CN105078955A

CN105078955A - Terreumol A在制备神经保护药物中的应用

Info

Publication number: CN105078955A
Application number: CN201510557699.6A
Authority: CN
Inventors: 林天样
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-09-05
Filing date: 2015-09-05
Publication date: 2015-11-25

Abstract

本发明公开了Terreumol？A在制备神经保护药物中的应用，属于药物领域。研究发现应用20μmol/LAβ_25-35能有效建立体外培养的大鼠嗜铬瘤细胞株PC12凋亡模型；Terreumol？A能部分对抗Aβ_25-35诱导的PC12凋亡，可以进一步研究开发成制备神经保护的药物。

Description

Terreumol A在制备神经保护药物中的应用

技术领域

本发明涉及化合物TerreumolA的新用途，具体涉及TerreumolA在制备神经保护药物中的应用。

背景技术

XiaYin等人首次分离纯化出化合物TerreumolA，并将成果发表在著名天然产物杂志JournalofNaturalProduct上(HighlyOxygenatedMeroterpenoidsfromFruitingBodiesoftheMushroomTricholomaterreum，J.Nat.Prod.，2013，76，1365-1368)。

目前尚未有该化合物的活性报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种TerreumolA的医药用途。

上述目的是通过如下技术方案实现的：

TerreumolA在制备神经保护药物中的应用，所述TerreumolA化学结构式如下，

附图说明

图1：MTT代谢率检测Aβ_25-35对PC12细胞的毒性作用；

图2：Aβ_25-35对PC12细胞LDH释放率的影响；

图3：Aβ_25-35和/或TerreumolA对PC12细胞LDH释放率的影响。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。

实施例1：TerreumolA的分离制备及结构确证

TerreumolA的制备方法同文献报道的制备方法(HighlyOxygenatedMeroterpenoidsfromFruitingBodiesoftheMushroomTricholomaterreum，J.Nat.Prod.，2013，76，1365-1368)。

结构确证：黄色晶体，分子式为C₂₅H₃₄O₈，不饱和度为8。IR数据显示化合物含有羟基基团(3440cm_- ¹)，化合物在372和291nm有紫外吸收表明其含有共轭结构部分。核磁共振氢谱数据δ_H(ppm，DMSO-d₆，600MHz)：H-2(6.52，s)，H-5(3.44，d，J＝15.1)，H-5(2.77，d，J＝15.1)，H-7(2.85，dd，J＝9.8，3.8)，H-8(2.27，m)，H-8(1.45，m)，H-9(2.33，dd，J＝12.7，7.3)，H-9(1.43，m)，H-11(3.89，m)，H-15(1.33，s)，H-16(1.38，s)，1-OH(11.97，s)，4-OH(7.85，s)，3-OCH₃(3.96，s)；核磁共振碳谱数据δ_C(ppm，DMSO-d₆，600Hz)：159.2(C，1-C)，99.7(CH，2-C)，155.0(C，3-C)，139.7(C，4-C)，29.8(CH₂，5-C)，60.4(C，6-C)，66.1(CH，7-C)，25.5(CH₂，8-C)，34.9(CH₂，9-C)，64.7(C，10-C)，64.4(CH，11-C)，199.6(C，12-C)，115.2(C，13-C)，123.6(C，14-C)，21.5(CH₃，15-C)，16.4(CH₃，16-C)，56.6(CH₃，3-OCH₃)。结构确证数据与文献报道一致，因此可以确定本化合物即为文献报道的TerreumolA。

实施例2：TerreumolA的药理作用试验

一、材料和仪器

Aβ_25-35购于美国sigma公司。TerreumolA自制，HPLC归一化纯度大于98％。MTT(四唑氮蓝)购于美国Amresco公司。LDH测定试剂盒购于南京建成生物有限公司。吖啶橙(AO)购于美国sigma公司。溴化乙啶(EB)购于美国sigma公司。RNase酶购于美国sigma公司。蛋白酶K购于美国sigmaAnnexin公司。Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。D-MEM/F12培养基干粉购于美国GibcoL公司。马血清购于美国hycLon公司。胎牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司。多聚赖氨酸(PLL)购于美国sigma公司。

低温高速离心机(美国Heraeus)，二氧化碳培养箱(美国SHELL/JB)，超净工作台(苏州净化设备厂)，雷勃MK3酶标仪(芬兰Thermolabsystems)，荧光显微镜(德国Leica)，流式细胞仪EpicsXL(美国CouLter公司)，电泳系统(北京六一仪器厂)，雷勃MK3酶标仪(芬兰Thermolabsystems)，荧光显微镜(德国Leica)，流式细胞仪EpicsXL(美国CouLter公司)，电泳系统(北京六一仪器厂)。

二、试验方法

1、细胞培养

PC12细胞生长于含10％马血清、5％胎牛血清的D-MEM/F12培养液(37℃，体积分数为0.05的CO₂，饱和湿度)，常规传代。实验时培养器皿用0.005％PLL溶液(分子量为150，000-300，000)包被，增加PC12细胞对培养器皿黏附力。

