CN105481802A

CN105481802A - 一种克罗烷型二萜类化合物及其制备方法和医药用途

Info

Publication number: CN105481802A
Application number: CN201511018199.1A
Authority: CN
Inventors: 吴金凤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-12-29
Filing date: 2015-12-29
Publication date: 2016-04-13

Abstract

本发明公开了一种克罗烷型二萜类化合物及其制备方法和医药用途。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的克罗烷型二萜类化合物，可以从干燥的祖师麻中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物可使乳腺癌细胞增殖活性降低，显著抑制其增殖，显示出较强的体外细胞毒性，具有体外抗乳腺癌效应，可以用来开发成治疗乳腺癌的药物。

Description

一种克罗烷型二萜类化合物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及从干燥的祖师麻中分离得到的一种具有治疗乳腺癌作用的克罗烷型二萜类化合物及其制备方法。

背景技术

祖师麻为瑞香科(Thymelaeaceae)植物黄瑞香(DaphnegiraldiiNitsche)、凹叶瑞香(D.retusaHemsl)、陕甘瑞香(又名唐古特瑞香)(D.tanguticaMaxim)的根皮及茎皮，其性温、味辛苦，具有祛风湿，活血止痛之功效。秋季采收，除去细根，剥取根皮和茎皮而后晒干而成。别名：狗皮柳、祖丝麻等。主要分布在山西、陕西、四川、青海、甘肃等地。祖师麻主要用于治疗散瘀止痛、祛风通络、胃痛、头痛、四肢麻木、风湿痹痛、跌打损伤、关节炎、类风湿性关节痛等。该药在土耳其民间治疗类风湿性关节炎和腰腿疼痛等症效果颇佳。

祖师麻的化学成分研究始于二十世纪七十年代，王明时等首次从祖师麻中分离得到了香豆素类化合物，随后对祖师麻的化学成分研究就逐渐开展起来。现有研究表明祖师麻中除了含有主要活性成分香豆素类化合物以外，还含有黄酮类、木脂素类、二萜类等多种化合物。

祖师麻在临床上主要用于抗炎、镇痛以及抗疟疾等方面。近年来通过进一步的研究发现祖师麻在抗肿瘤以及治疗肾小球肾炎等方面也有着显著的功效。现市售的成药主要包括祖师麻片、祖师麻风湿膏、祖师麻关节止痛膏、祖师麻胶囊、祖师麻缓释微丸、祖师麻注射液等。

发明内容

本发明的目的是提供一种从干燥的祖师麻中分离得到的一种具有治疗乳腺癌作用的克罗烷型二萜类化合物及其制备方法。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)干燥的祖师麻粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱12个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。

进一步地，步骤(a)中，用80％乙醇热回流提取，合并提取液。

进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

一种药物组合物，该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。

所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

所述的药物组合物在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。

该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

附图说明

图1为化合物(Ⅰ)结构式；

图2为化合物(Ⅰ)理论ECD值与实验ECD值比较；

图3为不同剂量化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞增殖活力的影响；

图4为不同剂量化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞凋亡的影响。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证

试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。

祖师麻经鉴定为瑞香科(Thymelaeaceae)植物陕甘瑞香(又名唐古特瑞香)(D.tanguticaMaxim)的干燥根皮及茎皮。

制备方法：(a)将干燥的祖师麻(8kg)粉碎，用80％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(363g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱12个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏(145g)；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(8个柱体积)、50:1(8个柱体积)、30:1(6个柱体积)、15:1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4(47g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积)、15:1(10个柱体积)和5:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(26g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(39mg)。

结构确证：HR-ESIMS显示[M+Na]⁺为m/z397.1322，结合核磁特征可得分子式为C₂₀H₂₂O₇，不饱和度为10。核磁共振氢谱数据δ_H(ppm，DMSO-d₆，500MHz)：H-1(5.41，t，J＝3.0)，H-2(3.14，m)，H-2(3.01，m)，H-4(2.68，t，J＝3.0)，H-6(4.61，d，J＝9.6)，H-7(2.83，dd，J＝17.4，9.6)，H-7(2.64，d，J＝17.4)，H-9(2.65，m)，H-11(2.56，m)，H-11(2.31，m)，H-12(5.47，t，J＝6.0)，H-14(6.28，br，s)，H-15(7.34，br，s)，H-16(7.35，br，s)，H-17(2.18，s)，H-18(5.75，m)，H-19(1.11，s)，18-OH(4.52，s)；核磁共振碳谱数据δ_C(ppm，DMSO-d₆，125MHz)：121.9(CH，1-C)，30.1(CH₂，2-C)，202.1(C，3-C)，62.7(CH，4-C)，42.4(C，5-C)，77.7(CH，6-C)，42.0(CH₂，7-C)，203.5(C，8-C)，45.6(CH，9-C)，138.6(C，10-C)，33.2(CH₂，11-C)，71.6(CH，12-C)，123.2(C，13-C)，107.4(CH，14-C)，143.4(CH，15-C)，138.8(CH，16-C)，29.9(CH₃，17-C)，90.4(CH，18-C)，22.1(CH₃，19-C)，176.3(C，20-C)；碳原子标记参见图1。NMR数据表明，该化合物含有两个甲基[δH2.18(s，H₃-17)和1.11(s，H₃-19)]，三个含氧次甲基[δH4.61(d，J＝9.6Hz，H-6)，5.47(t，J＝6.0Hz，H-12)和5.75(m，H-18)；δC77.7(C-6)，71.6(C-12)和90.4(C-18)]，三取代双键[δH5.41(t，J＝3.0Hz，H-1)；δC121.9(C-1)和138.6(C-10)〕，一个β单取代呋喃环[δH6.28(br，s，H-14)，7.34(br，s，H-15)，7.35(br，s，H-16)；δC123.2(C-13)，107.4(C-14)，143.4(C-15)和138.8(C-16)]，酮羰基[δC202.1(C-3)，203.5(C-8)]以及内酯羰基[δC176.3(C-20)]。HMBC谱中，H₂-11和H-12与C-20的相关性表明C-10位连有一个γ内酯。根据HMBC谱中H-12与C-13，C-14和C-16的相关性，可推断呋喃环位于C-12位上。此外，H₃-17与C-8和C-7的相关性证实C-6位置上存在一个丙-2-酮基。上述数据表明该化合物为C-8和C-9开环的克罗烷型二萜化合物。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。

