了解的是，药剂的制备是在GMP标准化条件或类似条件下进行，以便保证药剂的质量、制药安全和有效性。
本发明还涉及一种诊断具有下列特点癌症的方法，至少有一些癌细胞的基因组发生突变，导致具有R132H突变的IDH1突变体的表达，该方法包括以下步骤：
a)使包含至少10个氨基酸长度的作为IDH1中连续氨基酸序列存在的的肽与怀疑患有该癌症的受试者的血液样本在使得免疫系统成分特异性结合到肽的条件下接触一段时间，其中上述肽的至少一个氨基酸在与132位点相对应的位点上由R置换为H；并且
b)确定上述免疫系统成分是否结合到肽上，其中，如果确定发生了结合，则诊断患有癌症。
本发明的方法是在受试者的游离样本上进行，即是一种体外方法。此外，该方法可以实现完全或至少部分自动化。例如，步骤a)和b)可以用文中别处指定的设备进行。另外，诊断的实际步骤可以用适合的计算机程序制定，该程序是基于结合发生，用合适的输出格式表明癌症的诊断。
文中所用术语“诊断”是指评估受试者是否患有癌症。本领域专业人员应了解，该评估通常不是对所有待确定受试者都适用。但是，术语要求能确定具有统计学意义的一部分受试者(例如组列研究的一群)。本领域专业人员利用各种熟知的统计评估工具，如置信区间的确定、p-值确定、Student氏t检验、曼-惠特尼检验等，可以立即确定一部分是否具有统计学意义。详细情况参见Dowdy and Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York 1983。首选的置信区间是至少90％、95％、97％、98％或99％。p-值最好是0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。最好是至少60％、70％、80％或90％的受试者能用本发明的方法正确识别。本发明的诊断包括方法在相关癌症监测、确诊和细分类中的应用。
此外，诊断还包括为受试者确定预后。根据本发明方法诊断患有癌症的受试者应当有表达IDH1 R132H多肽的癌细胞。上述IDH1突变体的存在是受试者可能有不良结局的预测指标。因此，本发明的方法也可用于危险分层方法，从而确定单个癌症受试者所需要的重症监护和住院治疗量。
文中所用术语“血液样本”是指全血或其中任何一部分的样本。全血的一部分可以是包含细胞，如白细胞的部分或基本上没有细胞，如血浆或血清的部分。
文中所用术语“免疫系统成分”是指免疫系统的细胞和非细胞成分。
本发明中的非细胞成分包括那些能够特异性结合到抗原肽上的成分。因此，上述免疫系统成分最好是包含在血液样本中的抗体。在此背景下提到的抗体最好是受试者血液中的抗体并特异性结合到本发明方法提及的IDH1肽上。受试者血液中可能存在的抗体最好是IgG或IgM同种型抗体。
如果免疫系统的非细胞成分是根据本发明的方法确定，方法中使用的所述肽其长度最好是由10到20个以连续氨基酸序列形式存在于人IDH1的氨基酸组成，并包括系由下列氨基酸序列组成的群组中选出的氨基酸序列：
a)由与氨基酸118至132相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：1)；
b)由与氨基酸120至134相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：2)；
c)由与氨基酸122至136相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：3)；
d)由与氨基酸124至138相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：4)；
e)由与氨基酸126至140相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：5)；
f)由与氨基酸128至142相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：6)；
g)由与氨基酸130至144相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：7)；以及
h)由与氨基酸132至146相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：8)。
根据本发明，作为免疫系统成分的细胞成分是能够特异性结合到肽抗原上的免疫系统细胞。能够特异性结合到肽抗原上的免疫系统细胞最好是T淋巴细胞、B淋巴细胞或树突细胞。免疫系统成分最好是淋巴细胞，首选是血液样本包含的CD4-阳性T淋巴细胞、CD8-阳性T淋巴细胞或B淋巴细胞。
