CN105073105B - 具有改善的治疗指数的硝酰基供体 - Google Patents

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    • C07D307/64—Sulfur atoms

Abstract

所揭示标的物提供N‑经取代的羟基胺衍生物化合物、包含所述化合物的医药组合物与试剂盒以及使用所述化合物或医药组合物的方法。具体来说，所揭示标的物提供使用所述化合物或医药组合物治疗心力衰竭的方法。

Description

具有改善的治疗指数的硝酰基供体
背景技术
硝酰基(HNO)已展示在心力衰竭的活体外和活体内模型中具有正性心血管效应。然而，在生理学pH下，硝酰基二聚合成连二次硝酸，其随后脱水变成氧化亚氮；由于此亚稳性，必须从供体化合物原位生成用于治疗应用的硝酰基。已描述各种能够供予硝酰基的化合物且提出将其用于治疗已知或怀疑对硝酰基具有反应的病症。例如参见美国专利第6,936,639号、第7,696,373号、第8,030,356号、第8,268,890号、第8,227,639号和第8,318,705号和美国预授权公开案第2009/0281067号、第2009/0298795号、第2011/0136827号和第2011/0144067号。尽管所有这些化合物都能够供予硝酰基，但其具有不同的各种物理化学性质，并且仍需鉴别物理化学性质最适于通过特定投与途径治疗特定临床病状的硝酰基供体。
美国专利第8,030,056号描述皮洛蒂酸(Piloty’s acid)类型化合物的衍生物的合成，所述衍生物能够在生理学条件下供予硝酰基且可用于治疗心力衰竭和缺血/再灌注损伤。已在第I阶段安全性研究中于健康志愿者中和在实施于多个医院的第IIa阶段安慰剂对照、双盲、剂量递增研究中评估硝酰基供体CXL-1020(N-羟基-2-甲磺酰基苯-1-磺酰胺)。萨巴赫(Sabbah)等人，“硝酰基(HNO)，用于心力衰竭的急性治疗的新颖方式(Nitroxyl(HNO)a novel approach for the acute treatment of heart failure)”，循环：心力衰竭(Circ Heart Fail.)，2013年10月9日在线公开，(在线ISSN：1941-3297，印刷ISSN：1941-3289)。研究显示，在患有收缩性心力衰竭的患者中，在以水溶液形式于pH＝4下经静脉内投与时，CXL-1020会减小左心脏和右心脏的填充压力和全身血管阻力，同时增加心脏和每搏输出量指数。因此，研究显示，CXL-1020增强患有心力衰竭的人类患者中的心肌功能。然而，在产生血液动力学效应所需的CXL-1020的阈值剂量下，发现所述化合物会诱导副作用，包括在静脉内插入位点处和远离所述位点处具有不可接受程度的炎症性刺激，并且作者报道，因所述副作用，此化合物并非用于人类治疗的可行候选者。
因此，需要研发可用于治疗心力衰竭且具有适宜毒理学特征的新供予硝酰基的化合物和组合物。所述化合物的研发需要理解与硝酰基供予有关的药物代谢动力学特征和影响毒理学特征的因素。不能理解这些因素已阻碍了用于临床应用的供予硝酰基的化合物的研发。
另外，已证实调配供予硝酰基的化合物是极大挑战。许多当前硝酰基供体不溶于水溶液中和/或并不足够稳定。溶解性和稳定性问题通常妨碍所述化合物在用于胃肠外和/或经口投与的医药组合物中的应用。因此，需要研发用于胃肠外和/或经口投与的含有供予硝酰基的化合物的组合物，其足够稳定且具有有益药理学和毒理学特征。
本申请案第1部分中任一参考文献的引用不应解释为承认所述参考文献是本申请案的现有技术。
发明内容
本揭示内容涉及供予硝酰基的化合物的发现，所述供予硝酰基的化合物高度有效地用于治疗心血管疾病(例如心力衰竭)且具有适宜毒理学特征。
在一特定实施例中，本揭示内容的供予硝酰基的化合物是式(1)化合物：
在另一实施例中，本揭示内容的供予硝酰基的化合物是式(2)化合物：
在另一实施例中，本揭示内容提供式(3)化合物：
其中R是氢、-(C1-C6)烷基、-(C2-C4)烯基、苯基、苄基、环戊基、环己基、-(C5-C7)杂环烷基、苄氧基、-O-(C1-C6)烷基、-NH2、-NH-(C1-C4)烷基或-N((C1-C4)烷基)2，其中所述-(C1-C6)烷基、-(C2-C4)烯基、苯基、苄基、环戊基、环己基、-(C5-C7)杂环烷基、苄氧基、-O-(C1-C6)烷基、-NH-(C1-C4)烷基或-N((C1-C4)烷基)2可未经取代或经一或多个选自以下的取代基取代：卤基、-(C1-C6)烷基、-(C2-C4)烯基、-(C2-C3)炔基、-(5-或6元)杂芳基、-O-(C1-C6)烷基、-S-(C1-C6)烷基、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-CN、-NO2、-NH2、-NH-(C1-C4)烷基、-N(-(C1-C4)烷基)2、-C(＝O)(C1-C4)烷基、-C(＝O)O(C1-C4)烷基、-OC(＝O)(C1-C4)烷基、-OC(＝O)NH2、-S(＝O)(C1-C4)烷基或-S(＝O)2(C1-C4)烷基。在特定实施例中，R是甲基、乙基、苄基或苯基。在特定实施例中，R是甲基或乙基。在特定实施例中，R是甲基。在特定实施例中，R是乙基。在特定实施例中，R是苄基或苯基。在特定实施例中，R是苄基。在特定实施例中，R是苯基。
在另一实施例中，本揭示内容提供式(4)化合物：
其中R和其实施例是如上文针对式(3)化合物所定义。
