CN105131065B - 一种氧化型辅酶i的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+；其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母加入盐酸中浸泡后，加热、保温、加冰块冷却至室温，离心得到清液A；搅拌12‑16h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B；提取NAD+包括如下步骤：酸化，交换，洗脱，去盐，分离，洗脱和收集。本发明能大大增加酵母细胞的破碎率，原料廉价易得，设备简单，操作方便，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及辅酶I制备技术领域，尤其涉及一种氧化型辅酶I的制备方法。
背景技术
辅酶I(NAD)，化学名为烟酰胺腺嘌呤二核甘酸或二磷酸烟苷，在哺乳动物体内存在氧化型(NAD+)和还原型(NADH)两种状态，是人体氧化还原反应中重要的辅酶。参与各类细胞功能的新陈代谢，对机体免疫能力有重要作用。在健康状态下，人体内辅酶I浓度稳定，维持各项细胞正常功能。体内的辅酶I浓度决定了细胞衰老的过程和程度，浓度下降会加速细胞衰老的过程。
辅酶I主要存在于酵母细胞线粒体中，属于胞内酶，且酵母细胞壁厚100-300nm,细胞壁由外及内分别有甘露聚糖层，蛋白质，葡聚糖层组成，其中占30-40％的葡聚糖是不溶性聚糖，构成细胞刚性骨架，保持细胞坚韧性和形态。胞内物质难以释放出胞外。想要获得高产量的NAD+，必须充分提高细胞破碎率，从而使得产物能够释放到细胞外，为后期提取创造条件。
目前，经常使用的破壁方法有温差法和高压均浆法，温差法(热处理法)主要通过水结冰与加热熔化产生的力以及温度突然变化，破坏细胞组织结构，该方法效果不理想；高压匀浆法需要高压均质机及大容量高速离心机，其破碎原理为细胞在一系列过程中经历了高速造成的剪切、碰撞以及由高压到常压的变化从而造成细胞的破碎，该方法生产成本高，效率低，不适合工业化大生产。由上可知，两种方法均无法满足工业化大生产需要。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种氧化型辅酶I的制备方法，本发明能大大增加酵母细胞的破碎率，原料廉价易得，设备简单，操作方便，适合工业化生产。
本发明提出的一种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+；
其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.01-0.12mol/l的盐酸中浸泡0.5-2.5h后，加热至85-100℃，保温3-8min，加冰块冷却至室温，离心得到清液A；搅拌12-16h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比(g/ml)为15-25：80-400，酵母细胞和717#树脂的重量比为15-25：45-90。
优选地，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.06-0.11mol/l的盐酸中浸泡0.7-2h后，加热至90-98℃，保温3-5min，加冰块以10-15℃/min的速度冷却至室温，以4000-6000rpm的速度进行离心10-20min得到清液A；搅拌13-15h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比(g/ml)为18-22：100-300，酵母细胞和717#树脂的重量比为18-22：55-70。
优选地，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.1mol/l的盐酸中浸泡1h后，加热至95℃，保温4min，加冰块以13℃/min的速度冷却至室温，5000rpm的速度进行离心15min得到清液A；搅拌14h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比(g/ml)为20：120，酵母细胞和717#树脂的重量比为20：60。
优选地，提取NAD+包括如下步骤：酸化，交换，洗脱，去盐，分离，洗脱和收集。
优选地，提取NAD+的具体步骤如下：
S1、酸化：向清液B中加入浓度为5-7mol/l的盐酸调节PH为1.95-2.05得到溶液C；
S2、交换：将S1中得到的溶液C以15-20ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸馏水以15-25ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为1：2-3；
S3、洗脱：调节液面距122#柱上层树脂层4-5cm，用浓度为0.3-0.5mol/l的氨水以5-7ml/min的速度洗脱，当洗脱液pH＝7-8时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨水的总体积的比为1：2-3；
S4、去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732#树脂，边加边搅拌，至PH为4.95-5.05，过滤得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E；
S5、分离：用氨水调节S4中得到溶液E至pH为6.5-7.5，室温放置7-8天后，以3.5-5ml/min的速度上717#树脂柱，上柱结束后，用40-60ml蒸馏水以5-7ml/min的速度洗涤；
S6、洗脱：取浓度为0.08-0.12mol/l氯化钾溶液50-70ml，以3.5-5ml/min的速度洗脱，收集洗脱液，洗脱液以3.5-5ml/min的速度上769型炭柱，用20-40ml蒸馏水以5-7ml/min的速度洗涤后，用混合溶剂以0.5-1ml/min的速度洗脱NAD+，其中，混合溶剂由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水组成；