如果免疫系统的细胞成分是根据本发明的方法确定，方法中使用的上述肽其长度最好是由10到20个以连续氨基酸序列形式存在于人IDH1的氨基酸组成，并包括系由下列氨基酸序列组成的群组中选出的氨基酸序列：
a)由与氨基酸118至132相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：1)；
b)由与氨基酸120至134相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：2)；
c)由与氨基酸122至136相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：3)；
d)由与氨基酸124至138相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：4)；
e)由与氨基酸126至140相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：5)；
f)由与氨基酸128至142相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：6)；
g)由与氨基酸130至144相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：7)；
h)由与氨基酸132至146相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：8)；
i)由与氨基酸123至132相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：10)；
j)由与氨基酸124至133相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：11)；
k)由与氨基酸125至134相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：12)；
l)由与氨基酸126至135相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：13)；
m)由与氨基酸127至136相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：14)；
n)由与氨基酸128至137相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：15)
o)由与氨基酸129至138相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：16)；
p)由与氨基酸130至139相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：17)；
q)由与氨基酸131至140相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：18)；以及
r)由与氨基酸132至141相对应的氨基酸组成的氨基酸序列(序列编号：19)。
文中所用术语“受试者”是指动物，最好是哺乳动物，首选是人类。本发明的方法最好用于根据临床明显症状、怀疑患有上述任意类型癌症的受试者或由于潜在诱因增加，怀疑患有上述癌症的受试者。
包含至少10个以连续氨基酸序列形式存在于IDH1中的氨基酸长度的适当肽，其中上述肽的至少一个氨基酸在与132位点相对应的位点上由R置换为H，在文中别处做了说明。特别是首选肽在前面做了详细说明。
文中提及的接触样本是指让肽和样本进行直接接触，从而允许样本中含有的免疫系统成分特异性结合或不结合到肽上。应当了解文中的接触是指在允许成分特异性结合到肽上的充分条件下，进行一段时间接触。取决于样本的性质，可能需要预处理步骤，以便让成分接触并能特异性结合到肽上。此外，取决于样本种类的不同，处理可能会不同。例如，如果免疫系统成分是文中别处规定的非细胞成分，那么血清或血浆可以首先从全血样本中获得。如果成分是细胞成分，可能需要适当的细胞聚集和/或分离。与血液样本接触的肽最好是固定在固体支持物上。固定化最好允许进行清洗步骤去除接触后的血液样本，从而提高检测的敏感度和/或特异性并去除背景噪声。此外，可以用自动化方式，最好是在文中别处规定的本发明设备的分析装置中进行接触步骤。然而，存在于血液样本中的免疫系统成分也最好是用例如含肽的溶液进行固定化和接触。