本揭示内容的化合物具有或可视为具有高度有益的治疗指数。特定来说，式(1)和式(2)的化合物都具有所需的血液动力学特征和毒理学特征。式(1)和式(2)的化合物的毒理学特征相对于临床候选者CXL-1020具有显著增进。已发现，式(1)和式(2)的化合物的有益毒理学特征部分地源于化合物的半衰期和发现所述硝酰基供体的最优选半衰期范围。式(1)化合物在7.4的pH下于充气磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中测量时具有大约68分钟的半衰期，并且在7.4的pH下于人类血浆中在抗凝血剂(例如肝素或柠檬酸钠)存在下测量时具有大约65分钟的半衰期，其各自是在实例4中指定的条件下测量。式(2)化合物在7.4的pH下于充气磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中测量时具有大约50分钟的半衰期，并且在7.4的pH下于人类血浆中在抗凝血剂(例如肝素或柠檬酸钠)存在下测量时具有大约37分钟的半衰期，其各自是在实例4中指定的条件下测量。
另外，式(1)和式(2)的化合物在水溶液中较为稳定且具有高水溶性；其由此适于胃肠外和经口投与。式(1)化合物在水中具有大于100mg/mL的平衡溶解度，而式(2)化合物在水中具有大约10mg/mL的平衡溶解度(例如在实例5中指定的条件下)。
本揭示内容的化合物可用于治疗各种对硝酰基疗法具有反应的病状。举例来说，本揭示内容的供予硝酰基的化合物可用于治疗心血管疾病或预防其发生。在特定实施例中，本揭示内容的供予硝酰基的化合物可用于治疗心血管疾病、缺血/再灌注损伤、肺高血压或另一对硝酰基疗法具有反应的病状。在其它实施例中，本揭示内容的供予硝酰基的化合物可用于治疗心力衰竭。在一特定实施例中，本揭示内容的化合物可用于治疗失代偿性心力衰竭(例如急性失代偿性心力衰竭)。在某些实施例中，本揭示内容的化合物可用于治疗收缩性心力衰竭。在特定实施例中，本揭示内容的化合物可用于治疗舒张性心力衰竭。
在一方面中，可通过胃肠外(例如皮下、肌内、静脉内或皮内)投与来投与本揭示内容的化合物。在以能够提供所需功效程度的剂量胃肠外投与期间或之后，本揭示内容的化合物并不诱导不需要的局部副作用(例如刺激和/或炎症)。
在胃肠外投与本揭示内容的化合物的实施例中，通常以水溶液或悬浮液形式投与。水溶液或悬浮液可具有约4到约6.5的pH。在特定实施例中，本揭示内容的化合物可经调配用于在约4到约5的pH下胃肠外注射。在其它实施例中，本揭示内容的化合物可经调配用于在约5到约6的pH下胃肠外注射。在一些实施例中，用于胃肠外投与的调配物可包括稳定性增强剂。
在胃肠外(例如静脉内)投与人类个体时，可以约5μg/kg/min到约100μg/kg/min的速率投用本揭示内容的化合物。在某些实施例中，可以约10μg/kg/min到约70μg/kg/min的速率向人类个体投用本揭示内容的化合物。在某些实施例中，可以约15μg/kg/min到约50μg/kg/min的速率向人类个体投用本揭示内容的化合物。在某些实施例中，可以约20μg/kg/min到约40μg/kg/min的速率向人类个体投用本揭示内容的化合物。
在另一实施例中，本揭示内容的化合物可经调配用于经口投与。可将用于经口投与的化合物调配为液体或固体剂型。在将供予硝酰基的化合物调配为口服液体剂型的特定实施例中，聚乙二醇300(PEG300)可用作实例性赋形剂。
附图说明
图1展示使用心力衰竭的心动过速-起搏模型CXL-1020和本揭示内容的两种化合物(式(1)和式(2)的化合物)的血液动力学特征(参见实例6)。以100μg/kg/min的速率经静脉内投与每一化合物。在投与相应化合物之后180分钟获得血液动力学参数。
图2展示使用用于清醒动物的心力衰竭的心动过速-起搏模型式(1)化合物在各种剂量下的血液动力学特征(参见实例6)。
图3展示在狗中诱导心力衰竭后式(1)化合物的血液动力学特征。使用犬微血栓形成心力衰竭模型评估血液动力学(参见实例7)。展示在两种输注速率输注期间(180分钟)最终时间点的数据。
图4展示使用犬周边静脉模型CXL-1020和本揭示内容的两种供予硝酰基的化合物(式(1)和式(2)的化合物)在以不同剂量进行24小时输注后的毒理学特征的评价(参见实例9)。所测量的主要炎症标记物包括白细胞(WBC)、纤维蛋白原和C-反应蛋白(CRP)。
图5展示使用犬植入中心导管72小时模型且使用不同剂量的CXL-1020和式(1)和(2)的化合物所观察的炎症的量度(参见实例9)。
具体实施方式
本发明包括如下：
(1.)一种式(1)化合物，
(2.)一种式(2)化合物，
(3.)一种医药组合物，其包含根据上文(1.)或(2.)所述的化合物和至少一种医药上可接受的赋形剂。
(4.)根据上文(3.)所述的医药组合物，其中所述医药组合物适于静脉内投与。
(5.)根据上文(3.)或(4.)所述的医药组合物，其中所述医药组合物具有约4到约6的pH。
(6.)根据上文(3.)到(5.)中任一项所述的医药组合物，其中所述医药组合物具有约4到约5的pH。
(7.)根据上文(3.)到(6.)中任一项所述的医药组合物，其中所述医药组合物具有约4的pH。
(8.)一种治疗心血管疾病的方法，其包含向有需要的患者投与有效量的根据上文(1.)或(2.)所述的化合物或根据上文(3.)到(7.)中任一项所述的医药组合物。
(9.)根据上文(8.)所述的方法，其中所述心血管疾病是心力衰竭。
(10.)根据上文(8.)或上文(9.)所述的方法，其中所述心血管疾病是急性失代偿性心力衰竭。
