CN105566130A

CN105566130A - 一种新的烯胺类化合物及其制备方法和医药用途

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Publication number: CN105566130A
Application number: CN201510957142.1A
Authority: CN
Inventors: 姚天文
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2016-05-11

Abstract

本发明公开了一种新的烯胺类化合物及其制备方法和医药用途，提供了该化合物结构，含其的药物组合物及其制备方法和应用。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的烯胺类化合物，可以从罗勒的干燥叶中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物对肾癌细胞的增殖、迁移、侵袭、死亡都有显著地影响，化合物(Ⅰ)在治疗肾癌方面具有潜在的应用价值，可以用来开发成治疗肾癌的药物。

Description

一种新的烯胺类化合物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及从罗勒的干燥叶中分离得到的一种具有治疗肾癌作用的烯胺类化合物及其制备方法。

背景技术

罗勒为唇形科罗勒属(OcimumbasihcumL.)植物，又名九层塔、毛罗勒、甜罗勒，主要分布于东半球热带地区，我国西南省区多有分布。罗勒的叶、种子、果实在维吾尔民间有着广泛的应用，临床用于治疗心虚，房颤，动脉硬化，高血压，高血脂，头痛，咳嗽，腹泻等。原产非洲、美洲及亚洲热带地区。中国主要分布于新疆，吉林，河北，河南，浙江，江苏，安徽，江西，湖北，湖南，广东，广西，福建，台湾，贵州，云南及四川，多为栽培，南部各省区有逸为野生的。非洲至亚洲温暖地带也有。

罗勒含有挥发油、黄酮、酚酸、脂肪酸等成分。罗勒中挥发油含量最大，主要为不饱和及饱和醇类化合物、烯烃、酮、杂环、烷烃、环烷烃、芳烃、胺类等化合物，按其主要成分不同分为5种化学类型：桂皮酸乙酯，柠檬醛、丁香酚、芳樟醇(Linalool)和百里香酚(Thymol)。

现代药理研究表明罗勒具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗血栓形成、降血脂、降血糖、抗突变、杀虫等药理活性。又具备长期的民间应用和研究基础，有很高的药用、食用及经济价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种从罗勒的干燥叶中分离得到的一种具有治疗肾癌作用的烯胺类化合物及其制备方法。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将罗勒的干燥叶粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。

进一步地，步骤(a)中，用80％乙醇热回流提取，合并提取液。

进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。

所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗肾癌的药物中的应用。

所述的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的应用。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。

该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

附图说明

图1为化合物(Ⅰ)结构式；

图2为化合物(Ⅰ)理论ECD值与实验ECD值比较。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证

试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。

制备方法：(a)罗勒的干燥叶(10kg)粉碎，用80％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(398g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏(163g)；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为85:1(8个柱体积)、45:1(8个柱体积)、25:1(8个柱体积)、12:1(10个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4(49g)用200-300目正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积)、12:1(10个柱体积)和5:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(30g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶ODS-C18分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(143mg)。

