CN105132458B - HNP-1-Fc重组蛋白的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HNP‑1‑Fc重组蛋白的制备方法及应用，包括：构建HNP‑1‑Fc重组蛋白真核细胞表达载体、磷酸钙转染程序以及富集和纯化HNP‑1‑Fc重组蛋白。本发明构建的重组CHO‑K1细胞生产效率高、产物浓度高且易于纯化，本制备方法费用低廉，具有极高地推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及HNP蛋白，具体涉及一种HNP-1-Fc重组蛋白的制备方法及应用。
背景技术
感染性疾病，包括细菌，病毒和真菌感染，是世界各国临床病人死亡的主要原因之一。特别是在包括中国在内的发展中国家中尤为严重，是全球公共健康最严重的威胁之一。另一方面，尽管作为抗感染的主要工具的抗生素已广泛应用，但细菌感染的发病率和死亡率仍然居高不下。抗生素在临床实践和其他领域如农业和粮食生产中的滥用更导致大量多重耐药微生物的出现。据报道，在美国70％的感染至少对一种抗生素药物有抗药性。感染及传染性疾病不仅是一个严重的医疗问题，同时也造成了沉重巨大的经济负担，进而对全球的政治，经济和社会产生了巨大的影响。显然，探索新的具有不同杀菌机制的抗菌药物来治疗感染性疾病有着巨大而迫切的需求。近年来，人类的天然抗菌肽(AMPS)作为一类新型抗生素，备受关注。
防御素是富含半胱氨酸的小阳离子蛋白和人类的主要天然抗菌肽(AMPS)之一。作为宿主防御肽，它们的功能在人类先天免疫中发挥了关键作用。α-防御素是人类防御素的一种主要类型，人类嗜中性粒细胞肽(Human neutrophil peptides 1，HNP-1)是α-防御素主要组成成分。HNP-1是人类最丰富而重要的防御肽储备，主要表达在人类中性粒细胞中，占细胞中总蛋白的5％，嗜天青颗粒细胞内总蛋白50％以上。α-防御素具有广谱的杀灭革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌和许多有包膜病毒和非包膜病毒效果。与其他类抗生素相比，α-防御素代表了一类新的抗生素。α-防御素的优势是采取了完全不同的杀菌机制，直接攻击微生物胞壁，并导致微生物死亡。因此，对于这类抗生素，目标微生物不太可能产生耐药性。α-防御素水平在健康受试者体内是相当低的。已知局部和循环水平α-防御素的显著增加与肺中性粒细胞的数目升高及病原体局部浸入有关联。常常出现在感染和炎症性疾病中，如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，败血症，肺炎，肺结核，肺移植和慢性阻塞性肺疾病(COPD)等，表明α-防御素在炎症性疾病的发病机理中起着重要作用。有新的证据表明α-防御素可作为新的生物标志物用于感染和炎症性疾病诊断和预后判断。
目前HNP主要靠天然纯化，化学合成或者细菌表达获取。天然纯化因其来源有限，无法商品化大量应用。化学合成则价格昂贵且生物活性很低。细菌表达的重组蛋白，虽然具有天然多肽的氨基酸序列，但由于缺乏适当的哺乳细胞内表达翻译后的蛋白折叠与修饰，所以其活性均不及天然蛋白，而且生产成本高，产量低，易污染。
在过去几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO-K1细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题：
①构建的重组CHO-K1细胞生产效率低，产物浓度亦低；
②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化；
③重组CHO-K1细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高效表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少；
④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有抗菌活性的HNP-1-Fc重组蛋白结构构成。
本发明还有一个目的是提供一种具有高产出率的HNP-1-Fc重组蛋白的制备方法。
本发明构建的哺乳动物细胞表达载体中含有全长HNP-1cDNA和部分人类IgG2-FccDNA片段，所表达的为重组的HNP-1-Fc蛋白。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种HNP-1-Fc重组蛋白的制备方法，所述方法包括以下步骤：