S7、收集：收集洗脱液，用5.7-6.3mol/l硝酸调节PH至2-3，立即加入以洗脱液体积份为基准的1-4倍的冷丙酮静置30-50min，去上清液，以2000-4000rpm的速度，离心2-5min，去上清液，干燥沉淀得到NAD+，其中冷丙酮的温度为-5至-15℃。
优选地，S2中，将S1中得到的溶液C以18ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸馏水以20ml/min的速度洗涤，至流出液呈透明淡黄色。
优选地，S6中，混合溶剂中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的体积比为100：400：500：2。
优选地，S7中，分步收集洗脱液，用丙酮测试洗脱液有无沉淀，合并有沉淀的洗脱液，用5.7-6.3mol/l硝酸调节PH至2-3，立即加入以有沉淀的洗脱液体积份为基准的2-3倍的冷丙酮静置35-45min，去上清液，以2500-3500rpm的速度，离心3-4min，去上清液，干燥得到NAD+，其中冷丙酮的温度为-10至-15℃。
上述717#树脂为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。
上述“上柱”是本专业常用术语，意思为将溶液以一定流速从柱子上端倒入柱子中。
上述S2中122#柱为弱酸性酚醛系阳离子交换树脂。
上述S4中732#树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。
上述S6中769型炭柱为活性炭柱。
本发明采用酸-热处理的方法来破碎酵母细胞，条件较温和，对内容物分子破坏性小，且酸性条件有利于辅酶I的稳定，并可以大大增加酵母细胞的破碎率；使用的酵母、盐酸均廉价易得，可以降低生产成本；本发明设备简单、操作方便，适合工业化生产，而且相对于化学合成的方法，更加安全，产品中几乎无毒害化学物质残留。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+；
其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.01mol/l的盐酸中浸泡2.5h后，加热至85℃，保温8min，加冰块以10℃/min的速度冷却至室温，以4000rpm的速度进行离心20min得到清液A；搅拌16h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比(g/ml)为15：400，酵母细胞和717#树脂的重量比为15：45；
其中，提取NAD+的具体步骤如下：
S1、酸化：向清液B中加入浓度为5mol/l的盐酸调节PH为2.05得到溶液C；
S2、交换：将S1中得到的溶液C以15ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸馏水以25ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为1：2；
S3、洗脱：调节液面距122#柱上层树脂层4cm，用浓度为0.5mol/l的氨水以5ml/min的速度洗脱，当洗脱液pH＝8时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨水的总体积的比为1：2；
S4、去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732#树脂，边加边搅拌，至PH为5.05，过滤得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E；
S5、分离：用氨水调节S4中得到溶液E至pH为6.5，室温放置8天后，以3.5ml/min的速度上717#树脂柱，上柱结束后，用60ml蒸馏水以5ml/min的速度洗涤；
S6、洗脱：取浓度为0.08mol/l氯化钾溶液70ml，以3.5ml/min的速度洗脱，收集洗脱液，洗脱液以5ml/min的速度上769型炭柱，用20ml蒸馏水以7ml/min的速度洗涤后，用混合溶剂以0.5ml/min的速度洗脱NAD+，其中，混合溶剂由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水组成，混合溶剂中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的体积比为100：400：500：2；
S7、收集：分步收集洗脱液，用丙酮测试洗脱液有无沉淀，合并有沉淀的洗脱液，用5.7mol/l硝酸调节PH至3，立即加入以有沉淀的洗脱液体积份为基准的1倍的冷丙酮静置50min，去上清液，以2000rpm的速度，离心5min，去上清液，干燥沉淀得到NAD+，其中冷丙酮的温度为-5℃。
实施例2
一种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+；
其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.12mol/l的盐酸中浸泡0.5h后，加热至100℃，保温3min，加冰块以15℃/min的速度冷却至室温，以6000rpm的速度进行离心10min得到清液A；搅拌12h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比(g/ml)为25：80，酵母细胞和717#树脂的重量比为25：90；
其中，提取NAD+的具体步骤如下：
S1、酸化：向清液B中加入浓度为7mol/l的盐酸调节PH为1.95得到溶液C；
S2、交换：将S1中得到的溶液C以20ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸馏水以15ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为1：3；