实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验

一、材料和仪器

DMEM/F12高糖培养液购于北京Hyclone公司。改良型RPMI-l640培养基购于北京Hyclone公司。标准胎牛血清购于天津TBD公司。CCK-8细胞活力检测试剂购于日本株式会社同仁化学研究所。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于上海炎彬化工科技有限公司。JC-1线粒体膜电位探针购于江苏碧云天生物技术研究所。二甲基亚矾(DMSO)和磷酸盐缓冲溶液(PBS)购于Sigma公司产品。化合物(Ⅰ)自制，制备方法见实施例1，HPLC归一化纯度大于98％。

-70℃低温冰箱(FormaScientificInc.公司，美国)，电子天平(岛津AEL-200型，日本)，超净工作台(SW-CJ-IC型，苏州)，恒温振荡器(THZ-C型)，高压蒸汽消毒锅(YX-400B型)，CO₂细胞培养箱(FormaSeriesⅡ，Thermalelectroncorp.，美国)，恒温水浴锅(BHW2-I型，国产)，倒置相差显微镜(CK40型，Olympus，日本)，显微镜(BX51型，Olympus，日本)，显微数码采集系统(DP71型，Olympus，日本)，多功能酶标仪(InfiniteM200型，TECAN，瑞士)，台式室温高速离心机(TGL-16G型，北京)，台式低温高速离心机(2K15型，sigma公司，美国)，BL60电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，LD4-40大容量离心机(北京京立离心机有限公司)，2K15高温低速冷冻离心机(sigma公司)，UV765紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，激光共聚焦扫描显微镜(MRC-1024型，Bio-Rad，英国)。

二、试验方法

1、细胞株及培养

选用乳腺癌MCF-7细胞(雌激素受体阳性ER⁺，人类表皮生长因子受体-2阴性HERZ/neu^-)、乳腺癌MDA-MB-231细胞(ER^-，HERZ/neu^-)和乳腺癌MDA-MB-453(ER^-，HERZ/neu⁺)细胞株，三种细胞株均来自于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞培养于含10％标准胎牛血清的DMEM/F12高糖培养液中，MDA-MB-453细胞培养于含10％标准胎牛血清的RPMI-1640培养液中，以上细胞均于37℃、5％CO₂条件下常规培养传代。三种乳腺癌细胞均为贴壁细胞，贴壁细胞的传代：待细胞贴壁生长2～3d至80％融合时，弃去旧培养液，用适量的0.1mol/LPBS(pH7.4)漂洗细胞2次后向瓶内加入适量0.25％的胰酶(pH7.4)的0.1mol/LPBS配制，过滤除菌。消化，以刚好盖住细胞培养瓶底部为宜，光镜下观察，待细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入新鲜的培养液终止消化，并用吸管轻轻反复吹打，使细胞脱离瓶底形成细胞悬液；调整细胞浓度，吸取适量细胞悬液加入新培养瓶中，加入6mL新鲜培养基，显微镜下观察，放置于细胞培养箱。

2、细胞增殖活力检测

利用CCK-8法检测化合物(Ⅰ)对三种乳腺癌细胞增殖活力的影响。CCK-8试剂盒(CellCountingKit-8)是由日本同仁化学研究所开发的检测细胞增殖的试剂盒，CCK-8试剂中含有WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-MethoxyPMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶标仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

具体操作为：将对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453常规传代，细胞计数，以2.5×10⁵/mL细胞浓度接种于96孔细胞培养板内，每孔200μL，培养过夜，待细胞贴壁且生长良好。实验分5组，每组作6个平行孔，分别加入不同量的化合物(Ⅰ)，使其终浓度分别为200、150、100、50mg/mL，对照组加等量蒸馏水，培养24h，弃掉培养液，以PBS洗3次，加入新鲜培养液每孔200μL，然后每孔加入10μLCCK-8，培养4h收获细胞，以酶标仪检测450nm处光密度值[D(450)]，以蒸馏水空白调零，计算不同浓度化合物(Ⅰ)作用的增殖抑制率。