S1、从人的单克隆抗体细胞中提取携带hlgG2-Fc蛋白翻译信息的mRNA，以所述mRNA为模板合成cDNA；
S2、合成携带hGHRH蛋白翻译信息的cDNA片段，并与步骤S1合成的cDNA连接，形成hGHRH/hIgG2-Fc基因克隆片段；
S3、合成包含Flag的HNP-1的cDNA片段：Flag/HNP-1，与步骤S2合成的基因克隆片段连接，形成hGHRH/hIgG2-Fc/Flag/HNP-1基因克隆片段，将其定向克隆至真核细胞重组载体pMPGCR5B上，构建表达载体；
S4、将所述表达载体转化至大肠杆菌中，用含有氨苄青霉素培养基筛选出阳性转化菌落，扩增阳性转化菌落并提取表达载体，并对表达载体进行酶切和测序鉴定，对测序后的表达载体进行纯化；
S5、以纯化后的表达载体转染哺乳细胞CHO-K1中以得到表达细胞；
S6、从所述表达细胞的培养基中纯化出HNP-1-Fc重组蛋白。
优选地，步骤S5中将所述重组载体转染所述目标细胞之前还包括以下步骤：
在转染前7天，将所述目标细胞用添加有体积分数为10％的胎牛血清的F-12培养基培养于24孔板中；
在转染前6天至转染前1天的期间，每天更换培养基的同时丢弃一半数目的所述目标细胞，并用CHO-S-SFM II培养基与含有10％的胎牛血清的F-12培养基组成的混合培养基培养，在转染前1天将所述目标细胞转移至6孔培养板中，应用CHO-S-SFM II作无血清培养，其中所述6孔板的每孔装有2mL CHO-S-SFM II培养基。
优选地，在转染前6天至转染前1天的期间，所述混合培养基中的含有10％的胎牛血清的F-12培养基的比重由100％每天递减20％，直至0。
优选地，所述步骤S6中纯化HNP-1-Fc重组蛋白的具体步骤包括：
S61、将表达细胞的上清液加入亲和层析柱，置静音混匀器翻转混匀反应2-4小时，收集穿透液；
S62、使用冲洗液冲洗所述上清液中未结合组分，以G250蛋白染色液检测直至将柱床冲洗干净；
S63、向所述层析柱内加入洗脱液洗脱，用G250蛋白染色液鉴定是否有蛋白洗脱下来，当出现蛋白时，用5mL离心管收集蛋白，直到G250蛋白染色液显示为无色，说明无HNP-1-Fc重组蛋白流出时为止，其中每根离心管加250μL1M Tris·HCl缓冲液中和；
S64、根据洗脱时G250蛋白染色液的颜色确定HNP-1-Fc重组蛋白所在的离心管，合并这些离心管内的重组蛋白。
一种HNP-1-Fc重组蛋白在制备抗肺炎药物中的应用。
本发明的有益效果：
1、构建了能在哺乳动物细胞中稳定高表达目的蛋白的基因质粒。
2、通过重组表达载体的大肠杆菌转化，氨苄青霉素培养基筛选扩增阳性菌落，可以迅速提取纯化表达载体，并对表达载体进行酶切和测序鉴定。
3、敲除促凋亡因子bax和bak基因改造过的CHO-K1细胞，持续存活时间延长，细胞培养密度增高，有利于重组蛋白的积累，产量增高。通过抗生素筛选以及培养基条件的改进，建立起产量高，表达稳定，适合悬浮培养的细胞株储备库。初选出来的细胞株的HNP蛋白产量＞10mg/L。
4、引入hIgG2-Fc片段的HNP-1重组蛋白具有与天然蛋白同等的生物活性，不受引入的hIgG2-Fc片段影响。初试结果显示，与纯化的天然蛋白对比，HNP-1-Fc重组蛋白对细菌的杀灭与对人类上皮细胞粘附性的增强作用均无明显差异。
5、HNP-1-Fc重组蛋白具有如下优势：a、增强蛋白稳定性，延长循环时间；b、增强与靶细胞(病原菌等)的亲和力，提高杀菌效果；c、降低产物的免疫原性；d、便于产物提取纯化，适用于大批量重组蛋白粗产品的一步性提取纯化。利用HNP-1-Fc重组蛋白Fc片段，通过Protein A亲和层析柱一步法使融合有hIgG2-Fc的HNP-1重组蛋白挂柱洗脱，可以一次大批量地提取纯化重组蛋白产物。初试显示，应用该法重组蛋白回收率达到72％，纯度达到95％。
附图说明
图1为本发明所述的重组蛋白表达载体的构建流程图；
图2为本发明所述的HNP-1-Fc重组蛋白的灭菌活性检测结果图；
图3为本发明所述的HNP-1/Fc重组蛋白对上皮细胞粘附性影响结果图；
图4为本发明所述的HNP-1/Fc重组蛋白纯化结果检测图；
图5为本发明所述的HNP-1/Fc重组杂交蛋白上分离HNP-1检测图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明提供了一种HNP-1-Fc重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1、从人的单克隆抗体细胞中提取携带hlgG2-Fc蛋白翻译信息的mRNA，以所述mRNA为模板合成cDNA；