S3、洗脱：调节液面距122#柱上层树脂层5cm，用浓度为0.3mol/l的氨水以7ml/min的速度洗脱，当洗脱液pH＝7时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨水的总体积的比为1：3；
S4、去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732#树脂，边加边搅拌，至PH为4.95，过滤得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E；
S5、分离：用氨水调节S4中得到溶液E至pH为7.5，室温放置7天后，以5ml/min的速度上717#树脂柱，上柱结束后，用40ml蒸馏水以7ml/min的速度洗涤；
S6、洗脱：取浓度为0.12mol/l氯化钾溶液50ml，以5ml/min的速度洗脱，收集洗脱液，洗脱液以3.5ml/min的速度上769型炭柱，用40ml蒸馏水以5ml/min的速度洗涤后，用混合溶剂以1ml/min的速度洗脱NAD+，其中，混合溶剂由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水组成，混合溶剂中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的体积比为100：400：500：2；
S7、收集：分步收集洗脱液，用丙酮测试洗脱液有无沉淀，合并有沉淀的洗脱液，用6.3mol/l硝酸调节PH至2，立即加入以有沉淀的洗脱液体积份为基准的4倍的冷丙酮静置30min，去上清液，以4000rpm的速度，离心2min，去上清液，干燥沉淀得到NAD+，其中冷丙酮的温度为-15℃。
实施例3
一种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+；
其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.11mol/l的盐酸中浸泡0.7h后，加热至98℃，保温7min，加冰块以12℃/min的速度冷却至室温，以5500rpm的速度进行离心18min得到清液A；搅拌13h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比(g/ml)为22：100，酵母细胞和717#树脂的重量比为22：70；
其中，提取NAD+的具体步骤如下：
S1、酸化：向清液B中加入浓度为6.5mol/l的盐酸调节PH为1.98得到溶液C；
S2、交换：将S1中得到的溶液C以19ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸馏水以18ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为1：2.8；
S3、洗脱：调节液面距122#柱上层树脂层4.8cm，用浓度为0.35mol/l的氨水以6.5ml/min的速度洗脱，当洗脱液pH＝7.3时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨水的总体积的比为1：2.8；
S4、去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732#树脂，边加边搅拌，至PH为4.97，过滤得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E；
S5、分离：用氨水调节S4中得到溶液E至pH为7.2，室温放置7天后，以4.5ml/min的速度上717#树脂柱，上柱结束后，用45ml蒸馏水以6.5ml/min的速度洗涤；
S6、洗脱：取浓度为0.09mol/l氯化钾溶液55ml，以4.5ml/min的速度洗脱，收集洗脱液，洗脱液以4ml/min的速度上769型炭柱，用35ml蒸馏水以5.5ml/min的速度洗涤后，用混合溶剂以0.9ml/min的速度洗脱NAD+，其中，混合溶剂由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水组成，混合溶剂中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的体积比为100：400：500：2；
S7、收集：分步收集洗脱液，用丙酮测试洗脱液有无沉淀，合并有沉淀的洗脱液，用5.8mol/l硝酸调节PH至2.3，立即加入以有沉淀的洗脱液体积份为基准的3倍的冷丙酮静置35min，去上清液，以3500rpm的速度，离心3min，去上清液，干燥得到NAD+，其中冷丙酮的温度为-12℃。
实施例4
一种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+；
其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.06mol/l的盐酸中浸泡2h后，加热至90℃，保温5min，加冰块以14℃/min的速度冷却至室温，以4500rpm的速度进行离心15min得到清液A；搅拌15h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比(g/ml)为18：300，酵母细胞和717#树脂的重量比为18：55；
其中，提取NAD+的具体步骤如下：
S1、酸化：向清液B中加入浓度为5-7mol/l的盐酸调节PH为2.02得到溶液C；
S2、交换：将S1中得到的溶液C以16ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸馏水以22ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为1：2.2；
S3、洗脱：调节液面距122#柱上层树脂层4.2cm，用浓度为0.45mol/l的氨水以5.5ml/min的速度洗脱，当洗脱液pH＝7.7时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨水的总体积的比为1：2.2；
