CN105287500A

CN105287500A - Chenopodolin在制备治疗卵巢癌药物中的应用

Info

Publication number: CN105287500A
Application number: CN201510735816.3A
Authority: CN
Inventors: 吴正锋
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-11-03
Filing date: 2015-11-03
Publication date: 2016-02-03

Abstract

本发明公开了Chenopodolin在制备治疗卵巢癌药物中的应用，属于药物领域。体外试验证明，Chenopodolin可抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖活力，MTT结果显示，Chenopodolin影响细胞周期的分布，将肿瘤细胞阻滞在G₀/G₁期，同时可通过与EGFR/HER2受体的酪氨酸激酶磷酸化ATP结合位点结合，抑制其磷酸化，进而下调HER2、P-HER2蛋白的表达来诱导细胞凋亡。Chenopodolin可以进一步研究开发成制备治疗卵巢癌的药物。

Description

Chenopodolin在制备治疗卵巢癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及化合物Chenopodolin的新用途，具体涉及Chenopodolin在制备治疗卵巢癌药物中的应用。

背景技术

AlessioCimmino等人首次分离纯化出化合物Chenopodolin，并将成果发表在著名天然产物杂志JournalofNaturalProduct上(Chenopodolin:APhytotoxicUnrearrangedent-PimaradieneDiterpeneProducedbyPhomachenopodicola,aFungalPathogenforChenopodiumalbumBiocontrol，J.Nat.Prod.，2013，76，1291-1297)。研究表明该化合物具有植物毒性，但是没有表现出任何抗菌或抗真菌活性。

目前尚未有该化合物关于卵巢癌的活性报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Chenopodolin的医药用途。

上述目的是通过如下技术方案实现的：

Chenopodolin在制备治疗卵巢癌药物中的应用，所述Chenopodolin化学结构式如下，

进一步地，所述卵巢癌为SKOV3卵巢癌。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。

实施例1：Chenopodolin的分离制备及结构确证

Chenopodolin的制备方法同文献报道的制备方法(Chenopodolin:APhytotoxicUnrearrangedent-PimaradieneDiterpeneProducedbyPhomachenopodicola,aFungalPathogenforChenopodiumalbumBiocontrol，J.Nat.Prod.，2013，76，1291-1297)。

结构确证：分子式为C₂₄H₃₀O₈，不饱和度为10。核磁共振氢谱数据δ_H(ppm，DMSO-d₆，600MHz)：H-1(5.00，d，J＝4.8)，H-2(4.62，br，d，J＝4.8)，H-3(4.28，br，s)，H-5(2.74，s)，H-7(5.85，s)，H-9(2.85，m)，H-11(1.50，m)，H-12(4.56，dd，J＝10.0，4.1)，H-14(2.62，d，J＝16.2)，H-14(2.26，d，J＝16.2)，H-15(5.79，dd，J＝17.8，11.0)，H-16(5.17，d，J＝11.0)，H-16(4.97，d，J＝17.8)，H-17(1.06，s)，H-19(1.48，s)，H-20(1.08，s)，1-COMe(2.24，s)，12-COMe(2.12，s)；核磁共振碳谱数据δ_C(ppm，DMSO-d₆，600Hz)：71.8(CH，1-C)，79.3(CH，2-C)，76.8(CH，3-C)，47.5(C，4-C)，57.3(CH，5-C)，194.9(C，6-C)，126.2(CH，7-C)，156.2(C，8-C)，46.2(CH，9-C)，41.8(C，10-C)，12.6(CH₂，11-C)，77.5(CH，12-C)，40.5(C，13-C)，42.9(CH₂，14-C)，140.2(CH，15-C)，115.6(CH₂，16-C)，21.7(CH₃，17-C)，174.6(C，18-C)，17.4(CH₃，19-C)，20.5(CH₃，20-C)，170.8(C，1-COMe)，25.8(CH₃，1-COMe)，169.9(C，12-COMe)，26.1(CH₃，12-COMe)。结构确证数据与文献报道一致，因此可以确定本发明制备的化合物即为文献报道的Chenopodolin。

实施例2：Chenopodolin的药理作用试验

一、材料和仪器

人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3由兰州大学的医学实验中心提供。通用RPMI-1640培养基(10％胎牛血清)培养。Chenopodolin自制，HPLC归一化纯度大于98％。RPMI-1640培养液、四甲基偶氮挫蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、L-谷氨酰胺科昊生物工程有限公司。胰蛋白酶购于美国Sigma公司。胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司。十二院基磺酸钠(SDS)购于西安周鼎生物技术有限责任公司。HER2(FITC标记)购于北京博奥森生物技术有限公司。酸化HER2(FITC标记)购于北京博奥森生物技术有限公司。青霉素、链霉素购于华北制药厂。