(11.)根据上文(8.)到(10.)中任一项所述的方法，其中经静脉内投与所述化合物或医药组合物。
(12.)根据上文(8.)到(11.)中任一项所述的方法，其中以约20μg式(1)或(2)化合物/kg/分钟到约40μg式(1)或(2)化合物/kg/分钟的剂量投与所述化合物或医药组合物。
(13.)根据上文(8.)到(10.)中任一项所述的方法，其中经口投与所述化合物或医药组合物。
(14.)一种试剂盒，其包含呈干燥形式的根据上文(1.)或(2.)所述的化合物或呈干燥形式的根据上文(3.)到(7.)中任一项所述的医药组合物；和
医药上可接受的液体稀释剂。
(15.)一种根据上文(1.)或(2.)所述的化合物的用途或根据上文(3.)到(7.)中任一项所述的医药组合物的用途，其用以制造可用于治疗心血管疾病的药物。
(16.)一种根据上文(1.)或(2.)所述的化合物的用途或根据上文(3.)到(7.)中任一项所述的医药组合物的用途，其用以制造可用于治疗心力衰竭的药物。
(17.)一种根据上文(1.)或(2.)所述的化合物的用途或根据上文(3.)到(7.)中任一项所述的医药组合物的用途，其用以制造可用于治疗急性失代偿性心力衰竭的药物。
(18.)根据上文(1.)或(2.)所述的化合物或根据上文(3.)到(7.)中任一项所述的医药组合物，其用于治疗心血管疾病。
(19.)根据上文(1.)或(2.)所述的化合物或根据上文(3.)到(7.)中任一项所述的医药组合物，其用于治疗心力衰竭。
(20.)根据上文(1.)或(2.)所述的化合物或根据上文(3.)到(7.)中任一项所述的医药组合物，其用于治疗急性失代偿性心力衰竭。
4.1定义
除非另外明确指示，否则本文所用的下列术语具有下文所指示的含义。
“医药上可接受的盐”是指本文所揭示任一治疗剂的盐，所述盐可包括业内已知的各种有机和无机抗衡离子中的任一者且所述盐在医药上可接受。在治疗剂含有酸性官能基时，抗衡离子的各种实例性实施例为钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵和诸如此类的离子。在治疗剂含有碱性官能基时，医药上可接受的盐可包括(举例来说)有机或无机酸的抗衡离子，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐和诸如此类。阐释性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、苯磺酸盐(besylate)、延胡索酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐(glucaronate)、糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)和对甲苯磺酸盐。因此，盐可从本文所揭示具有酸性官能基(例如羧酸官能基)的任一式的化合物和医药上可接受的无机或有机碱制得。适宜碱包括但不限于诸如钠、钾和锂等碱金属的氢氧化物；诸如钙和镁等碱土金属的氢氧化物；诸如铝和锌等其它金属的氢氧化物；氨和有机氨，例如未经取代或经羟基取代的单-、二-或三烷基胺、二环己基胺；三丁基胺；吡啶；N-甲基-N-乙基胺；二乙胺；三乙胺；单-、双-或三-(2-羟基-低碳数烷基胺)，例如单-、双-或三-(2-羟乙基)胺、2-羟基-叔丁基胺或三-(羟甲基)甲基胺、N,N-二-低碳数烷基-N-(羟基-低碳数烷基)-胺，例如N,N-二甲基-N-(2-羟乙基)胺或三-(2-羟乙基)胺；N-甲基-D-葡萄糖氨；和氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸和诸如此类。盐还可从本文所揭示具有碱性官能基(例如氨基官能基)的任一式的化合物和医药上可接受的无机或有机酸制得。适宜酸包括氢硫酸、柠檬酸、乙酸、盐酸(HCl)、氢溴酸(HBr)、氢碘酸(HI)、硝酸、磷酸、乳酸、水杨酸、酒石酸、抗坏血酸、琥珀酸、马来酸、苯磺酸(besylic acid)、延胡索酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸(glucaronic acid)、甲酸、苯甲酸、谷氨酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸(benzenesulfonic acid)和对甲苯磺酸。
“医药上可接受的赋形剂”是指如下任一物质：其本身并非治疗剂，用作载剂、稀释剂、佐剂、粘合剂和/或媒剂，用于将治疗剂递送到患者，或添加到医药组合物中以增进其处置或储存性质或允许或促进化合物或医药组合物形成用于投与的单位剂型。医药上可接受的赋形剂为医药技术所习知且揭示于(例如)真纳罗(Gennaro)编辑，雷明顿：药物科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，第20版(利平科特威廉姆斯与威尔金斯公司(Lippincott Williams&Wilkins)，巴尔的摩(Baltimore)，马里兰州(MD)，2000)和医药赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，美国医药协会(American Pharmaceutical Association)，华盛顿(Washington)，D.C.，(例如分别在1986年、1994年和2000年的第1版、第2版和第3版)中。