S4、去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732#树脂，边加边搅拌，至PH为5.03，过滤得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E；
S5、分离：用氨水调节S4中得到溶液E至pH为6.7，室温放置8天后，以4ml/min的速度上717#树脂柱，上柱结束后，用55ml蒸馏水以5.5ml/min的速度洗涤；
S6、洗脱：取浓度为0.11mol/l氯化钾溶液65ml，以4ml/min的速度洗脱，收集洗脱液，洗脱液以4.5ml/min的速度上769型炭柱，用25ml蒸馏水以6.5ml/min的速度洗涤后，用混合溶剂以0.7ml/min的速度洗脱NAD+，其中，混合溶剂由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水组成，混合溶剂中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的体积比为100：400：500：2；
S7、收集：分步收集洗脱液，用丙酮测试洗脱液有无沉淀，合并有沉淀的洗脱液，用6.2mol/l硝酸调节PH至2.7，立即加入以有沉淀的洗脱液体积份为基准的2倍的冷丙酮静置45min，去上清液，以2500rpm的速度，离心4min，去上清液，干燥得到NAD+，其中冷丙酮的温度为-10℃。
实施例5
一种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+；
其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将20g酵母细胞加入浓度为0.1mol/l的120ml盐酸中浸泡1h后，加热至95℃，保温4min，加冰块以13℃/min的速度冷却至室温，以5000rpm的速度进行离心10min得到清液A；搅拌14h，搅拌过程中加入60g的717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B；
其中，提取NAD+的具体步骤如下：
S1、酸化：向清液B中加入浓度为6mol/l的盐酸调节PH为2得到溶液C；
S2、交换：将S1中得到的溶液C以18ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸馏水以20ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为1：2.5；
S3、洗脱：调节液面距122#柱上层树脂层4.5cm，用浓度为0.4mol/l的氨水以6ml/min的速度洗脱，当洗脱液pH＝7.5时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨水的总体积的比为1：2.5；
S4、去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732#树脂，边加边搅拌，至PH为5，过滤得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E；
S5、分离：用氨水调节S4中得到溶液E至pH为7，室温放置7天后，以4.2ml/min的速度上717#树脂柱，上柱结束后，用50ml蒸馏水以6ml/min的速度洗涤；
S6、洗脱：取浓度为0.1mol/l氯化钾溶液60ml，以4.3ml/min的速度洗脱，收集洗脱液，洗脱液以4.2ml/min的速度上769型炭柱，用30ml蒸馏水以6ml/min的速度洗涤后，用混合溶剂以1ml/min的速度洗脱NAD+，其中，混合溶剂由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水组成，混合溶剂中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的体积比为100：400：500：2；
S7、收集：分步收集洗脱液，用丙酮测试洗脱液有无沉淀，合并有沉淀的洗脱液，用6mol/l硝酸调节PH至2.5，立即加入以有沉淀的洗脱液体积份为基准的4倍的冷丙酮静置30min，去上清液，以3000rpm的速度，离心2min，去上清液，干燥沉淀得到NAD+，其中冷丙酮的温度为-15℃。
实施例6
一种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+；
其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将20g酵母细胞加入浓度为0.1mol/l的240ml盐酸中浸泡1h后，加热至95℃，保温4min，加冰块以13℃/min的速度冷却至室温，以5000rpm的速度进行离心10min得到清液A；搅拌14h，搅拌过程中加入60g的717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B；
其中，提取NAD+的具体步骤同实施例5。
实施例7
一种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+；
其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将20g酵母细胞加入浓度为0.1mol/l的400ml盐酸中浸泡1h后，加热至95℃，保温4min，加冰块以13℃/min的速度冷却至室温，以5000rpm的速度进行离心10min得到清液A；搅拌14h，搅拌过程中加入60g的717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B；
其中，提取NAD+的具体步骤同实施例5。
实施例8
一种氧化型辅酶I的制备方法，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+；