CO₂培养箱(Heraeus，BB5060UV)，德国倒置相差显微镜(OLYMPUS，CK-40)，日本荧光显微镜(OLYMPUSOPTICAL，A×80，日本)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，酶标分析仪(BIO-TEK公司，美国)，低温高速离心机(Beckman-Coulter公司，德国)，Epics×L流式细胞仪(Beckman-Coulter公司，德国)，R-3850型自动台式灭火器(山东新华医疗器械股份有限公司)，DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱(上海-恒科技有限公司)，KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，数显恒温水浴箱(上海梅香仪器有限公司)，BS400S电子分子天平(北京赛多利斯天平有限公司)，08-2恒温磁力搅拌器(上海天平仪器厂)，TDL-5普通离心机(上海安亭科学仪器厂)，低温冰箱(日本三洋公司)，电子制冰箱(日本三洋公司)，细胞冻存管(上海生工生物工程有限公司)，96孔板(科昊生物工程有限公司)。

二、试验方法

1、细胞培养

1.1细胞复苏

将冻存管迅速从液氮中取出后立即放入37℃温水中，轻轻晃动冻存管，使冻存物尽快溶解，将其放入超净工作台中，将其内的细胞悬液移入离心管，再向离心管中加入10倍RPMI-1640培养液(含10％小牛血清)，离心，800rpm/min，离心5～10min，弃上清，细胞沉淀中加入含10％小牛血清的RPMI-1640培养液，轻摇均匀，置37℃、5％CO₂浓度的培养箱中培养。并注明细胞名称及日期。

1.2细胞传代培养

待SKOV3细胞长至80～90％培养瓶时，弃去原有的培养液，并用配好的PBS洗两遍；用0.25％的胰酶消化，放在倒置显微镜下观察，当见细胞回缩、细胞间隙增大、形态变圆时弃去消化液，加入一定量的培养液中和胰酶消化液，并用吸管轻轻吹打已经消化过的细胞.，使其脱离培养瓶，800rpm/min离心5min，弃上清；显微镜下在计数板上进行细胞计数，按1:3比例传代，分装至培养瓶中，再次补充适量培养液后继续培养。注意严格无菌操作，每天观察细胞生长情况。

1.3细胞冻存

取对数生长期的细胞以0.25％的胰蛋白酶消化后离心，PBS洗2次，在低速离心机上l000rpm离心5min，弃上清液，加入1mL于-20℃下预冷的含DMSO的细胞冻存液，用吸管吹打均匀后移入冻存管中，用封口膜封口标记后放入4℃静置30min，之后-20℃放置2h后转入-80℃。一个月内使用的细胞可保存于-80℃中，长期保存者24h后应由-80℃移入液氮中。细胞的复苏与冻存应遵循的原则为慢冻快融。

2、四甲基偶氮蓝(MTT)实验

(1)选择对数生长期的细胞(生长80-90％)时，用配好的0.25％胰酶将细胞消。化好以后，轻轻地吹打制成单细胞悬液，调整的最终的细胞浓度为8×10⁴/mL；(2)取3个96孔板，每个时间点1板，100μL/孔，每孔细胞数为10⁴做好分组标志；(3)细胞贴壁后分组，设空白组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶剂)及实验组(加不同浓度的Chenopodolin，其终浓度分别为0.1、1、10、20、30和60μmol/L)，每组设6个复孔；(4)37℃、5％CO₂条件下分别培养24、48和72h；(5)时间到后，吸去上清液后每孔加5g/L的MTT10μL；(6)培养4h后加入10μLDMSO，在多功能微板测试系统上以490nm波长测定各孔光密度OD值；(7)药物对细胞抑制率的计算：

抑制率(％)＝(对照组细胞数-实验组细胞数)/对照组细胞数×100％。

实验至少重复三次。

3、PI染色法流式细胞术(FCM)检测细胞周期及凋亡

(1)取对数生长期的SKOV3细胞，先用配好的胰酶消化后轻轻吹打制成单细胞悬液，调整细胞浓度为6×10⁵/mL；(2)以6×10⁵/mL的密度接种于50mL的培养瓶中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h；(3)24h后将原来的培养液吸出，加入同等量(7.5mL)的、含不同浓度(0、10、20和30μmol/L)的Chenopodolin的培养液，继续于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h；(4)48h后收集细胞，用0.25％胰酶消化后轻轻吹打制成单细胞悬液，将其移入离心管后，以1000r/min离心，离心l0min，弃去上清液，并用4℃的70％的冰乙醇固定，放置4℃的冰箱过夜；(5)次日用磷酸盐缓冲液PBS清洗、离心，弃上清后检测加入核糖核酸酶(RNAase)150μL和碘化丙啶(PI)染液150μL，在室温条件下避光染色30min，运用流式细胞仪检测细胞的周期分布及凋亡情况。实验重复三次，并应用软件进行分析。