S2、合成携带hGHRH蛋白翻译信息的cDNA片段，并与步骤S1合成的cDNA连接，形成hGHRH/hIgG2-Fc基因克隆片段，hGHRH蛋白是一种生长激素刺激激素，能够帮助细胞分泌重组蛋白，重组蛋白表达完后，能够自动离开，类似信号肽的作用；
S3、合成包含Flag的HNP-1的cDNA片段：Flag/HNP-1，与步骤S2合成的基因克隆片段连接，形成hGHRH/hIgG2-Fc/Flag/HNP-1基因克隆片段，将其定向克隆至真核细胞重组载体pMPGCR5B上，构建表达载体；；所述真核细胞载体有7832bp，含有较多酶切位点，可帮助外源基因克隆入载体；该载体含有CMV启动子，可促进外源基因的表达；载体含有HygromycinB(简称Hygro B)抗性基因作为真核细胞转染后的选择标志，用于在Hygro B抗生素压力下获取稳定表达的CHO宿主细胞株。
S4、将所述表达载体转化至大肠杆菌中，应用含有氨苄青霉素培养基筛选出阳性转化菌落，扩增阳性转化菌落并提取表达载体，并对表达载体进行酶切和测序鉴定；
S5、敲除CHO-K1细胞中Bax和Bak基因，得到具有抗凋亡特性目标细胞，以纯化并测序鉴定后的表达载体转染所述目标细胞中以得到表达细胞；
S6、从所述表达细胞的培养基中纯化HNP-1/hIgG2-Fc杂交重组蛋白，如有必要可继续切除杂交重组蛋白中的Fc片段，纯化出HNP-1重组蛋白。
所述步骤S5中将所述重组载体转染所述目标细胞之前还包括以下步骤：
在转染前7天，将所述目标细胞用添加有体积分数为10％的胎牛血清的F-12培养基培养于24孔板中；
在转染前6天至转染前1天的期间，每天更换培养基的同时丢弃一半数目的所述目标细胞，并用CHO-S-SFM II与10％的胎牛血清的F-12培养基按比例混合，逐步降低所述含10％胎牛血清的F-12培养基的体积分数，每天递减20％，直至转染前1天递减为0，此过程中，胎牛血清在混合培养基中的体积分数也从10％逐步降低到0。在转染前1天将所述目标细胞转移至6孔培养板中，应用CHO-S-SFM II作无血清培养，其中所述6孔板的每孔装有2mLCHO-S-SFM II培养基。
所述步骤S6中纯化HNP-1/hIgG2-Fc重组蛋白的具体步骤包括：
S61、将表达细胞的上清液加入亲和层析柱，置静音混匀器翻转混匀反应2-4小时，收集穿透液；
S62、使用冲洗液冲洗所述上清液中未结合组分，以G250蛋白染色液检测直至将柱床冲洗干净；
S63、向所述层析柱内加入洗脱液洗脱，用G250蛋白染色液鉴定是否有蛋白洗脱下来，当出现蛋白时，用5mL离心管收集抗体，直到G250蛋白染色液显示无蛋白流出，其中每根离心管加250μL1.0M Tris缓冲液中和；
S64、根据洗脱时G250蛋白染色液的颜色确定蛋白所在的离心管，合并这些离心管内的蛋白，得到融合蛋白的溶液。
所述步骤S6中切除重组蛋白中的Fc片段的具体步骤包括：
S65、取所述融合蛋白的溶液50μL，加入肠激酶(5U)，置37℃水浴消化过夜，随后加6倍浓的SDS样本缓冲液10μL到消化样本中，终止消化；
S66、继续在4℃下使用2L由透析液透析3次，间隔4h换液一次，每次使用2L透析液，将透析后的溶液在4℃下，以4000×g的转速离心20min，随后将上清移至一个干净的管中，用SDS-PAGE分析成分，其中，所述透析溶液中包括0.05mol/L PBS、0.05mol/L EDTA，所述透析液的pH为7.4；
S67、应用HNP-1抗体亲和柱吸附HNP-1重组蛋白，将HNP-1重组蛋白用10倍柱填料体积的1×PBS缓冲溶液洗脱纯化出来。
所述的HNP-1-Fc重组蛋白在制备抗肺炎药物中的应用。
本发明的主要技术路线：
1.重组表达载体的构建：
a.TRIzol法从人单克隆抗体细胞中提取RNA，进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，以IgG2-Fc mRNA为模板在引物的牵引下合成hIgG2-Fc的cDNA第一条链。
b.化学合成起始端带有Bgl II限制性酶切位点的hGHRH cDNA片段，设计引物，以hGHRH cDNA片段与hIgG2-Fc的cDNA链为模板，并在末端引入EcoRV，利用重叠PCR合成BglII/hGHRH/hIgG2-Fc/EcoRV DNA片段。
c.依据已知核苷酸序列，化学合成并首尾连接在一起的Flag/HNP-1片段，并且在这段基因片段的首尾两端引入酶切位点EcoRV和Hind III，形成EcoRV/Flag/HNP-1/HindIII基因序列。
d.通过PCR扩增，将Bgl II/hGHRH/hIgG2-Fc/EcoR V与EcoR V/Flag/HNP-1/HindIII连接在一起，形成Bgl II/hGHRH/hIgG2-Fc/Flag/HNP-1/Hind III cDNA基因序列。