应当理解的是，一旦接触后，需要确定上述免疫系统成分是否结合到肽上。可以用合适的检测方法确定成分结合到文中所用的肽上，能够检测是否形成成分和肽的复合物或成分由于与肽结合，例如在清洗后，以固定化形式存在于固体支持物上。在第一种情况下，可以使用检测免疫系统成分和肽复合物的试剂。在第二种情况下，可以使用检测免疫系统成分的任何试剂。如果免疫系统成分首先进行固定，然后与肽接触，那么可以使用能够检测成分和肽复合物是否形成的检测方法或者肽本身可能与可检测的标签结合。
可用于本发明方法以检测成分和肽复合物或成分的检测试剂包括能够特异性结合的抗体、核酸适体或任何其他分子。检测试剂最好是与可检测标记如放射性同位素(例如碘锝的放射性同位素)、荧光剂或化学发光剂(例如FITC、罗丹明)、酶结合，通过转化底物(例如辣根过氧化物酶、萤火虫荧光素酶或β半乳糖苷酶)、荧光蛋白(例如绿、蓝或红色荧光蛋白)，它能产生可检测的信号。合适的可检测标记为本领域所熟知。此外，检测试剂可能是复合试剂，其中第一个试剂是特异性结合到成分上或复合物能够吸引一个或更多个试剂结合到可检测标签上。这种试剂可以是生物素。在这种情况下，可以使用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白偶联试剂，一旦与结合的生物素结合，成分或复合物将作为可检测标记。适合这种情况的可检测标记是上述那些标记，在这种情况下最好是用酶作为可检测标记。此外，检测抗体可用于检测复合物或成分。这种检测抗体应当与上述可检测标记结合。因此，在后一种情况下，检测抗体一旦与成分或复合物结合就会产生可检测信号。用抗体检测的原理为本领域所熟知并经常使用。上述检测试剂可参照规定使用以检测用于特异性结合到固定化免疫系统成分的肽。
取决于可检测标记的类型，利用阅读器系统可以使用不同的方法检测可检测标记所产生的信号。上述系统包括自动信号阅读设备，如ELISA或RIA阅读器，用于手动或自动检测可检测信号。而且，阅读器系统可以确定样本的其他信息，例如自动信号阅读器也能确定样本所包含的更多生物标记。
如果已确定肽与免疫系统成分特异性结合，则确定诊断，或至少能通过本发明方法获悉诊断的辅助性技术。
有利的是，本发明中的研究表明，如果IDH1 R132H突变体存在于癌细胞中，它有助于引发免疫反应，导致体液免疫反应和细胞免疫反应产生。因此，特异性针对IDH1 R132H突变体的抗体以及免疫系统细胞成分，特别是含有上述突变的肽表位，在IDH1 R132H阳性癌症如神经胶质瘤患者的血液中被发现。基于这些研究结果，本发明的方法能对某些类型的恶性癌症如神经胶质瘤，最好是WHO II或WHO III级星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、少突星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质肉瘤或急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征或胚胎发育不良性神经上皮肿瘤进行基于血液的诊断。而且，本发明的方法能把癌症分为IDH1R132H-阳性癌症，从而作为癌症的特定恶性阶段或分类，具有不良预后。因为方法是使用血液作为样本材料，可以避免上述如神经胶质瘤目前诊断所用的难处理且昂贵的活组织检查。方法也能纳入临床常规筛选方法中。
在本发明方法的一个首选实施例中，上述方法还包括根据步骤b)得到的诊断推荐抗癌治疗的步骤。
文中所用术语“建议”是指为受试者推荐一种抗癌治疗或排除(即不推荐)某一种抗癌治疗。应视情况提供建议和其他信息，例如组织病理学研究信息，是作为临床医生是否对单个受试者进行一定抗癌治疗的依据。根据本发明方法步骤b)确定的诊断，即“癌症”或“非癌症”的诊断，建议抗癌治疗。应当理解只有在用本发明方法确定“癌症”诊断的情况下，才能建议抗癌治疗。在基于本发明方法诊断确定的“非癌症”的情况下，建议不进行抗癌治疗。如上所述，样本提供者提供的更详细信息也可用于改进建议。一方面，如果本发明的方法识别癌细胞，但是如果未被本发明方法识别的更多癌细胞通过例如组织病理学分析在研究癌症中检测到，建议进行联合抗癌治疗，例如使用不同的抗肿瘤药物。
文中所用术语“抗癌治疗”包括手术治疗、放射治疗、药物治疗或联合治疗。上述药物抗癌治疗最好是替莫唑胺或亚硝基脲治疗。
本发明还涉及一种诊断具有下列特点癌症的设备：至少一些癌细胞的基因组发生突变，导致具有R132H突变的IDH1突变体表达，上述设备包括：