结构确证：黄色油状物；HR-ESIMS显示[M+Na]⁺为m/z282.1118，结合核磁特征可得分子式为C₁₅H₁₇NO₃，不饱和度为8。核磁共振氢谱数据δ_H(ppm，DMSO-d₆，600MHz)：H-1(4.42，s)，H-4(5.54，d，J＝0.96)，H-7(1.23，s)，H-8(2.16，d，J＝0.96)，H-9(7.99，d，J＝12.8)，H-10(12.07，d，J＝12.8)，H-2’(7.41，d，J＝8.7)，H-3’(7.35，dd，J＝8.7，7.4)，H-4’(7.10，t，J＝7.4)，H-5’(7.34，dd，J＝8.7，7.4)，H-6’(7.39，d，J＝8.7)；核磁共振碳谱数据δ_C(ppm，DMSO-d₆，150MHz)：68.2(CH，1-C)，82.7(C，2-C)，197.8(C，3-C)，115.2(CH，4-C)，154.4(C，5-C)，124.1(C，6-C)，27.8(CH₃，7-C)，19.7(CH₃，8-C)，145.6(CH，9-C)，138.7(C，1’-C)，117.4(CH，2’-C)，129.1(CH，3’-C)，124.5(CH，4’-C)，129.3(CH，5’-C)，117.4(CH，6’-C)；碳原子标记参见图1。IR光谱表明该化合物含有羰基(1686cm^-1)，羟基(3419cm^-1)和胺基(3252cm^-1)功能团。¹HNMR谱显示两个甲基(δH1.23，s，H-7)和(δH2.16，d，J＝0.96Hz，H-8)，一个含氧次甲基(δH4.42，s，H-1)，两个烯属次甲基[(δH5.54，d，J＝0.96Hz，H-4)和(δH7.99，d，J＝12.8Hz，H-9)]，以及五个芳族质子(δH7.41，d，J＝8.7Hz，H-2’；7.35，dd，J＝8.7，7.4Hz，H-3’；7.10，t，J＝7.4Hz，H-4’；7.34，dd，J＝8.7，7.4Hz，H-5’；7.39，d，J＝8.7Hz，H-6’)。后者质子的低场化学位移及其耦合常数表明该化合物含有仲烯胺(δH12.07，d，J＝12.8Hz，H-10)。¹³CNMR和HSQC谱显示15个碳信号，包括两个甲基，八个次甲基(一个含氧，七个烯属次甲基)，五个季碳(一个含氧，一个酮羰基，三个烯烃季碳)。上述数据，再结合不饱和数，说明该化合物为两环结构。¹H-¹HCOSY谱(DMSO-d₆)显示了三个主要的结构片段：单取代的苯基环，烯胺自旋系统(＝CH-NH-)和下部结构[C(CH₃)＝CH]。HMBC谱中，质子(δH1.23，3H，s)与含氧季碳C-2(δC82.7)和羰基碳C-3(δC197.8)的交叉峰表明C-2位上连有一个甲基和羟基。此外，烯属质子H-4(δH5.54)与C-2，CH₃-8和C-6的相关性验证了这部分结构。HMBC谱中，NH-10与芳族碳C-1’(δC138.7)，C-2’,6’(δC117.3)和季碳C-6(δC124.1)交叉峰表明单取代的苯环和另一环状部分由烯胺功能团连接起来。HMBC谱中H-9与C-1，C-5，C-6和C-1’的相关性验证了上述推论。NOESY谱中H-9与甲基CH₃-8的相关性表明烯胺为Z构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。

实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验

一、材料和仪器

786-0肾癌细胞株、OS-RC-2肾癌细胞株均购自中科院细胞库。化合物(Ⅰ)自制，HPLC归一化纯度大于98％。RPMI-1640培养基、100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素、1×PBS缓冲液、胰酶-EDTA购于美国HyClone。胎牛血清购于美国Gibco。细胞增殖与毒性检测试剂盒(中国)。基质胶购于美国BDBioscience。

HERAcell240i恒温孵箱、GmbHD-37520低温离心机、1510酶标仪为芬兰Thermo公司产品。IMT-2倒置相差显微镜为日本Olympus公司产品。DFC480正置显微镜为德国徕卡公司产品。MDF-U53V-80℃超低温冰箱为日本SANYO公司产品。YDS-50B-80液氮储存罐购自中国成都液氮容器厂。BC-185GE4℃冰箱为中国益友公司产品。Minispinplus小离心机为Eppendorf公司产品。powerpac300电泳仪为美国Biorad公司产品。Las4000mini凝胶成像仪为日本FUJIFILM公司。

二、试验方法

1、细胞培养

(1)常规培养及细胞传代：786-0及OS-RC-2肾癌细胞株均培养在改良型RPMI-1640培养基中，常规培养时加入了10％胎牛血清及1％青霉素和链霉素，构成完全培养基。培养条件为37℃、5％CO₂的恒温培养箱。正常情况下786-0及OS-RC-2细胞均为贴壁生长。每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，一般隔天换液一次。换液时先吸去培养瓶或培养皿中培养基，加PBS洗漆2次后再加入完全培养基。细胞密度达到80-90％且细胞形态仍保持良好时进行传代，传代周期一般为3天。细胞传代步骤如下：1)先弃去培养瓶内培养基，PBS洗2次；2)培养瓶内加1mL胰蛋白酶-EDTA，37℃孵育约3分钟，倒置显微镜下观察细胞变圆并脱落后，加入3mL完全培养基终止消化，并用吸管将成团的细胞吹散；3)细胞悬液移至15mL离心管中，1000转/分离心5分钟，弃去上清，加入完全培养基吹散细胞沉淀，分装到3个培养瓶中，置于37℃、5％CO₂中继续培养。