其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将20g酵母细胞加入浓度为0.1mol/l的240ml盐酸中浸泡2h后，加热至95℃，保温4min，加冰块以13℃/min的速度冷却至室温，以5000rpm的速度进行离心10min得到清液A；搅拌14h，搅拌过程中加入60g的717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B；
其中，提取NAD+的具体步骤同实施例5。
试验例1
用高效液相色谱，根据外标法测定实施例5-8中，1g酵母细胞所含的辅酶I的重量，并与用热处理法制备得到的辅酶I作比较。
热处理法制备清液a的方法为：将20g酵母细胞加入到20g纯化水中，加热至95℃，保温5min，加冰块以13℃/min的速度冷却至室温，以5000rpm的速度进行离心10min得到清液a。
高效液相色谱检测条件如下：
流动相：缓冲盐(25mmol/l三乙胺，磷酸调PH至6.0)：乙腈＝95:5(v/v)
固定相：5C18-MS-Ⅱ，4.6ID×250mm
流速＝1.0ml/min，柱温＝25℃，检测波长＝254nm，进样量＝20μl
溶液配制如下：
标准品溶液：精密称取辅酶I标准品0.1g加1L水制得。
供试品溶液5、6、7、8：依次取实施例5-8的离心清液A各2ml过滤得。
供试品溶液9：用热处理法制备得到清液a，取清液a 2ml过滤得。
分别精密移取上述标准品溶液、供试品溶液5、6、7、8、9，依次进样，记录色谱图20min，按峰面积以外标法计算，计算公式如下：
测试结果如下：
上述计算公式和表格中“清液A总量”，对于供试品溶液9来说，表示的是“清液a总量”。
由上表可知，本发明得到的辅酶I高于热处理法得到的辅酶I，本发明可以增加酵母细胞的破碎率。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：破碎酵母细胞和提取NAD+；
其中，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.01-0.12mol/l的盐酸中浸泡0.5-2.5h后，加热至85-100℃，保温3-8min，加冰块冷却至室温，离心得到清液A；搅拌12-16h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比(g/ml)为15-25：80-400，酵母细胞和717#树脂的重量比为15-25：45-90；
其中，提取NAD+的具体步骤为：
S1、酸化：向清液B中加入浓度为5-7mol/l的盐酸调节PH为1.95-2.05得到溶液C；
S2、交换：将S1中得到的溶液C以15-20ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸馏水以15-25ml/min的速度洗涤，其中，溶液C与蒸馏水的体积比为1：2-3；
S3、洗脱：调节液面距122#柱上层树脂层4-5cm，用浓度为0.3-0.5mol/l的氨水以5-7ml/min的速度洗脱，当洗脱液pH＝7-8时，开始收集洗脱液D，其中溶液C的体积与氨水的总体积的比为1：2-3；
S4、去盐：向S3中得到的洗脱液D中加入732#树脂，边加边搅拌，至PH为4.95-5.05，过滤得滤液，用蒸馏水洗涤树脂得洗液，合并滤液和洗液得到溶液E；
S5、分离：用氨水调节S4中得到溶液E至pH为6.5-7.5，室温放置7-8天后，以3.5-5ml/min的速度上717#树脂柱，上柱结束后，用40-60ml蒸馏水以5-7ml/min的速度洗涤；
S6、洗脱：取浓度为0.08-0.12mol/l氯化钾溶液50-70ml，以3.5-5ml/min的速度洗脱，收集洗脱液，洗脱液以3.5-5ml/min的速度上769型炭柱，用20-40ml蒸馏水以5-7ml/min的速度洗涤后，用混合溶剂以0.5-1ml/min的速度洗脱NAD+，其中，混合溶剂由醋酸乙酯、丙酮、水和氨水组成；
S7、收集：收集洗脱液，用5.7-6.3mol/l硝酸调节PH至2-3，立即加入以洗脱液体积份为基准的1-4倍的冷丙酮静置30-50min，去上清液，以2000-4000rpm的速度，离心2-5min，去上清液，干燥沉淀得到NAD+，其中冷丙酮的温度为-5至-15℃。
2.根据权利要求1所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，破碎酵母细胞的具体步骤为：将酵母细胞加入浓度为0.06-0.11mol/l的盐酸中浸泡0.7-2h后，加热至90-98℃，保温3-5min，加冰块以10-15℃/min的速度冷却至室温，以4000-6000rpm的速度进行离心10-20min得到清液A；搅拌13-15h，搅拌过程中加入717#树脂，搅拌结束后过滤得到清液B，其中酵母细胞和盐酸重量体积比(g/ml)为18-22：100-300，酵母细胞和717#树脂的重量比为18-22：55-70。
3.根据权利要求1或2所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，S2中，将S1中得到的溶液C以18ml/min的速度上122#柱，上柱结束后，用蒸馏水以20ml/min的速度洗涤，至流出液呈透明淡黄色。
4.根据权利要求1或2所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，S6中，混合溶剂中醋酸乙酯、丙酮、水和氨水的体积比为100：400：500：2。
5.根据权利要求1或2所述氧化型辅酶I的制备方法，其特征在于，S7中，分步收集洗脱液，用丙酮测试洗脱液有无沉淀，合并有沉淀的洗脱液，用5.7-6.3mol/l硝酸调节PH至2-3，立即加入以有沉淀的洗脱液体积份为基准的2-3倍的冷丙酮静置35-45min，去上清液，以2500-3500rpm的速度，离心3-4min，去上清液，干燥得到NAD+，其中冷丙酮的温度为-10至-15℃。
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