e.选用含Hygromycin B抗性基因的pMPGCR5B(7832bp)质粒作为表达载体，使用内切酶Bgl II和Hind III将pMPGCR5B载体酶切，暴露出相同的粘性末端，在T4连接酶的作用下将hGHRH/hIgG2-Fc/Flag/HNP-1基因片段定向克隆到pMPGCR5B表达载体上，形成pMPGCR5B-HNP-1/Flag/hIgG2-Fc/hGHRH重组表达载体。
f.将重组载体pMPGCR5B-HNP-1/Flag//hIgG2-Fc/hGHRH转化至大肠杆菌宿主菌株DH5α中。在含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基上培育筛选阳性转化菌落。
g.扩增阳性转化菌落，小批量提取载体，使用BglII，EcoR V和Hind III三种内切酶对上述重组载体消化内切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳以确定插入片段的大小，切胶回收，测序鉴定，确认hGHRH/hIgG2-Fc和Flag/HNP-1的cDNA片段已经克隆进载体pMPGCR5B。
h.将测序正确的菌落扩大培养提取质粒，保种菌种。
2.重组蛋白的表达：
a.我们使用敲除了促凋亡因子Bax和Bak编码基因的中国仓鼠细胞CHO-K1作为表达细胞。
b.以测序鉴定正确的纯化质粒转染抗凋亡CHO-K1细胞：
1)CHO-K1细胞的复苏及活化：
于转染前一周，将CHO-K1细胞从液氮罐中取出，用10％胎牛血清F-12培养基培养于T25培养瓶中，培养基中添加HEPES(20mM)和L-glutamine(125mg/L)以维持培养基酸碱度和营养供给。每天进行换液至细胞完全复苏并达到合适的细胞密度后，转至24孔板中培养，并按比例添加CHO-S-SFM II无血清培养液逐步降低胎牛血清浓度，从第一天的10％逐步降低到8％(第二天)、6％(第三天)、4％(第四天)、2％(第五天)、0％(第六天)。
转染前一天(第7天)将细胞转移至6孔板中，每孔细胞数为：2.6×105个，加CHO-S-SFM II培养基到6孔板中，2mL/孔。
2)磷酸钙转染：
转染当天保证细胞汇合度约40％，转染前3h更换培养液。待转染质粒pMPGCR5B-HNP-1/Flag/hIgG2-Fc/hGHRH经纯化后，取5μg质粒加入CaCl2溶液及HBS(均按操作指南用量)混匀，室温放置30min后加不含胎牛血清的CHO-S-SFM II至总体积为2mL，滴加至细胞表面。细胞培养48h后收获细胞；
c.将细胞转移至T25培养瓶中，用不含胎牛血清的CHO-S-SFM II培养基培养，其中含有Hygromycin B 600μg/mL。待细胞增殖达每毫升含2.5×105时，换液一次，依然含有Hygromycin B 600μg/mL；
d.待细胞在T25培养瓶底增殖达每毫升含5×105时，再换液一次，并于换液后的第二天，用血球计数板计数细胞，用含有200μg/mL浓度的Hygromycin B的CHO-S-SFM II培养基将计数细胞序列稀释后转至96孔板培养，保证每个孔200μL细胞悬浮液中含有约5个细胞，加入到五块96孔板中进行培养筛选；
e.待细胞形成明显克隆并占孔底面积1/3时，取上清点硝酸纤维素膜，用兔抗人IgG-Fc抗体和酶标羊抗兔二抗检测，做Dot-blot检测，有圆点显色的为阳性。挑选阳性强度较高且细胞集落较少的孔进行梯度亚克隆，待亚克隆细胞长至占孔底面积1/3时，取上清点硝酸纤维素膜重复Dot-blot检测；取强阳性的细胞进一步亚克隆。如此反复亚克隆，直至所以细胞克隆孔上清均呈阳性后，再重复亚克隆一次，最终筛选出呈强阳性的细胞株5C9和5G10，扩增培养建库。
g.将强阳性的细胞克隆集落依次转移至24孔板、6孔板中扩培，待6孔板中细胞增殖较多后转移至T25细胞培养瓶内培养。
v.从T25细胞培养瓶依次转移至T75培养瓶、T125多层培养板、10L培养瓶扩培，直至转移到50L发酵罐内培养。
3.CHO-K1细胞表达的重组蛋白HNP的富集
从T25细胞培养瓶扩培筛选株5C9和5G10开始，每隔3h晃动一次培养瓶阻止细胞贴壁，并且每次转移细胞时只取悬浮细胞，直至细胞转移至50L发酵罐。在发酵罐罐内置搅拌棒以帮助细胞均匀地悬浮生长。
4.HNP-1/hIgG2-Fc重组蛋白的灭菌活性试验：
从未经转染CHO-K1细胞，Dot-blot呈强阳性的转染细胞株5C9和5G10培养瓶中分别取0.1mL不含细胞的培养液，以0.1mL 50μg/mL HNP-1作阳性对照，分别与50μL大肠杆菌混合培养，检测HNP-1-Fc重组蛋白抑菌效果。