(2)细胞冻存:细胞处于对数生长期，状态良好并且细胞密度达到80-90％冻存细胞，步骤如下：1)配制细胞冻存液：将改良型RPMI-1640培养基、胎牛血清、DMSO按7:2:1比例混合、震荡混匀；2)消化、离心细胞(具体见细胞传代步骤)；3)离心后吸去上清液，加入冻存液并吹匀，调整细胞计数约l×10⁷mL，移至1.2mL冻存管中。在冻存管标记冻存日期及细胞株信息，用封口膜封口。置于4℃冰箱30分钟，移至-20℃冰箱2小时，再移至-80℃冰箱过夜，次日转入液氮中保存。

(3)细胞复苏：1)水浴锅预热到37℃准备；2)从-80℃冰箱或液氮中取出细胞，迅速放入37℃的水浴锅中并摇动，使其内液体在1-2分钟内融化；3)将融化后的细胞悬液移置15mL离心管中，1000转/分钟离心5分钟，离心后弃去上清并加入完全培养基。4)将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，次日观察细胞状态并换液。

(4)细胞计数：1)细胞消化，吹散制备细胞悬液，方法同细胞传代。用加样器吸取20μL悬液沿盖玻片边缘烧靠外侧滴加，使悬液由于气压影响均匀吸入计数察，健康活细胞呈规则圆形、透明状。计算计数板4个角的4大格内细胞数(格子边线上的细胞只记上边、不计下边；只记左边、不记右边)。细胞密度＝4大格细胞总数×0.25×10⁷mL。

2、细胞增殖曲线绘制

(1)当786-0及OS-RC-2细胞处于对数生长期，密度80-90％时，制备细胞悬液并细胞计数，方法同上。调节细胞悬液浓度为l×10⁵/mL；(2)接种细胞悬液1mL接种于于24孔板上，然后再根据不同条件加药，保证每孔细胞数基本一致。同一种细胞同一种加药条件设计计数6天，每天计数3个孔，即每种条件需设置18个孔；(3)将培养板置于37℃、5％CO₂中培养；(4)从接种次日开始计数，记为第1天(第0天细胞数记为接种细胞数，即1×10⁵)。每孔加200μL胰酶-EDTA，消化、吹散、计数即可。每隔24小时取3个孔进行细胞计数；(5)根据计数所得数据绘制细胞生长曲线。

3、WST-8细胞活力实验

(1)收集对数生长期的786-0及OS-RC-2细胞，制备细胞悬液、细胞计数，方法同上。调节细胞悬液浓度为4×10⁴mL；(2)每孔中加入50μL细胞悬液(即2000个细胞/孔)，然后各逾加入含有设计值2倍浓度药物的完全培养基50μL混勾，这样使药物终浓度恰好为设计值，且保证了各孔细胞数的一致性。每个条件设置5个复孔；(3)将细胞置于5％CO₂、37℃条件下的细胞培养箱中孵育；(4)分别在24小时和48小时后终止培养，吸取孔内培养基，更换新鲜完全培养基，每孔加入10μLWST-8溶液，用加了新鲜完全培养基和WST-1溶液但没有接种细胞的孔作为空白对照；(5)避光条件下置于摇床5分钟摇勾，后继续放入37℃、5％CO₂条件下培养箱中培养1小时；(6)酶标仪下测定450nm吸光度值；(7)细胞活性抑制率＝(对照组吸光度值-实验组吸光度值)/(对照组吸光度值/空白组吸光度值)×100％。