如所属领域技术人员已知，医药上可接受的赋形剂可提供各种功能且可描述为润湿剂、缓冲剂、悬浮剂、润滑剂、乳化剂、崩解剂、吸收剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。医药上可接受的赋形剂的实例包括但不限于：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、乙酸纤维素、羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素；(4)黄蓍胶粉剂；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无致热源水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液(Ringer’s solution)；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；和(22)其它用于医药调配物中的无毒相容物质。
“单位剂型”是指适于作为用于人类或动物的单剂量的物理离散单位。每一单位剂型可含有预定量的经计算产生所需效应的治疗剂。
除非另外明确指示，否则“患者”是指动物，例如哺乳动物，包括但不限于人类。因此，本文所揭示的方法可用于人类疗法和兽医应用中。在特定实施例中，患者是哺乳动物。在某些实施例中，患者是人类。
“有效量”是指组合其功效参数和毒性可能以及基于实践专家的知识，所述量的治疗剂或其医药上可接受的盐应以给定治疗形式有效。如业内所理解，有效量可以一或多个剂量投与。
“治疗(treatment、treating)”和诸如此类是获得有益或所需结果(包括临床结果)的方式。出于本揭示内容的目的，有益或所需结果包括但不限于抑制和/或阻抑病状的发作和/或发生或减小所述病状的严重程度(例如减小与所述病状有关的症状的数量和/或严重程度)，增加那些患有所述病状者的生活质量，降低治疗所述病状所需的其它药剂的剂量，增强患者所服用另一药剂对于所述病状的效应，和/或延长患有所述病状的患者的存活。
“预防(prevent、preventing)”和诸如此类是指减小并未患有病状但处于发生病状的风险下的患者发生病状的概率。“处于风险下”的患者可或可不患有可检测病状，并且在本文所揭示的治疗方法之前可或可不显示可检测病状。“处于风险下”表示患者具有一或多个所谓的风险因素，其是与发生病状相关的可测量参数且为业内所习知。具有一或多个这些风险因素的患者发生病状的概率高于并无一或多个所述风险因素的患者。
“正性收缩影响剂”是指使得心肌收缩功能有所增加的药剂。实例性正性收缩影响剂是β-肾上腺素能受体激动剂、磷酸二酯酶活性抑制剂和钙敏化剂。β-肾上腺素能受体激动剂尤其包括多巴胺(dopamine)、多巴酚丁胺(dobutamine)、特布他林(terbutaline)和异丙肾上腺素(isoproterenol)。还打算涵盖所述化合物的类似物和衍生物。举例来说，美国专利第4,663,351号揭示可经口投与多巴酚丁氨前药。
“对硝酰基疗法具有反应”的病状包括如下任一病状：其中投与在生理学条件下供予有效量的硝酰基的化合物会治疗和/或预防所述病状，那些术语定义于本文中。在投与硝酰基供体后症状得以阻抑或减弱的病状是对硝酰基疗法具有反应的病状。
“肺高血压”或“PH”是指肺动脉压升高的病状。PH的当前血液动力学定义是在大于或等于25mmHg的安静状态下的平均肺动脉压(MPAP)。巴德斯切(Badesch)等人，美国心血管病学会期刊(J.Amer.Coll.Cardiol.)54(增刊):S55-S66(2009)。
“N/A”意指未评价。
“(C1-C6)烷基”是指具有1、2、3、4、5或6个碳原子的饱和直链和具支链烃结构。在命名具有具体碳数的烷基时，打算涵盖所有具有所述碳数的几何异构体；因此，举例来说，“丙基”包括正丙基和异丙基且“丁基”包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基。(C1-C6)烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正己基和诸如此类。
“(C1-C4)烷基”是指具有1、2、3或4个碳原子的饱和直链和具支链烃结构。(C1-C4)烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和叔丁基。
“(C3-C5)烷基”是指具有3、4或5个碳原子的饱和直链和具支链烃结构。在命名具有具体碳数的烷基时，打算涵盖所有具有所述碳数的几何异构体；因此，举例来说，“丙基”包括正丙基和异丙基且“丁基”包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基。(C3-C5)烷基的实例包括正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基和诸如此类。
“(C2-C4)烯基”是指具有2、3或4个碳原子和双键(在任一位置)的直链或具支链不饱和烃基团，例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-甲基乙烯基、1-甲基-1-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基和诸如此类。
“(C2-C3)烯基”是指具有2或3个碳原子且包括至少一个碳-碳双键的直链非环状烃。(C2-C3)烯基的实例包括-乙烯基、-烯丙基和1-丙-1-烯基。