a)一个肽的分析装置，肽包含至少8个以连续氨基酸序列形式存在于IDH1中的氨基酸长度，其中上述肽的至少一个氨基酸在与132位点相对应的位点上由R置换为H，用于检测受试者样本中的免疫系统成分。
b)一个能够检测免疫系统成分特异性结合到上述肽的检测器的评估装置，其中上述检测器产生输出信号，表明是否发生特异性结合。
文中所用术语“设备”是指至少包括实时连接的上述分析装置和评估装置的系统。如何以操作的方式连接设备的装置取决于设备中含有的装置类型。例如，无论在何处使用样品自动分析装置，上述自动操作分析装置获得的数据都能用如计算机程序进行处理以便通过评估装置获得预期结果。在这种情况下，装置最好是由单一设备组成。分析装置可能包含用固体支持物固定化的肽。这种分析装置对液体样本特别有用。用本发明的设备研究的样本最好是文中别处规定的血液样本。肽最好以固定化形式包含在分析装置的检测区域，这样溶液如血液样本就可以使用。此外，分析装置可能带有用于清洗的内部或外部的小瓶或在样本接触肽后，可能需要用于检测区域的检测溶液，以便正确的检测固定化肽上的免疫系统成分。分析装置也应当带有测量检测区域的免疫系统成分是否结合到固定化肽上的检测器。技术人员根据用于测量免疫系统成分结合到固定化肽上的检测反应的种类，选择合适的检测器。评估装置最好是计算机或数据处理设备，它有执行规则，即算法，用于评估分析装置确定的结合，由此，根据信号的类型和强度，把结合评估成有意义或无意义的结合。例如，评估显示为无意义结合，诊断将被确定为“无癌症”，最好是用合适的输出格式注明。如果评估结果得到是有意义结合，诊断应被确定为癌症，最好是用合适的输出格式注明。
最后，本发明涉及一种用于诊断具有下列特点癌症的试剂盒：至少一些癌细胞的基因组发生突变，导致具有R132H突变的IDH1突变体表达，上述试剂盒包括使用所述方法的说明书和至少10个氨基酸长度的肽以连续氨基酸序列形式存在于IDH1，其中上述肽的至少一个氨基酸在与132位点相对应的位点上由R置换为H。
文中所用术语“试剂盒”是指提供随时可用于诊断样本癌症的一批上述抗体和说明书。肽和说明书最好是放在单个容器中。试剂盒最好还包括进行诊断所必需的其他成分。这些成分可能是检测肽结合所必需的助剂、预处理待分析样本的试剂或校准样品。
本说明书引用的所有参考文献其全部披露内容以及在本说明书中特别提到的披露内容都通过引用的方式并入本文中。
图表
图1：IDH1R132H突变神经胶质瘤患者中对IDH1R132H的自然MHC-II类限制性免疫反应用野生型(wt)或突变IDH1肽刺激的外周血的酶联免疫斑点检测(左)。肽混合物及植物凝集素(PHA)作为对照。流式细胞仪(右)对IDH1R132H肽刺激后扩增的T细胞的CD4和CD8细胞表面表达进行了分析。
图2：MHC-II类人源化小鼠中的MHC-II类限制性免疫原性IDH1R132H表位。缺乏小鼠MHC I和II-类但是导入人A2和DR1基因的转基因小鼠在用IDH1R132H表位123-142(面板1)、124-138(面板2)、122-136(面板3)免疫或假免疫(面板4)并在体外用指定IDH1R132H肽序列再刺激的外周免疫反应。野生型IDH1肽123-142、DMSO和MHC-II类限制性免疫原性髓鞘肽(MOG)作为对照。
图3：MHC–II类人源化小鼠中的IDH1R132H特异性抗体反应。缺乏小鼠MHC I和II-类但是导入人A2和DR1基因的转基因小鼠在用IDH1R132H表位123-142(深蓝色)、124-138(绿色)、122-136(淡蓝色)免疫或假免疫(红色)后与指定的IDH1R132H肽序列结合，在其血清中的IDH1R132H特异性IgG抗体反应。野生型IDH1肽122-136及126-140、DMSO和MHC-II类限制性免疫原性髓鞘肽(MOG)作为对照。
图4：在IDH1R132H突变神经胶质瘤患者中的自然IDH1R132H特异性抗体反应。在IDH1突变神经胶质瘤患者、IDH1野生型神经胶质瘤(wt)患者、未知IDH1状态神经胶质瘤患者或健康对照者血清中的对于IDH1R132H 126-140肽的自然IDH1R132H特异性IgG抗体反应。如果有的话，注明MHC-II单体型和肿瘤型的信息。
图5：IDH1R132H突变神经胶质瘤患者自然IDH1R132H特异性抗体反应的表位特异性。IDH1突变神经胶质瘤5IDH1R132H患者(用颜色标注)血清中指定野生型(wt)或IDH1R132H(RH)肽的自然IDH1R132H特异性IgG抗体反应。
图6：IDH1R132H肽接种诱导Th1和CTL反应。