4、划痕细胞迁移实验

(1)准备无菌6孔细胞培养板，marker笔在6孔板背面每隔1cm划一道标线；(2)取对数生长期细胞，PBS液洗漆2次，0.25％胰蛋白酶消化、吹散，将细胞悬液离心，更换完全培养基重悬。接种于标记好的6孔培养板中培养，每孔加5×10⁵细胞；(3)37℃、5CO₂培养，待倒置相差显微镜下观察各孔细胞密度约达到90％时吸取完全培养基，换用无血清培养基培养24小时，以消除由于血清引起的增殖对迁移作用的干扰；(6)无血清培养到指定时间后用高压消毒的200μL枪头垂直6孔板上的标记线划痕。划痕与孔板上mark笔上的横线交叉点即为观察的固定点。(7)PBS清洗2次洗去划下的细胞。更换新鲜的无血清培养基，按照实验条件在各组培养基中加入相应浓度的药物，同时设立对照组，置37℃、5CO₂孵箱中培养；(6)每个孔取8个固定点观察划痕后12h、18h的细胞迁移情况并照相，使用ImageJ图像分析软件测定每张图片划痕区的面积；(8)迁移率＝(观察时间固定点划痕面积-起始时间固定点划痕面积)/起始时间固定点划痕面积×100％。迁移抑制率＝(实验组迁移率-对照组迁移率)/实验组迁移率×100％。

5、Transwell细胞侵袭实验

(1)取培养在完全培养基中的对数生长期786-0和OS-RC-2肾癌细胞株，PBS洗漆2次，换用无血清的RPMI-1640培养基培养12小时，以减少细胞增殖对侵袭实验的影响；(2)准备Transwell小室。小室可搭置于24孔细胞培养板上，底面为直径6.5mm、孔径5μm的膜。取40μL以1:5稀释的1mg/mL基质胶铺在上室，并放入4℃过夜风干，该操作需在冰上完成，因基质胶在室温下易迅速凝固；(3)786-0和OS-RC-2肾癌细胞株经无血清RPMI-1640培养基培养到12小时后，胰酶-EDTA消化、离心后吸去上清，加入无血清的RPMI-1640培养基重悬，细胞计数调整细胞浓度至1×10⁶/mL；(4)将准备好的带有Transwell小室的24孔板取出，下室(即24孔板的孔)中加入500μL含有10％胎牛血清的完全培养基，以提供对细胞的趋化作用。将上室搭在孔上，此时可见上室底面的膜刚好浸在了下室中的培养基里。观察下室的培养基与上室底面的膜之间没有气泡即可；(5)取50μL细胞悬液加在各个孔的上室，再加入含有不同浓度药物的无血清RPMI-1640培养基50μL，使各个孔上室药物的浓度达到实验设计浓度。观察各孔中没有气泡；(6)将细胞放入37℃、5CO₂的恒温培养箱中培养12小时，取出上室。用棉棒轻柔擦拭小室膜的上面，将没有穿过膜的细胞擦掉；(7)将小室用PBS轻柔冲洗，洗去表面的培养基；(8)将小室放入95％乙醇中固定10分；(9)用PBS轻柔冲洗小室表面的固定液，再将小室放入苏木素中染色5分钟；(10)小室放入1％盐酸酒精中分化，自来水冲洗返蓝5分钟；(11)将小室放入伊红中染色5分钟，然后自来水冲洗；(12)小室依次放入75％乙醇1分钟、85％乙醇1中分钟、95％乙醇1中分钟、100％乙醇4分钟；(13)将小室风干，用刀片小心沿边缘切下小室底面的膜。膜底面朝上放在盖玻片上，中性树胶封片；(14)在正置显微镜下观察，每张片在200×下取8个随机视野，数出每个视野中穿过的细胞数，进行统计分析，进行统计学分析。

6、统计分析

应用SPSS20.0(IBMInc，USA)软件处理数据，所有数据用表示。多组间差异比较采用单因素方差分析，两两间比较采用Dunnett-t检验，两组间比较差异采用student-t检验。检验水准a＝0.05。