“(C5-C7)杂环烷基”是指含有1、2、3或4个各自独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的5-、6-或7员饱和或不饱和桥接单环或双环杂环。(C5-C7)杂环烷基的实例包括吡唑基、吡咯啶基、哌啶基、哌嗪基、四氢噁嗪基、四氢呋喃、硫戊环、二硫戊环、吡咯啉、吡咯啶、吡唑啉、吡唑啶、咪唑啉、咪唑啶、四唑、哌啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、四氢呋喃酮、γ-丁内酯、α-吡喃、γ-吡喃、二氧杂环戊烷、四氢吡喃、二噁烷、二氢噻吩、哌嗪、三嗪、四嗪、吗啉、硫代吗啉、二氮杂环庚烷、噁嗪、四氢-噁嗪基、异噻唑、吡唑啶和诸如此类。
“(5-或6元)杂芳基”是指5或6个成员的单环芳族杂环，也就是包含至少一个环杂原子(例如1、2、3或4个环杂原子，其各自独立地选自氮、氧和硫)的单环芳族环。-(5-或6元)杂芳基的实例包括吡啶基、吡咯基、呋喃基、咪唑基、噁唑基、咪唑基、噻唑基、异噁唑基、1,2,3-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,2,3-三唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,5-三嗪基和噻吩基。
“卤基”是指-F、-Cl、-Br或-I。
“β-环糊精的磺基-正丁基醚衍生物”是指通过使用-(CH2)4-S(O)2-OH或-(CH2)4-S(O)2-O-Z+代替其氢原子以分别提供-O-(CH2)4-S(O)2-OH或-O-(CH2)4-S(O)2-O-Z+基团衍生的具有至少一个-OH基团的β-环糊精，其中Z+是阳离子，例如钠、钾、铵、四甲基铵和诸如此类的阳离子。在一实施例中，每一Z是钠。
4.2具有增进的治疗指数的供予硝酰基的化合物
在一方面中，本揭示内容提供适于治疗心血管疾病(例如心力衰竭)的新颖化合物。特定来说，本揭示内容提供供予硝酰基的化合物，其具有使其适于用作人类治疗剂的性质的组合。特定来说，本揭示内容的供予硝酰基的化合物具有适宜半衰期、有益治疗指数，具有高水溶性且具有足够固态稳定性。表1提供本揭示内容的两种具体供予硝酰基的N-羟基磺酰胺化合物，其拥有所述所需性质且由此适于作为治疗剂投与人类。
表1：本揭示内容的供予硝酰基的化合物
在特定实施例中，表1中的供予硝酰基的化合物可以其医药上可接受的盐来利用。
在其它实施例中，在表1中列示的化合物的N-羟基可发生酯化以提供化合物的前药。
举例来说，本揭示内容提供式(3)化合物：
其中R是氢、-(C1-C6)烷基、-(C2-C4)烯基、苯基、苄基、环戊基、环己基、-(C5-C7)杂环烷基、苄氧基、-O-(C1-C6)烷基、-NH2、-NH-(C1-C4)烷基或-N((C1-C4)烷基)2，其中所述-(C1-C6)烷基、-(C2-C4)烯基、苯基、苄基、环戊基、环己基、-(C5-C7)杂环烷基、苄氧基、-O-(C1-C6)烷基、-NH-(C1-C4)烷基或-N((C1-C4)烷基)2可未经取代或经一或多个选自以下的取代基取代：卤基、-(C1-C6)烷基、-(C2-C4)烯基、-(C2-C3)炔基、-(5-或6元)杂芳基、-O-(C1-C6)烷基、-S-(C1-C6)烷基、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-CN、-NO2、-NH2、-NH-(C1-C4)烷基、-N(-(C1-C4)烷基)2、-C(＝O)(C1-C4)烷基、-C(＝O)O(C1-C4)烷基、-OC(＝O)(C1-C4)烷基、-OC(＝O)NH2、-S(＝O)(C1-C4)烷基或-S(＝O)2(C1-C4)烷基。在特定实施例中，R是甲基、乙基、苄基或苯基。
在本揭示内容的化合物是式(3)化合物的特定实施例中，R是甲基。在化合物具有式(3)的其它实施例中，R是乙基。在本揭示内容的化合物是式(3)化合物的某些实施例中，R是甲基或乙基。在化合物具有式(3)的其它实施例中，R是苯基。在化合物具有式(3)的其它实施例中，R是苄基。在本揭示内容的化合物是式(3)化合物的特定实施例中，R是苄基或苯基。在化合物具有式(3)的其它实施例中，R是-NH2。在此段落中的每一上述实施例中，R在一实施例中未经取代，在另一实施例中经单取代，在其它实施例中经两个独立选择的取代基二取代，或在另一实施例中经三个独立选择的取代基三取代。在此段落中的每一上述实施例的各种实施例中，取代基是-卤基、-NH2、-NHCH3、-CF3或-OCH3或取代基独立地选自-卤基、-NH2、-NHCH3、-CF3和-OCH3。
举例来说，本揭示内容提供式(4)化合物：
其中R和其可选取代基是如上文针对式(3)化合物所定义。
在本揭示内容的化合物是式(4)化合物的特定实施例中，R是甲基。在化合物具有式(4)的其它实施例中，R是乙基。在本揭示内容的化合物是式(4)化合物的某些实施例中，R是甲基或乙基。在化合物具有式(4)的其它实施例中，R是苯基。在化合物具有式(4)的其它实施例中，R是苄基。在本揭示内容的化合物是式(4)化合物的特定实施例中，R是苄基或苯基。在化合物具有式(4)的其它实施例中，R是-NH2。在此段落中的每一上述实施例中，R在一实施例中未经取代，在另一实施例中经单取代，在其它实施例中经两个独立选择的取代基二取代，或在另一实施例中经三个独立选择的取代基三取代。在此段落中的每一上述实施例的各种实施例中，取代基是-卤基、-NH2、-NHCH3、-CF3或-OCH3或取代基独立地选自-卤基、-NH2、-NHCH3、-CF3和-OCH3。