5.HNP-1-Fc重组蛋白增强上皮细胞粘附性试验：
从未经转染CHO-K1细胞，Dot-blot强阳性的细胞株5C9和5G10培养瓶中分别取0.5mL不含细胞的培养液，以0.5mL 50μg/mL HNP-1作阳性对照，检测HNP-1-Fc重组蛋白对人支气管上皮(BEAS-2B)细胞粘附性的增强作用。
6.Protein A法纯化HNP-1/hIgG2-Fc重组蛋白
收集发酵罐内的细胞悬液，离心去除CHO-K1细胞，获得约49L细胞培养上清液，以离心后的细胞培养上清液过Protein A亲和层析柱，HNP-1/hIgG2-Fc重组蛋白挂柱，以不加咪唑的PBS缓冲液洗脱收集纯化重组HNP/hIgG2-Fc蛋白(详见图4)，最终重组蛋白回收率为72％，纯度达到95％。
7.肠激酶消化从重组HNP-1/hIgG2-Fc蛋白中分离HNP-1。
实施例1：
重组质粒pMPGCR5B-HNP-1的构建
1.1hIgG2-Fc/EcoRV基因片段的制备
从人单克隆抗体细胞中提取RNA，设计逆转录引物，以hIgG2-Fc的mRNA为模板逆转录合成其cDNA片段；以hIgG2-Fc的cDNA为模板，设计一对PCR扩增引物，PCR合成扩增出下游带有EcoRV酶切位点cDNA片段：hIgG2-Fc/EcoRV。
逆转录引物(SEQ ID 6)设计如下：
5'CGACGGCTCCTTCTTC 3’
一对PCR扩增引物序列分别如下：(下划线为EcoR V酶切位点)
上游引物(SEQ ID 7)：5’CGACGGCTCCTTCTTC 3’
下游引物(SEQ ID 8)：5’CCGGATATCTTCTGCGTGTAGTGGTTG 3’
按照逆转录酶ReverTra Ace试剂盒说明做RT-PCR：
RNA热变性：
65℃，5min后，立即置于冰上。
反应液配置：
逆转录反应：
PCR体系：
PCR循环参数：95℃5min，[94℃30s，58℃30s，72℃45s]30个循环后，72℃10min，4℃保存。
扩增产物依次通过1％琼脂糖凝胶电泳切胶纯化、DNA抽提试剂盒回收，扩增产物片段大小为：902bp。通过基因测序，获得该基因片段序列(SEQ ID1)，此为hIgG2-Fc/EcoRV的cDNA基因片段。
1.2化学合成上游带有Bg1 II酶切位点的hGHRH基因片段：Bgl II/hGHRH(SEQ ID2)
1.3制备Bgl II/hGHRH/hIgG2-Fc/EcoRV基因片段：以Bgl II/hGHRH片段的末端与hIgG2-Fc/EcoRV片段的起始端为模板，设计前向引物；以hIgG2-Fc/EcoRV片段的末端为模板，设计逆向引物；以PCR合成扩增出Bgl II/hGHRH/hIgG2-Fc/EcoRV基因片段(SEQ ID 3)。
寡核苷酸引物设计：(下划线为EcoR V酶切位点)
P1：前向引物5'ACAACATTTGCGCTCGGAGCAGTGGGAGCT 3’(SEQ ID 9)：
P2：逆向引物5'CCGGATATCTTCTGCGTGTAGTGGTTG3’(SEQ ID 10)：
扩增的方案：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃30s(30cycles)
72℃5min；反应管总体积20μL，含前向引物和逆向引物各1μL，2×PCR mix 10μL，ddH2O 8μL。
1.4化学合成末端带有Hind III酶切位点的Flag/HNP-1基因片段：以已知的核苷酸序列，化学合成首尾相连的Flag/HNP-1基因片段，并在Flag和HNP-1序列之间加入一个肠激酶切位点，在Flag/HNP-1的末端引入Hind III酶切位点，合成Flag/HNP-1/Hind III基因片段(见SEQ ID 4)。
1.5重组基因克隆片段的制备：
以BglII/hGHRH/hIgG2-Fc/EcoRV片段的末端与Flag/HNP-1/HindIII片段的起始端为模板，设计前向引物；以Flag/HNP-1/HindIII片段的末端为模板，设计逆向引物；以PCR合成扩增出基因克隆片段：Bgl II/hGHRH/hIgG2-Fc/Flag/HNP-1/Hind III(SEQ ID 5)。
寡核苷酸引物设计：
P3：5’GTCATCCTTATAATCGATATCCGGTCATTT 3’前向引物(SEQ ID 11)：
P4：逆向引物5’GGCATTCTGCTGCTTTAT 3’(SEQ ID 12)：