A2.DR1小鼠用100μg IDH1R132H123-142肽Montanide ISA51、300ng GM-CSF和50μlAldara Cream(5％咪喹莫特)进行免疫并在14天后进行不含GM-CSF的加强免疫。对照小鼠以同样的方式处理，没有用肽。在追加的14天后，切除脾脏和淋巴结进行分析。A)淋巴结细胞是用10μg/ml IDH1R132H、IDH1野生型肽、阴性对照肽(MOG)、仅载体或200μg/ml IFNg处理的IDH1野生型的蛋白裂解物或IDH1R132H过量表达38小时的GL261细胞进行刺激。用ELISpot测定IFNγ产量。左，IDH1R132H接种；右，载体对照接种。B)系统性IFNγT细胞反应证实存在于脾细胞中，脾细胞如(A)那样进行刺激并用20ng/ml PMA和1μg/ml离子霉素作为阳性对照72个小时。收集上清液，IFNγ一式三份在抗IFNγ-包被ELISA上利用生物素化抗IFNγ、抗生蛋白链菌素-HRP和TMB的标准曲线比色量化。C)利用细胞因子流式细胞仪分析IFNγ-生成脾细胞。脾细胞在体外用IDH1R132H123-142或载体对照进行刺激，用20ng/ml PMA和1μg/ml离子霉素再次刺激5小时，包括高尔基体转运抑制剂5μg/ml布雷菲德菌素A用于抑制分泌。对表面标记CD3、CD4和CD8染色，关于胞内染色，要增加细胞的通透性并进行固定，对IFNγ染色。细胞在流式细胞仪中进行分析。上面板，IDH1R132H接种小鼠；下面板，载体对照接种小鼠。显示了一只小鼠的具有代表性的结果。
图7：IDH1R132H肽接种不诱导Th2和Th17细胞因子。
A2.DR1小鼠用100μg IDH1R132H123-142肽溶于Montanide ISA51、300ng GM-CSF和50μl Aldara Cream(5％咪喹莫特)进行免疫并在14天后进行不含GM-CSF的加强免疫。对照小鼠以同样的方式处理，没有用肽。在追加的14天后，切除脾脏和淋巴结进行分析。A)脾细胞是用10μg/ml IDH1R132H、IDH1野生型肽、阴性对照肽(MOG)、仅载体进行刺激，或用20ng/ml PMA和1μg/ml离子霉素作为阳性对照72个小时。收集上清液，细胞因子一式三份在抗细胞因子-包被ELISA上利用生物素化抗细胞因子抗体γ、抗生蛋白链菌素-HRP和TMB的标准曲线比色量化。B)利用细胞因子流式细胞仪分析IFNγ-生成脾细胞。脾细胞在体外用IDH1R132H123-142或载体对照进行刺激，用20ng/ml PMA和1μg/ml离子霉素再次刺激5小时，包括高尔基体转运抑制剂5μg/ml布雷菲德菌素A用于抑制分泌。对表面标记CD3、CD4和CD25染色，关于胞内染色，要增加细胞的通透性并进行固定，对IL4、IL17和FoxP3染色。细胞在流式细胞仪中进行分析。上面板，IDH1R132H接种小鼠；下面板，载体对照接种小鼠。左，Th2和Th17；右，Treg。显示了一只小鼠的具有代表性的结果。
图8：IDH1R132H肽接种诱导IgG生成。
A2.DR1小鼠用100μg IDH1R132H123-142肽Montanide ISA51、300ng GM-CSF和50μlAldara Cream(5％咪喹莫特)进行免疫并在14天后进行不含GM-CSF的加强免疫。对照小鼠以同样的方式处理，没有用肽。在追加的14天后，抽取下颌下腺静脉血获得血清。在IDH1R132H或IDH1野生型肽包被ELISA上利用HRP偶联抗IgG抗体和TMB检测IDH1R132H接种和载体对照接种小鼠血清中的IDH1结合总IgG(A)和IgG亚型(B)。
图9：CD4T细胞系具有MHC–II类DR依赖性和突变特异性。
A2.DR1小鼠用100μg IDH1R132H123-142肽溶于Montanide ISA51、300ng GM-CSF和50μl Aldara Cream(5％咪喹莫特)进行免疫并在14天后进行不含GM-CSF的加强免疫。对照小鼠以同样的方式处理，没有用肽。在追加的14天后，切除脾脏并用10μg/mlIDH1R132H123-142进行刺激。为生成CD4+IDH1R132H123-142特异性T细胞系，利用载有2μg/mlIDH1R132H123-142和ConA的等基因照射脾细胞每4周对细胞重复刺激，并在3次重复刺激后进行分析。A)利用2μg/ml LPS和7μg/ml105硫酸葡聚糖，同基因脾细胞经过3天以上时间生成B细胞胚细胞，其载有0.1或1.0μg/ml(A)IDH1R132H123-142、IDH1wt123-142阴性对照肽(MOG)或载体并用于刺激CD4+T细胞系的250个细胞。