出人意料地，已发现，在投与人类患者时，本揭示内容的供予硝酰基的化合物提供与CXL-1020类似的功效水平，但具有显著减少的副作用，尤其局部副作用(例如刺激和/或炎症)(参见实例8和9)。另外，本揭示内容的供予硝酰基的化合物使得血液动力学效应在1小时或更短时间内发生，此是临床方面所需的。
不受限于理论，在本揭示内容的实例中所报告的实验表明，在PBS或人类血浆中测量时(参见实例4)，半衰期实质上短于15分钟的硝酰基供体(例如CXL-1020)在投与后产生较高的硝酰基局部浓度，并且较高的硝酰基局部浓度是引起所观察的不需要的副作用的原因。已知硝酰基在高浓度下发生二聚合，从而形成连二次硝酸，其能够产生羟基。或者或此外，源于白细胞的过氧化物可与硝酰基反应形成羟基。羟基可对内皮细胞有毒，从而导致炎症和/或不耐性。尽管具有较长半衰期的硝酰基化合物在理论上可通过类似机制产生羟基，但预计所述基团的形成会因硝酰基的低浓度而有所减少，由此降低硝酰基发生二聚合或与过氧化物反应的能力。因此，预计具有极长半衰期(例如在根据实例4中描述的方法于人类血浆中测量时，大于95分钟)的化合物具有有利的毒理学特征；然而，由于预计这些化合物在大量硝酰基形成之前就从循环清除和/或稀释，故预计所述化合物具有低功效。
如实例4中所描述，在pH 7.4的充气磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中测量时和在pH7.4的人类血浆中在抗凝血剂(例如肝素或柠檬酸钠)存在下测量时，式(1)和(2)的化合物具有大于约10分钟且小于95分钟的半衰期，其各自是在实例4中指定的条件下测量。具体来说，在pH 7.4的充气磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中测量时，式(1)化合物具有大约68分钟的半衰期，并且在pH 7.4的人类血浆中在抗凝血剂(例如肝素或柠檬酸钠)存在下测量时，具有大约65分钟的半衰期，其各自是在实例4中指定的条件下测量。在7.4的pH下于充气磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中测量时，式(2)化合物具有大约50分钟的半衰期，并且在pH 7.4下于人类血浆中在抗凝血剂(例如肝素或柠檬酸钠)存在下测量时，具有大约37分钟的半衰期，其各自是在实例4中指定的条件下测量。
另外，如实例5中所描述，式(1)和(2)的化合物中的每一者具有高水溶性且由此适于胃肠外或经口投与。可在并不添加增溶剂下调配所述化合物。另外，如实例10-12中所显示，式(1)和式(2)的化合物在医药组合物中具有极佳稳定性以用于胃肠外(例如静脉内)投与。
4.3测量硝酰基供予能力
易于通过常规实验测试化合物的硝酰基供予。尽管通常实际上不能直接测量是否供予硝酰基，但可接受若干分析方式适于测定化合物是否供予硝酰基。举例来说，可将所关注化合物置于密封容器中的溶液中，例如在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中或pH为约7.4的磷酸盐缓冲溶液中。在足够解离时间逝去后(例如数分钟到数小时)，汲取顶部空间气体并分析以测定其组成(例如通过气相色谱和/或质谱)。如果形成气体N2O(其通过HNO二聚合发生)，那么测试对于硝酰基供予来说是阳性且所述化合物可视为硝酰基供体。
可将硝酰基供予能力值表示为化合物的理论化学计量最大值的百分比。在各种实施例中，供予“显著量硝酰基”的化合物意指供予硝酰基理论最大量的约40％或更高、约50％或更高、约60％或更高、约70％或更高、约80％或更高、约90％或更高或约95％或更高的化合物。在特定实施例中，本揭示内容的硝酰基供体化合物供予其硝酰基理论最大量的约70％到约90％。在特定实施例中，本揭示内容的硝酰基供体化合物供予其硝酰基理论最大量的约85％到约95％。在特定实施例中，本揭示内容的硝酰基供体化合物供予其硝酰基理论最大量的约90％到约95％。供予硝酰基理论最大量的小于约40％或小于约50％的化合物仍是硝酰基供体且可用于所揭示方法中。供予硝酰基理论最大量的小于约50％的化合物可用于所揭示方法中，但与供予较高硝酰基量的化合物相比可能需要较高投药量。
如果需要，还可通过将测试化合物暴露于高铁肌红蛋白(Mb3+)来检测硝酰基供予。参见巴林斯基(Bazylinski)等人所著的美国化学学会期刊(J.Amer.Chem.Soc.)107(26):7982-7986(1985)。硝酰基与Mb3+反应形成Mb2+-NO络合物，其可通过紫外/可见光谱变化或通过电子顺磁共振(EPR)来进行检测。Mb2+-NO络合物具有定中心于约2的g值周围的EPR信号。另一方面，一氧化氮与Mb3+反应形成Mb3+-NO络合物，其具有可忽略(如果存在)EPR信号。因此，如果化合物与Mb3+反应形成可通过常用方法(例如紫外/可见光谱或EPR)检测的络合物，那么所述测试对于硝酰基供予来说是阳性。
可在生理学相关pH下测试硝酰基供予。本揭示内容的供予硝酰基的化合物能够在生理学pH(也就是约7.4的pH)和生理学温度(也就是约37℃的温度)(统称为“生理学条件”)下供予硝酰基。在特定实施例中，本揭示内容的供予硝酰基的化合物可在生理学条件下供予其硝酰基理论最大(也就是100％)量的约40％或更高。在特定实施例中，本揭示内容的供予硝酰基的化合物可在生理学条件下供予其硝酰基理论最大量的约50％或更高。在特定实施例中，本揭示内容的供予硝酰基的化合物可在生理学条件下供予其硝酰基理论最大量的约60％或更高。在特定实施例中，本揭示内容的供予硝酰基的化合物可在生理学条件下供予其硝酰基理论最大量的约70％或更高。在特定实施例中，本揭示内容的供予硝酰基的化合物可在生理学条件下供予其硝酰基理论最大量的约80％或更高。在特定实施例中，本揭示内容的供予硝酰基的化合物可在生理学条件下供予其硝酰基理论最大量的约90％或更高。