扩增的方案：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃30s(30cycles)
72℃5min；反应管总体积20μL，含前向引物和逆向引物各1μL，2×PCR mix 10μL，ddH2O 8μL。
1.6载体质粒pMPGCR5B酶切线性化：
质粒pMPGCR5B(7832bp)用限制性内切酶Hind III(Sigma)和Bgl II(Sigma)消化酶切，所得酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分离纯化，所得片段长度约为270bp和7600bp。将线性化的pMPGCR5B主链的7600bp片段用DNA抽提试剂盒提取纯化。
1.7重组表达载体pMPGCR5B-hIgG2-Fc/Flag/HNP-1的制备
利用相同的粘性末端，用T4连接酶将步骤1.5中制备的重组基因克隆片段BglII/hGHRH/hIgG2-Fc/Flag/HNP-1/HindIII定向克隆到在步骤1.6中线性化的pMPGCR5B主链上，形成pMPGCR5B-hIgG2-Fc/Flag/HNP-1。
1.8重组载体pMPGCR5B-hIgG2-Fc/HNP-1的验证
将重组载体pMPGCR5B-hIgG2-Fc/Flag/HNP-1转化至大肠杆菌宿主菌株DH5α中。在含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基上培育筛选择阳性转菌落。
扩增阳性转菌落，小批量提取载体。使用Bgl II，EcoR V和Hind III三种内切酶对上述重组载体消化内切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳以确定插入片段的大小(预期160bp、～7600bp和900bp片段)与顺序是否正确，切胶回收，测序鉴定，确认hIgG2-Fc和Flag/HNP-1的cDNA片段已经克隆进载体pMPGCR5B。
如图1所示的是重组蛋白HNP-1-Fc表达质粒的构建：以化学合成起始端带有BglII限制性酶切位点的hGHRH cDNA片段和逆转录合成hIgG2-Fc的cDNA链为模板设计引物，PCR合成Bgl II/hGHRH/hIgG2-Fc/EcoR V DNA片段(末端引入EcoR V酶切位点)，化学合成并首尾连接在一起的Flag/HNP-1片段，并在末端引入酶切位点Hind III，设计引物，PCR反应与已合成含hIgG2-Fc基因片段连接，形成Bgl II/hGHRH/hIgG2-Fc/Flag/HNP-1/Hind III克隆基因片段。使用内切酶Bgl II和Hind III将pMPGCR5B载体酶切，暴露出相同的粘性末端，在T4连接酶的作用下将hGHRH/hIgG2-Fc/Flag/HNP-1基因片段定向克隆到pMPGCR5B表达载体上，构建pMPGCR5B-hIgG2-Fc/Flag/HNP-1重组表达载体。
实施例2：
HNP-1/hIgG2-Fc重组蛋白抑菌活性初试
从未经转染CHO-K1细胞，Dot-blot强阳性的转染细胞株5C9和5G10培养瓶中分别取0.1mL不含细胞的培养液，取0.1mL纯化的HNP-1(50μg/mL，溶入CHO-S-SFM II培养液)作阳性对照，分别加入50μL细菌悬浮液(5×105CFU/mL)中，置37℃每分钟200转震荡孵育4小时。用分光光度计检测620nm处的OD值，对照各组抑菌结果，由图2可知，未转染阴性对照组的OD值最高为0.41，说明细菌繁殖正常；而纯化HNP的阳性样本OD值最低，只有0.0075，细菌生长抑制作用明显。而HNP表达CHO-K1细胞株1#样本(5C9)OD值为0.1；2#样本(5G10)OD值为0.075。这两个样本OD值与阳性样本类似，明显低于阴性对照，说明这两个细胞培养上清液样本均能对细菌的生长产生抑制作用，证实这两株细胞均能表达具有生物活性的HNP-1，细胞株5G10的HNP-1表达高于5C9。
实施例3：
HNP-1/hIgG2-Fc重组蛋白增强上皮细胞粘附性效能初试：
从未经转染CHO-K1细胞，Dot-blot强阳性的细胞株5C9和5G10培养瓶中分别取0.5mL细胞培养上清液，以0.5mL 50μg/mL HNP-1作阳性对照，与单层人支气管上皮(BEAS-2B)细胞置37℃培养箱内作用4小时，以胰蛋白酶消化至阴性对照组细胞完全悬浮后，对未悬浮细胞染色检测各组细胞的粘附性。重组HNP-1/hIgG2-Fc蛋白对上皮细胞粘附性的增强作用见图3。