2、Aβ_25-35凝聚态处理

Aβ_25-35溶于无菌双蒸水，终浓度为2.0mmol/L，分装，-20℃保存，临用前，37℃孵育4-7d。

3、药物对PC12细胞的处理

对数生长期的PC12细胞按一定的密度分别接种于培养板中，待其生长稳定后，将细胞分组，即对照组，Aβ_25-35诱导凋亡组以及TerreumolA干涉Aβ_25-35诱导凋亡组。其中Aβ_25-35诱导凋亡组，以培养液加入凝聚态的Aβ_25-35储存液，配制一定浓度的工作液，分别加入细胞培养板，每孔再分别加入细胞悬液，CO₂培养箱培养。每小组均设3个平行孔；其次依据20μmol/LAβ_25-35，设定TerreumolA干涉凋亡组，细胞以不同浓度TerreumolA预处理1h，再分别予终浓度20μmol/LAβ_25-35培养。

4、MTT法测定细胞存活率

取对数生长期的细胞以2-5×10⁵/mL的初始浓度分别接种于96孔培养板中每孔160μL，待其生长稳定后，加入不同浓度的Aβ_25-35，细胞对照组只加等量培养液，每组设三个平行孔。培养96小时，每孔加5mg/mL的MTT溶液(PBS配制)20μL，混匀后继续培养4h，弃上清，每孔加DMSO0.2mL，振荡10min，以空白对照孔调零，在490nm波长下测定各孔光密度值。

5、LDH释放量的测定

接种于24孔细胞培养板的细胞，经药物处理48h后，吸出各组上清液备用，各组细胞加入0.1％NP-401mL作用10min，收集上清液备用。按照LDH测定试剂盒说明，分别检测各组上清液和0.1％NP-40的LDH活性，LDH释放率＝OD_上清/(OD_上清+OD_0.1％NP-40)×100％。

6、流式细胞分析细胞凋亡

按AnnexinVFITC试剂盒说明操作：

(1)细胞处理一定时间后，2000rpm/min离心5min，细胞数1～5×10⁵；

(2)用PBS清洗细胞二次，2000rpm离心5min；

(3)加入500μLBindingbuffer悬浮细胞；

(4)加入2μLAnnexinV-FITC混匀后，加入5μLPropidiumIodide(PI)，混匀，室温，避光反应20min；

(5)流式细胞仪(BackmancoulterEpicsXL)检测，激发波长488nm，发射光530nm.，对散点图进行分析。

7、统计分析

结果用均数±标准差表示，两两比较用t检验，P<0.05认为有统计学意义。

三、结果及结论

1、MTT测定Aβ_25-35对PC12细胞活性的影响

从图1可看出，Aβ_25-35处理PC12细胞4d后，MTT法检测显示20，40μmol/LAβ_25-35作用组吸光值(A490)明显降低，差别有统计学意义(P<0.05)。MTT法检测表示线粒体功能，结果说明Aβ_25-35使PC12细胞线粒体功能降低，活细胞数减少，即Aβ_25-35对PC12细胞的活性有抑制作用，并与作用浓度相关。结果见表1及图1。

表1Aβ_25-35对PC12细胞生长的抑制作用

Aβ_25-35(μmol/L)	0	10	20	40
					细胞存活率	100	87.04±4.3％	73.4±3.2％	68.6±3.08％

2、LDH释放量测定

10、20、40μmol/LAβ_25-35作用PC12细胞48h后，通过检测细胞LDH释放率显示细胞的损伤程度，结果表明Aβ_25-35对PC12细胞的毒性作用，并与作用的浓度相关，20、40μmol/LAβ_25-35作用组与对照组比较，差别有统计学意义(图2)。选20μmol/LAβ_25-35作为损伤组，观察TerreumolA的干预作用，作用48h，结果表明，10ng/mLTerreumolA即能降低PC12细胞LDH释放率，但差异不显著；100ng/mL，1000ng/mLTerreumolA组明显降低PC12细胞LDH释放率[图3；标号意义：1、control；2、20μmol/LAβ_25-35；3、20μmol/LAβ_25-35+1.0ng/mLTerreumolA；4、20μmol/LAβ_25-35+10ng/mLTerreumolA；5、20μmol/LAβ_25-35+100ng/mLTerreumolA；6、20μmol/LAβ_25-35+1000ng/mLTerreumolA；其中4、5、6三组与20μmol/LAβ_25-35组比较p<0.05]。

3、AnnexinⅤ-PI染色的流式细胞法检测细胞凋亡

各组PC12细胞经处理后上流式细胞仪，并对散点图进行分析(MuLticycL软件处理)，显示对照组、10μmol/LAβ_25-35、20μmol/LAβ_25-35作用48h后，PC12细胞的凋亡率分别为2.1±0.3％，9.3±0.5％和18.6±3.4％，凋亡率与Aβ_25-35剂量成正相关，与对照组比较差别具有显著性意义，以100ng/mLTerreumolA预先处理，凋亡率降低为11.2±3.7％，差别有统计学意义(表2，与对照组比较，*：P<0.05，**：P<0.01；与20μmol/LAβ_25-35组比较，#：P<0.05)，显示TerreumolA抗Aβ_25-35致凋亡作用。

表2流式细胞术检测PC12细胞凋亡率

组别	细胞凋亡率(％)
		对照组	2.1±0.3％
10μmol/LAβ_25-35	9.3±0.5％*
		20μmol/LAβ_25-35	18.6±3.4％**
20μmol/LAβ_25-35+100ng/mLNGF	11.2±3.7％^#

总结，本研究发现应用20μmol/LAβ_25-35能有效建立体外培养的大鼠嗜铬瘤细胞株PC12凋亡模型；TerreumolA能部分对抗Aβ_25-35诱导的PC12凋亡。

Claims

1.TerreumolA在制备神经保护中的应用，所述TerreumolA化学结构式如下，