B)载有0.1μg/ml(A)IDH1R132H123-142的B细胞胚细胞进行的刺激被0.2μg/ml HLA-A或HLA-DR封闭抗体抑制。用ELISpot在38小时后测定IFNγ产量。***p<0,005。C)IDH1R132H123-142-特异性T细胞表达CD4通过对表面标记CD3、CD4和CD8染色以及流式细胞仪得到证实。D)用20ng/ml PMA和1μg/ml离子霉素刺激IDH1R132H123-142特异性T细胞5小时，包括高尔基体转运抑制剂5μg/ml布雷菲德菌素A用于抑制分泌。对表面标记CD3、CD4和CD25染色，关于胞内染色，要增加细胞的通透性并进行固定，对IFNγ、IL4、IL17和FoxP3染色。细胞在流式细胞仪中进行分析。E)IDH1R132H123-142特异性T细胞是用同基因DC(T细胞：DC 1:5)进行刺激，这种T细胞是利用20ng/ml GM-CSF连续5天刺激骨髓生成的，载有4μg/ml IDH1R132H123-142。关于胞内细胞因子染色，细胞是用5μg/ml布雷菲德菌素A处理抑制分泌，并像(D)中的流式细胞仪那样进行染色。
图10：CD4T细胞克隆具有MHC–II类DR依赖性和突变特异性。
单个细胞克隆是由CD4+IDH1R132H123-142特异性T细胞系生成并每4周用载有2μg/ml IDH1R132H123-142和ConA的同基因照射脾细胞进行重复刺激。A)利用2μg/ml LPS和7μg/ml105硫酸葡聚糖，同基因脾细胞经过3天以上时间生成105B细胞胚细胞，其载有0.1或1.0μg/ml(A)IDH1R132H123-142、IDH1wt123-142阴性对照肽(MOG)或载体并用于刺激CD4+T细胞克隆的2500个细胞。B)载有0.1μg/ml(A)IDH1R132H123-142的B细胞胚细胞进行的刺激被0.2μg/mlHLA-A或HLA-DR封闭抗体抑制。用ELISpot在38小时后测定IFNγ产量。**p<0,01；***p<0,005。
图11：GBM患者的IDH1R132H特异性IFNγ反应是Th1介导的。
A)107PBMC是从IDH1R132H+GBM患者的外周血中分离，并用40μg/mlIDH1R132H123-142、阴性对照肽MOG或作为阳性对照的1μg/ml葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激6小时，IFNγ-生成细胞通过捕捉法分离。细胞用抗IFNγ抗体标记作为捕捉剂用于捕捉在45min分泌期间细胞表面分泌的IFNγ。细胞用PE偶联IFNγ特异性抗体和抗PE微球标记，并通过磁力分选。IFNγ生成是利用流式细胞仪表面标记CD3、CD4和CD8染色。IFNγ阴性细胞(APC)用作对照。B)使用20μg/ml IDH1R132H123-142、IDH1wt123-142或阴性对照肽(MOG)刺激同一患者的5*105PBMC 38小时，并利用ELISpot测定IFNγ产量。**p<0,01。C)对同一患者(左)和间变性神经胶质瘤(A°III))患者肿瘤组织的CD3+肿瘤浸润T细胞染色。
图12：IDH1R132H+神经胶质瘤患者的体液和细胞IDH1R132H反应
A)在IDH1R132H122-136肽ELISA上检测IDH1R132H+和IDH1野生型神经胶质瘤患者血清中的IDH1R132H-特异性IgG。板上的每个孔用10μg IDH1R132H122-136肽包被并用3％FBS阻断，孵育血清使IgG结合到肽上。用HRP偶联抗人IgG抗体和TMB通过比色法检测IgG。至于阴性对照，MOG肽被包被。显示了相对于MOG肽的值。来自50位患者的数据，其中有15位IDH1R132H患者，23位IDH1野生型患者，12位未知IDH1状态的患者。B)5*105PBMC是从IDH1R132H+神经胶质瘤患者的外周血中分离，用20μg/ml IDH1wt123-142或IDH1R132H123-142刺激38小时并用HLA-DR阻断抗体处理。用ELISpot测定IFNγ产量。**p<0,01。
图13：建立IDH1R132H IFNγ捕捉法染色和路径选择策略