由图3可知，未经转染的阴性对照OD值最低(0.0035)，粘附性最差；而纯化HNP阳性对照样本OD值最高(0.15)，细胞的粘附性最强。而HNP表达CHO-K1细胞株1#样本(5G10)OD值为0.0853，2#样本(5C9)OD值为0.0625，与阳性样本类似，均明显高于阴性对照，说明这两株细胞培养上清液样本均能增强上皮细胞的粘附性。再次证实这两株细胞均能表达具有生物活性的HNP-1，细胞株5G10的HNP-1表达高于5C9，故以5G10细胞作为最后建株细胞株。
实施例4：
Protein A亲和层析法提取纯化重组HNP-1/hIgG2-Fc蛋白
提取纯化原理在于抗体IgG与Protein A之间具备高度的亲和力，能通过其Fc片段与Protein A相结合。当含有重组HNP-1/hIgG2-Fc蛋白无细胞培养液通过层析柱时，重组蛋白通过其Fc片段与凝胶上的Protein A结合而吸附在层析柱上，待将培养液中的其他杂质洗脱干净后，再用洗脱液将吸附的重组蛋白从层析柱上心头下来。该法简便易行，提取效率与纯度高，可一次性处理大量样本。本实施中，先将高表达细胞株5G10反复扩增至50L发酵罐中继续培养至Don-blot检测强阳性，低速离心(1000rpm，30min)，去掉细胞沉淀收集上清培养液。通过0.45μm滤膜过滤一遍，将滤液加载到Protein A亲和层析柱上纯化。提取纯化具体步骤如下：
1)材料准备：
1.结合/冲洗缓冲液：PBS(20mM，150mM NaCl，pH 7.0)。
2.样品：待纯化细胞培养液。
3.洗脱液：0.1～0.2M甘氨酸·盐酸缓冲液，pH 3.0，含150mM NaCl。
4.中和液：1M Tris·HCl(pH 8.5～9.0)。
5.Protein A Beads(碧云天)
6.考马斯亮蓝G250(Coomassie brilliant blue G-250，碧云天)
7.保存液：20％乙醇。
2)层析柱制备及预处理：
8.平衡Protein A Beads至室温(结合/冲洗缓冲液制备凝胶悬液)。
9.将内径为1.5cm，长度为15.0cm的层析柱固定在支架上，装好底部滤芯，盖好底盖。向层析柱内加入20mL凝胶悬液。
10.移去底盖让保存液流掉。
11.以10倍柱床体积的结合/冲洗缓冲液冲洗层析柱。
3)重组HNP-1/hIgG2-Fc蛋白的提取与纯化：
12.上样：将处理好的细胞上清液加入层析柱，置静音混匀器翻转混匀反应2～4小时。
13.移去顶盖与底盖，让细胞上清液流出，收集穿透液。
14.以结合/冲洗缓冲液冲洗样品中未结合组分，以G250检测直至将柱床冲洗干净。
15.洗脱：往层析柱内加入洗脱液洗脱。用G250蛋白染色液鉴定是否有蛋白洗脱下来。当出现蛋白时，用5mL离心管收集洗脱的重组HNP-1/hIgG2-Fc蛋白，直到G250染色液显示无抗体流出为止。每管加250μL中和液中和。
16.根据洗脱时G250的颜色确定重组蛋白收集管，将各收集管的重组蛋白集中混合，留作进一步透析或脱盐处理，然后分装冻干贮存。
17.用SDS-PAGE分离纯化的重组蛋白，并转至硝酸纤维膜上。膜染色结果显示一条单一蛋白染色带(图4A)。兔抗人IgG-Fc抗体Western blot鉴定检测结果见图4B，单一的HNP-1/Fc重组蛋白带出现在蛋白染色带相同的位置，说明纯化效果良好。经紫外分光光度计(280nm)检测重组蛋白浓度为：11mg/mL。最终重组蛋白回收率为72％，纯度达到95％。
4)层析柱的平衡及保存
18.洗脱完毕后立即以8倍柱床体积的结合/冲洗缓冲液冲洗平衡层析柱，以防止低pH的洗脱液对Beads造成破坏。
19以2倍柱床体积的20％乙醇完成平衡，盖上底盖，加入1倍柱床体积的保存液，4℃直立保存，切勿冰冻。
实施例5：
肠激酶消化从重组HNP-1/hIgG2-Fc蛋白中分离HNP-1蛋白
1.取HNP-1/Fc重组蛋白亲和纯化洗脱液50μL，加入肠激酶(5U)，置37℃水浴消化过夜；
2.加6倍浓的SDS样本缓冲液10μL到消化样本中，终止消化；
3.将样本加热变性，用SDS-PAGE分离，并转至硝酸纤维膜上；
4.膜染色结果显示一条高分子量的hIgG2-Fc蛋白单一染色带(图5A)。分别以抗HNP-1抗体Western blot鉴定检测结果见图5B。经过酶切以后，HNP-1抗体检测显示出一条分子量明显低于hIgG2-Fc重组蛋白染色带的HNP-1重组蛋白带，证实HNP-1重组蛋白从HNP-1/Fc杂交蛋白上酶切分离出来，说明酶切效果好，达到预期分离目的。图5所示3个泳道分别取自3个不同批次纯化HNP-1/Fc杂交蛋白酶切样本。
本发明的工业实用性
1、构建了能在哺乳动物细胞中稳定高表达目的蛋白的基因质粒。
2、通过重组表达载体的大肠杆菌转化，氨苄青霉素培养基筛选扩增阳性菌落，可以迅速提取纯化表达载体，并对表达载体进行酶切和测序鉴定。