应理解，本揭示内容的供予硝酰基的化合物还可供予限制量的一氧化氮，只要硝酰基供予量超过一氧化氮供予量。在某些实施例中，供予硝酰基的化合物可在生理学条件下供予约25摩尔％或更少的一氧化氮。在特定实施例中，供予硝酰基的化合物可在生理学条件下供予约20摩尔％或更少的一氧化氮。在特定实施例中，供予硝酰基的化合物可在生理学条件下供予约15摩尔％或更少的一氧化氮。在特定实施例中，供予硝酰基的化合物可在生理学条件下供予约10摩尔％或更少的一氧化氮。在特定实施例中，供予硝酰基的化合物可在生理学条件下供予约5摩尔％或更少的一氧化氮。在特定实施例中，供予硝酰基的化合物可在生理学条件下供予约2摩尔％或更少的一氧化氮。在特定实施例中，供予硝酰基的化合物可在生理学条件下供予极少量(例如约1摩尔％或更少)的一氧化氮。
4.4医药组合物
本揭示内容还涵盖一种医药组合物，其包含式(1)、(2)、(3)或(4)的供予硝酰基的化合物和至少一种医药上可接受的赋形剂。医药上可接受的赋形剂的实例包括那些描述于上文中者，例如载剂、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、矫味剂、涂覆剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂和其任一组合。医药上可接受的赋形剂的选择和使用教示于(例如)特罗伊(Troy)编辑，雷明顿：药物科学与实践，第21版(利平科特威廉姆斯与威尔金斯公司，巴尔的摩，马里兰州，2005)中。
在各种实施例中，至少一种医药上可接受的赋形剂包含至少一种类型的环糊精。在一特定实施例中，环糊精是具有通过α(1-4)链接连接的葡萄糖单元的环状结构。在另一实施例中，环糊精是β-环糊精，也就是具有7个通过α(1-4)链接连接的葡萄糖单元的环状结构。在另一实施例中，通过在环糊精的每一吡喃葡萄糖单元上衍生三个可用羟基的任一组合来对环糊精进行化学改质。
在医药上可接受的赋形剂包含至少一种类型的环糊精的一些实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基(C1-C6)烷基醚衍生物。在某些这些实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基(C1-C6)烷基醚衍生物，其中每个环糊精分子具有约6到约7个磺基(C1-C6)烷基醚基团。在各种实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基(C1-C6)烷基醚衍生物，其中每个环糊精分子平均具有约6到约7个磺基(C1-C6)烷基醚基团。在另一所述实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基(C1-C6)烷基醚衍生物，其中每个环糊精分子具有6或7个磺基(C1-C6)烷基醚基团。
在医药上可接受的赋形剂包含至少一种类型的环糊精的特定系列实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基(C3-C5)烷基醚衍生物。在一所述实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基(C3-C5)烷基醚衍生物，其中每个环糊精分子具有约6到约7个磺基(C3-C5)烷基醚基团。在各种所述实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基(C3-C5)烷基醚衍生物，其中每个环糊精分子平均具有约6到约7个磺基(C3-C5)烷基醚基团。在另一所述实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基(C3-C5)烷基醚衍生物，其中每个环糊精分子具有6或7个磺基(C3-C5)烷基醚基团。
在医药上可接受的赋形剂包含至少一种类型的环糊精的特定实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基丁基醚衍生物。在某些这些实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基丁基醚衍生物，其中每个环糊精分子具有约6到约7个磺基丁基醚基团。在另一所述实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基丁基醚衍生物，其中每个环糊精分子平均具有约6到约7个磺基丁基醚基团。在另一所述实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基丁基醚衍生物，其中每个环糊精分子具有6或7个磺基丁基醚基团。
在医药上可接受的赋形剂包含至少一种类型的环糊精的某些实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基-正丁基醚衍生物。在一所述实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基-正丁基醚衍生物，其中每个环糊精分子具有约6到约7个磺基-正丁基醚基团。在另一所述实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基-正丁基醚衍生物，其中每个环糊精分子平均具有约6到约7个磺基-正丁基醚基团。在另一所述实施例中，环糊精是β-环糊精的磺基-正丁基醚衍生物，其中每个环糊精分子具有6或7个磺基-正丁基醚基团。