4、PI染色法流式细胞术(FCM)检测HER2、P-HER2蛋白的表达率

(1)取对数生长期的SKOV3细胞，先用0.25％胰酶消化后轻轻吹打制成单细胞悬液，调整细胞浓度为l×10⁶/mL；(2)以l×10⁶/mL的密度接种于50mL的培养瓶中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h；(3)24h后吸出原有的培养液，加入同等量(12.5mL)的、含浓度为20μmol/L的Chenopodolin的培养液(实验组)和不含药物的培养液(对照组)，继续于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h；(4)48h后收集细胞，将培养瓶内的培养液先移入离心管内，再用0.25％的胰蛋白酶消化，保证培养瓶内的细胞及营养液都移入离心管，按1000r/min离心，l0min；(5)再加入PBS按1000转/min离心10min，重复两次；(6)待测管内有100μL样品，向实验组和对照组分别加入30μLFITC标记的HER2、P-HER2抗体受体(用PH＝7.4、0.01M的PBS溶解，并按1:60稀释)，4℃孵育30min；(7)加入细胞洗液，1200转/min，10min低温离心，反复2次，去除上清后送检；(8)流式细胞仪检测SKOV3细胞的HER2、P-HER2蛋白的表达率。上述实验步骤重复三次。

5、数据分析

采用SPSS17.0的软件进行统计学的分析，以均数±标准差(X±s)来表示。采用单因素方差分析对计量资料进行比较，而组间两两比较采用LSD检验，率的比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

三、结果及结论

1、MTT实验结果

不同浓度的Chenopodolin作用于人卵巢腺癌SKOV3细胞24、48和72h后均出现明显的细胞增殖抑制作用，表现为OD值(吸光度值A570)降低，抑制率升高；不同浓度组之间的结果有差异，且差异有统计学意义(P<0.05)，不同的作用时间也有统计学差异(P<0.05)，表明Chenopodolin对卵巢癌SKOV3细胞的增殖具有抑制作用，且其抑制率呈浓度和时间依赖性。由实验结果得知，浓度为20μmol/L时效果比较理想。结果见表1。

2、PI染色法流式细胞术(FCM)检测细胞周期的结果

选取不同浓度(10、20、30μmol/L)的Chenopodolin作用于SKOV348h，实验组较对照组相比G₀/G₁的细胞数量呈增多趋势，而S期和G₂/M细胞数量呈减少趋势，以Chenopodolin浓度为20μmol/L时效果最明显。与对照组相比，各实验组都有统计学意义(P<0.05)。各实验组作用48h后G₀/G₁的细胞数量分别为10μmol/L且(60.707±2.382)、20μmol/L组(69.611±2.366)、30μmol/L(61.099±1.577)，经分析得知30μmol/L组与10μmol/L相比，差异无统计学意义(P＝0.809)，其余各浓度组之间相比差异均有统计学意义(P<0.05)。各实验组作用48h后S期的细胞数量分别为l0μmol/L组(24.254±3.244)、20μmol/L组(19.468±0.580)、30μmol/L(17.743±1.311)，其中30μmol/L组与20μmol/L组相比，差异无统计学意义(P＝0.305)，其余各浓度组相比差异有统计学意义(P<0.05)。各实验组作用48h后G₂/M期的细胞数量分别为l0μmol/L组(13.276±0.658)、20μmol/L组(10.624±0.483)、30μmol/L(21.147±2.865)，其余的各浓度组之间相比差异有统计学意义(P<0.05)。由此可知20μmol/L的Chenopodolin作用于SKOV348h的效果是最好的，将细胞周期阻滞于G₀/G₁期，使其不能进入S期。结果见表2(注：与对照组相比，均P<0.05；*G₀/G₁期时30μmol/L组与10μmol/L组相比，差异无统计学意义(P＝0.809)，S期时30μmol/L与20μmol/L相比，差异无统计学意义(P＝0.305)；其余G₀/G₁、S、G₂/M各期组间相比，均P<0.05。)。

3、PI染色法流式细胞术(FCM)检测HER2、P-HER2的表达

流式细胞仪检测SKOV3细胞在应用Chenopodolin前后其表面的HER2及P-HER2的表达情况，从上述实验结果得知20μmol/L的Chenopodolin作用效果较为理想，因此本步骤采用Chenopodolin(20μmol/L)作用于SKOV3细胞48h，结果显示应用Chenopodolin前后HER2蛋白表达的变化不明显(P＝0.13)，而P-HER2蛋白的表达有明显不同(P<0.05)。结果见表3(注：与对照组相比，*P＝0.13，^#P<0.05)。

结论，Chenopodolin可抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖活力，本实验MTT的结果已经显示，它影响细胞周期的分布，将肿瘤细胞阻滞在G₀/G₁期，同时可通过与EGFR/HER2受体的酪氨酸激酶磷酸化ATP结合位点结合，抑制其磷酸化，进而下调HER2、P-HER2蛋白的表达来诱导细胞凋亡。

表1不同浓度、不同作用时间的Chenopodolin对SKOV3细胞的影响

表2不同浓度的Chenopodolin作用于SKOV3细胞48h对细胞周期分布的影响

表320μmol/L的Chenopodolin作用于SKOV3细胞48h后HER2、P-HER2的表达

Claims

1.Chenopodolin在制备治疗卵巢癌药物中的应用，所述Chenopodolin化学结构式如下，

2.根据权利要求1所述的Chenopodolin在制备治疗卵巢癌药物中的应用，其特征在于：所述卵巢癌为SKOV3卵巢癌。