3、敲除促凋亡因子bax和bak基因改造过的CHO-K1细胞，持续存活时间延长，细胞培养密度增高，有利于重组蛋白的积累，产量增高。通过抗生素筛选以及培养基条件的改进，建立起产量高，表达稳定，适合悬浮培养的细胞株储备库。初选出来的细胞株的HNP蛋白产量＞10mg/L。
4、初试结果显示，HNP-1-Fc重组蛋白对细菌的杀灭与对人类上皮细胞粘附性的增强作用均与纯化的天然蛋白无明显差异。因此，引入hIgG2-Fc片段的HNP-1重组蛋白具有与天然蛋白同等的生物活性，不受引入的hIgG2-Fc片段影响。活体应用时，HNP-1/hIgG2-Fc杂交融合蛋白还具有如下优势：1)增强蛋白稳定性，延长循环时间；2)增强与靶细胞(病原菌等)的亲和力，提高杀菌效果；3)降低产物的免疫原性；
5、利用HNP-1-Fc重组蛋白Fc片段与Protein A的高度亲和性，融合有hIgG2-Fc的HNP-1重组蛋白能高效率地吸附在Protein A亲和层析柱上，可以一次大批量地提取纯化重组蛋白产物。初试显示，应用该法重组蛋白回收率达到72％，纯度达到95％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (2)
1.一种HNP-1-Fc重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、从人的单克隆抗体细胞中提取携带hIgG2-Fc蛋白翻译信息的mRNA，以所述mRNA为模板合成cDNA；
S2、以化学合成起始端带有BglII限制性酶切位点的hGHRH cDNA片段和步骤S1逆转录合成hIgG2-Fc的cDNA链为模板设计引物，PCR合成Bgl II/hGHRH/hIgG2-Fc/EcoR Ⅴ DNA片段；
S3、化学合成并首尾连接在一起的Flag/HNP-1片段，并在末端引入酶切位点Hind III，设计引物，PCR反应与步骤S2合成的基因克隆片段连接，形成Bgl II/hGHRH/hIgG2-Fc/Flag/HNP-1/Hind III克隆基因片段，使用内切酶Bgl II和Hind III将pMPGCR5B载体酶切，暴露出相同的粘性末端，在T4连接酶的作用下将hGHRH/hIgG2-Fc/Flag/HNP-1基因片段定向克隆到pMPGCR5B表达载体上，构建pMPGCR5B-hIgG2-Fc/Flag/HNP-1重组表达载体；
S4、将所述表达载体转化至大肠杆菌中，用含有氨苄青霉素培养基筛选出阳性转化菌落，扩增阳性转化菌落并提取表达载体，并对表达载体进行酶切和测序鉴定，对测序后的表达载体进行纯化；
S5、以纯化后的表达载体转染敲除Bax和Bak基因的哺乳细胞CHO-K1中以得到表达细胞；
S6、从所述表达细胞的培养基中纯化出HNP-1-Fc重组蛋白；
步骤S5中将所述重组载体转染敲除Bax和Bak基因的哺乳细胞CHO-K1之前还包括以下步骤：
在转染前7天，将敲除Bax和Bak基因的哺乳细胞CHO-K1用添加有体积分数为10％的胎牛血清的F-12培养基培养于24孔板中；
在转染前6天至转染前1天的期间，每天更换培养基的同时丢弃一半数目的敲除Bax和Bak基因的哺乳细胞CHO-K1，并用CHO-S-SFM II培养基与含有10％的胎牛血清的F-12培养基组成的混合培养基培养，在转染前1天将敲除Bax和Bak基因的哺乳细胞CHO-K1转移至6孔培养板中，应用CHO-S-SFM II作无血清培养，其中所述6孔板的每孔装有2mL CHO-S-SFM II培养基；所述混合培养基中的含有10％的胎牛血清的F-12培养基的比重由100％每天递减20％，直至0。
2.如权利要求1所述的HNP-1-Fc重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中纯化HNP-1-Fc重组蛋白的具体步骤包括：
S61、将表达细胞的上清液加入亲和层析柱，置静音混匀器翻转混匀反应2-4小时，收集穿透液；
S62、使用冲洗液冲洗所述上清液中未结合组分，以G250蛋白染色液检测直至将柱床冲洗干净；
S63、向所述层析柱内加入洗脱液洗脱，用G250蛋白染色液鉴定是否有蛋白洗脱下来，当出现蛋白时，用5mL离心管收集蛋白，直到G250蛋白染色液显示为无色，说明无HNP-1-Fc重组蛋白流出时为止，其中每根离心管加250μL1M Tris·HCl缓冲液中和；
S64、根据洗脱时G250蛋白染色液的颜色确定HNP-1-Fc重组蛋白所在的离心管，合并这些离心管内的重组蛋白。
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