三、结果及结论

1、化合物(Ⅰ)对肾癌细胞株786-0和OS-RC-2增殖能力的影响

生长曲线显示加入不同浓度的化合物(Ⅰ)后，两种肾癌细胞株的增殖都受到了明显的抑制。0.1mg/mL化合物(Ⅰ)作用于786-0细胞24小时即出现显著的抑制生长作用(P<0.035)。随着培养时间的延长，0.1mg/mL化合物(Ⅰ)及0.25mg/mL化合物(Ⅰ)对细胞增殖保持明显的抑制作用，而0.5mg/mL化合物(Ⅰ)使786-0细胞的增殖停滞。化合物(Ⅰ)对OS-RC-2细胞的增殖同样有抑制作用，在培养第3天0.1mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL表现出对OS-RC-2细胞的显著抑制(P分别为0.026、0.004、0.002)。绘制的生长曲线显示化合物(Ⅰ)对786-0细胞株的增殖抑制作用较对OS-RC-2细胞的增殖抑制作用更为明显。生长曲线周期中每天的细胞增殖情况见表1(注：*在相应作用时间与对照组相比有统计学差异(p<0.05))。

WST-8细胞活力实验结果显示，化合物(Ⅰ)对肾癌细胞株786-0细胞及OS-RC-2细胞活力均有明显的抑制作用，化合物(Ⅰ)0.1mg/mL即在24小时对786-0及OS-RC-2细胞的活力有显著的抑制作用，且与对照组比较差异有统计学意义。药物在24小时对两种细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为3.5mg/mL和16.45mg/mL，在48小时分别为为0.165mg/mL和1.762mg/mL。对两种细胞的活性抑制作用见表2(注：*在相应作用时间与对照组相比有统计学差异(p<0.05))。

2、化合物(Ⅰ)抑制肾癌细胞株迁移和侵袭能力

细胞划痕迁移实验结果显示，化合物(Ⅰ)对肾癌细胞株786-0和OS-RC-2的迁移能力有抑制作用，化合物(Ⅰ)0.25mg/mL组在6h、12h、18h对786-0迁移的抑制率为10.95％、21.96％和43.02％，12h和18h的差异有统计学意义(P值分别为0.004和0.000)；对OS-RC-2的抑制率为3.81％、19.67％、28.44％，12h和18h的差异有统计学意义(P值分别为0.009和0.000)。化合物(Ⅰ)0.5mg/mL组在6h、12h、18h对786-0的抑制率为76.82％、81.18％、和82.62％，差异均有统计学意义(P值分别为0.001、0.000和0.000)；对OS-RC-2细胞的抑制率为22.01％、52.95％、和61.50％，12小时和18小时的差异均有统计学意义(P值分别为0.000和0.000)。各组在对应时间的迁移率如表3。

Transwell细胞侵袭实验结果显示，经过12小时后，786-0细胞株加药组(0.25mg/mL化合物(Ⅰ))和对照组每个200×视野穿过的细胞数分别为262.38±22.13和74.75±10.50，差异有统计学意义(P＝0.000)；OS-RC-2细胞株则分别为102.75±8.75、65.13±9.66，且差异有统计学意义(P＝0.000)。

结论，本研究结果表明一定浓度的化合物(Ⅰ)对肾癌细胞的增殖、迁移、侵袭、死亡都有显著地影响，且在这些实验中对786-0细胞系的作用明显比对OS-RC-2细胞系更为明显。表明这种药物也有可能通过这一机制对控制肾癌的进展和转移发挥一定的作用。

表1化合物(Ⅰ)对肾癌细胞株786-0和OS-RC-2增殖能力的影响

表2化合物(Ⅰ)对肾癌细胞株786-0和OS-RC-2抑制率的影响

表3化合物(Ⅰ)对肾癌细胞株迁移和侵袭能力的影响

实施例3

片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例4

口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。

实施例5

胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

实施例6

注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例7

无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims

1.具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

2.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将罗勒的干燥叶粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。

3.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用80％乙醇热回流提取，合并提取液。

4.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

5.一种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。

6.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗肾癌的药物中的应用。

7.权利要求5所述的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的应用。