A)107PBMC是从IDH1R132H+神经胶质瘤患者的外周血中分离，并用40μg/mlIDH1R132H123-142、阴性对照肽MOG或作为阳性对照的1μg/ml葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激6小时，IFNγ-生成细胞通过捕捉法分离。细胞用抗IFNγ抗体标记作为捕捉剂用于捕捉在45min分泌期间细胞表面分泌的IFNγ。细胞用PE偶联IFNγ特异性抗体和抗PE微球标记，并通过磁力分选。IFNγ生成和IFNγ阴性细胞(APC)是利用表面标记CD3、CD4和CD8染色。死细胞是用流式细胞仪的PI标记。
图14：神经胶质瘤患者缺少IDH1R132H特异性IFNγ反应T细胞
107PBMC是从IDH1R132H+神经胶质瘤患者的外周血中分离，并用40μg/mlIDH1R132H123-142、阴性对照肽MOG或作为阳性对照的1μg/ml葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激6小时，IFNγ-生成细胞通过捕捉法分离。细胞用抗IFNγ抗体标记作为捕捉剂用于捕捉在45min分泌期间细胞表面分泌的IFNγ。细胞用PE偶联IFNγ特异性抗体和抗PE微球标记，并通过磁力分选。IFNγ生成和IFNγ阴性细胞(APC)是利用表面标记CD3、CD4和CD8染色。死细胞是用流式细胞仪的PI标记。A)患者010275，B)患者270284，C)患者080572。
图15：神经胶质瘤患者存在IDH1R132H特异性IFNγ反应T细胞
107PBMC是从IDH1R132H+神经胶质瘤患者的外周血中分离，并用40μg/mlIDH1R132H123-142、阴性对照肽MOG或作为阳性对照的1μg/ml葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激6小时，IFNγ-生成细胞通过捕捉法分离。细胞用抗IFNγ抗体标记作为捕捉剂用于捕捉在45min分泌期间细胞表面分泌的IFNγ。细胞用PE偶联IFNγ特异性抗体和抗PE微球标记，并通过磁力分选。IFNγ生成和IFNγ阴性细胞(APC)是利用表面标记CD3、CD4和CD8染色。死细胞是用流式细胞仪的PI标记。A)患者170185，B)患者150161。示例
以下示例应当仅仅说明发明。无论如何，不得解释为对发明范围的限制。
示例1：MHC-II限制性抗IDH1R132H CD4+T细胞反应的鉴定和IDH1R132H接种MHC-II人源化小鼠的抗体生成
缺少小鼠MHC I和II类，但是转入人A2和DR1基因以模拟人I和II类背景下的抗原展示的转基因小鼠，其对于IDH1R132H的外周免疫反应被检测。这些实验(图2)表明用IDH1R132H肽123-142、124-138和122-136免疫后，再用突变特异性肽在体外重复刺激，(a)突变123-142和122-136肽而非124-138是免疫原性的。在分析接种过的人源化小鼠的抗体反应时，扼要重述了123-142的特异性免疫原性。这些实验表明，免疫后生成IDH1突变特异性抗体(图3)。
示例2：IDH1R132H突变神经胶质瘤患者IDH1R132H 123-142的免疫原性
也显示了IDH1R132H突变神经胶质细胞瘤患者的IDH1R132H 123-142免疫原性，其中检测到自然CD4T细胞反应(图1)，自然IDHR132H特异性抗体在IDH1R132H突变神经胶质瘤患者中很明显，但是在IDH1野生型神经胶质瘤健康对照者中不明显(图4)。这些抗体在很大程度上似乎具有相同的表位特异性，偏爱122-136和126-140(图5)。

Claims (3)

1.一种肽在制备用于诊断癌症的药剂或试剂盒中的用途，其中所述肽由选自SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9的氨基酸序列构成，所述癌症的特点在于至少一些癌细胞的基因组发生突变，引起具有R132H突变的IDH1突变体的表达。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述癌症是神经胶质瘤、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合症或胚胎发育不良性神经上皮肿瘤。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症通过以下步骤诊断：
a)用所述肽在使得免疫系统成分特异性结合到所述肽的条件下与怀疑患有所述癌症的受试者的血液样本接触一段时间；并且
b)确定所述免疫系统成分是否结合到所述肽上，其中如果确定发生了结合，则诊断该受试者患有所述癌症。
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