细胞增殖抑制率＝[对照D(450)一实验组D(450)]/对照D(450)×100％

3、细胞凋亡的检测

利用AnnexinV/PI双染流式细胞分析技术检测化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453凋亡的影响。实验严格按照AnnexinV凋亡检测试剂盒操作说明进行。具体操作为：将对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453常规传代，细胞计数，以10⁵/mL细胞浓度接种于6孔细胞培养板内，每孔5mL，培养过夜，待细胞贴壁且生长良好。实验分5组，每组作3个平行孔，分别加入不同剂量的化合物(Ⅰ)，使其终浓度分别为150、100、50mg/mL，对照组加等量蒸馏水，培养24h，弃掉培养液，用4℃预冷的PBS(pH7.2)洗细胞3次，常规胰酶消化，制作单细胞悬液，离心，用250μL稀释的binding缓冲液重新悬浮细胞，并使其浓度为1×10⁶/mL，取100μL的细胞悬液于5mL流式管中，加5μLAnnexinV/FITC溶液，静置5min，加入20μg/mL的PI溶液10μL，混匀后于室温避光放置10min，在反应管中加400μLPBS，利用流式细胞仪上机检测各组荧光状况。细胞根据AnnexinV和PI染色情况分别分至4个相，AnnexinV和PI染色均阴性细胞为正常存活细胞，PI染色阳性、AnnexinV染色阴性为机械损伤或破裂细胞，AnnexinV和PI染色均阳性为坏死或晚期凋亡细胞，AnnexinV染色阳性、PI染色阴性判定为早期凋亡细胞。

4、细胞线粒体膜电位的检测

利用细胞线粒体膜电位分子探针JC-1和激光共聚焦扫描显微镜检测化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞MBA-MD-453线粒体膜电位的影响。具体操作为：将对数生长期的乳腺癌细胞MDA-MB-453常规传代，细胞计数，以10⁵/mL细胞浓度接种于6孔细胞培养板内，每孔5mL，培养过夜，待细胞贴壁且生长良好实验分5组，每组作3个平行孔，分别加入不同剂量的化合物(Ⅰ)，使其终浓度分别为150、100、50mg/mL，对照组加等量蒸馏水，培养24h，弃掉培养液，用4℃预冷的PBS(pH7.2)洗细胞3次，加入1.0mLPBS，加入10μL2.5mmol/L的JC-l，使其终浓度为25μmol/L，在37℃、5％CO₂培养箱内避光孵育20min，用PBS洗涤3次，激光共聚焦扫描显微镜检测分析。

5、数据的统计分析

所有数据均以平均数士标准差表示，采用SPSS12.0统计软件，对实验结果进行单因素方差分析，P<0.05认为两者间存在显著差异。

三、结果及结论

1、细胞增殖活力检测结果

利用CCK-8法检测不同浓度化合物(Ⅰ)作用对三种乳腺癌细胞增殖活力的影响，结果表明，化合物(I)作用可使三种乳腺癌细胞增殖活性均降低，且随作用浓度的增加降低程度增加，显示出剂量-效应关系，100、150和200mg/mL组与对照组相比均出现显著性差异(P<0.05，P<0.01)，化合物(Ⅰ)作用可显著抑制乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453的增殖，显示出较强的体外细胞毒性，表明化合物(Ⅰ)具有较强的体外抗乳腺癌效应。结果见图3和表1。

2、细胞凋亡的检测结果

利用AnnexinV/PI双染流式细胞分析技术检测化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453凋亡的影响，凋亡分析结果显示，化合物(Ⅰ)作用24h可使三种乳腺癌细胞的凋亡率均升高，显示出促凋亡效应，且具有剂量-效应关系，100和150mg/mL组与对照组相比具有显著差异(P<0.05)表明化合物(Ⅰ)可显著诱导乳腺癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。结果见图4。

总结，本研究通过对化合物(Ⅰ)抗乳腺癌作用研究，发现化合物(Ⅰ)可使三种乳腺癌细胞增殖活性降低，显著抑制其增殖，显示出较强的体外细胞毒性，具有体外抗乳腺癌效应。

表1不同剂量化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞增殖的抑制率(％)

	50mg/mL	100mg/mL	150mg/mL	200mg/mL
					MDA-MB-453细胞	14.80	29.80	33.10	44.30
MDA-MB-231细胞	11.40	24.00	30.60	37.50
					MCF-7细胞	10.30	20.20	26.20	35.10

实施例3

片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例4

口服液制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。

实施例5

胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

实施例6

注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例7

无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims

1.具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

2.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将干燥的祖师麻粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱12个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。

3.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用80％乙醇热回流提取，合并提取液。

4.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

5.一种药物组合物，其特征在于：该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。

6.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

7.权利要求5所述的药物组合物在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。