在医药上可接受的赋形剂包含至少一种类型的环糊精的各种特定实施例中，环糊精在诸如以下生理学相容pH值下包含多个负电荷：在一些实施例中pH为约5.0到约6.8、在一些实施例中约5.5到约6.5、在一些实施例中约5.7到约6.3、在一些实施例中约5.8到约6.2、在一些实施例中约5.9到约6.1并且在特定实施例中约6.0。在一所述实施例中，至少一种医药上可接受的赋形剂包含环糊精(配体制药公司(LigandPharmaceuticals)，拉霍亚(La Jolla)，加利福尼亚州(CA))。
医药组合物可经调配用于以固体或液体形式进行投与，包括那些适于下列方式者：(1)经口投与，例如兽用顿服药(例如水性或非水性溶液或悬浮液)、锭剂(例如那些目标是用于经颊、舌下和全身吸收者)、囊片、大丸剂、粉剂、粒剂、用于施加到舌的膏糊、硬质明胶胶囊、软质明胶胶囊、口喷雾剂、含片、菱形锭剂、丸剂、糖浆、悬浮液、酏剂、液体、乳液和微乳液；或(2)胃肠外投与(例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射)，例如无菌溶液或悬浮液。医药组合物可用于立即、持续或受控释放。
在一特定实施例中，医药组合物经调配用于静脉内投与。在另一实施例中，医药组合物经调配用于通过连续输注经静脉内投与。
在另一实施例中，医药组合物经调配用于经口投与。可将用于经口投与的化合物调配为液体或固体剂型。在将供予硝酰基的化合物调配为口服液体剂型的特定实施例中，聚乙二醇300(PEG300)可有用地用作赋形剂。
本文所揭示的化合物和医药组合物可制成任一适当单位剂型，例如胶囊、药囊、锭剂、粉剂、粒剂、溶液、存于水性液体中的悬浮液、存于非水性液体中的悬浮液、水包油型液体乳液、油包水型液体乳液、脂质粒或浓注剂。
锭剂可通过压制或模制任选地与一或多种辅助成份一起制得。压制锭剂可通过在适宜机器中压制呈自由流动形式(例如粉末或粒子)的一或多种活性剂来制得，活性剂任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂一起混合。模制锭剂可通过在适宜机器中模制经惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物的混合物来制得。可任选地涂覆或刻痕锭剂且可加以调配以提供其中活性成份的缓慢或受控释放。业内已知调配医药活性成份(例如本文的治疗剂和业内已知的其它化合物)的所述缓慢或受控释放组合物的方法且揭示于所颁布美国专利(其中的一些包括但不限于美国专利第4,369,174号、第4,842,866号)和其中引用的参考文献。可使用涂覆剂来将化合物递送到肠中(例如参见美国专利第6,638,534号、第5,217,720号、第6,569,457号和其中引用的参考文献)。所属领域技术人员将认识到，除锭剂外，可调配其它剂型以提供活性成份的缓慢或受控释放。所述剂型包括但不限于胶囊、粒剂和凝胶药丸。
适于局部投与的医药组合物包括但不限于菱形锭剂，其包含存于调味基质(例如蔗糖、阿拉伯胶和黄蓍胶)中的成份；和软锭剂，其包含存于调味基质或惰性基质(例如明胶和甘油)中的活性成份。
适于胃肠外投与的各种医药组合物实施例包括但不限于水性无菌注射溶液或非水性无菌注射溶液，其各自含有(例如)抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得调配物与预期接受者的血液等渗的溶质；和水性无菌悬浮液与非水性无菌悬浮液，其各自含有(例如)悬浮剂和增稠剂。所述调配物可以单位剂量或多剂量容器(例如密封安瓿(ampule)或小瓶)呈现，并且其可储存于冷冻干燥(冻干)条件下且仅需在即将使用前添加无菌液体载剂(例如水)。
可以酸性、中性或碱性溶液形式投与胃肠外投与的医药组合物。在一实施例中，可将本揭示内容中包含供予硝酰基的化合物的医药组合物调配成pH为约4到约5(举例来说，pH为约4、约4.5、约4.8或约5，包括其间的值)的酸性溶液。尽管约4的pH通常视为最适于调配供予硝酰基的组合物以实现化合物的合适稳定性，但已发现，在所述酸性条件下进行调配可在胃肠外投与后潜在地引起或加重静脉刺激。可通过将供予硝酰基的化合物调配于较小酸性或甚至中性溶液中来减弱刺激量(参见图4)。因此，在特定实施例中，本揭示内容的供予硝酰基的化合物可经调配用于在约5到约6.2(例如约5、约5.5、约5.8、约6或约6.2的pH，包括其间的值)的pH下胃肠外使用。
4.5本揭示内容的化合物和医药组合物的使用方法
在一方面中，本揭示内容提供增加活体内硝酰基含量的方法，其包含向有需要的患者投与有效量的如本文所揭示的化合物或医药组合物。在各种实施例中，患者患有、怀疑患有对硝酰基疗法具有反应的病状，或处于患有或发生所述病状的风险下。
在特定实施例中，本揭示内容提供治疗、预防病状或延迟病状的发作和/或发生的方法，其包含向患者(包括鉴别为需要所述治疗、预防或延迟的患者)投与有效量的如本文所揭示的化合物或医药组合物。鉴别有需要的患者可由医师、临床员工、应急人员或其它健康护理专业人员进行判断且可为主观性(例如意见)或客观性(例如可通过测试或诊断方法测量)。
由本文所揭示方法涵盖的特定病状包括但不限于心血管疾病、缺血/再灌注损伤和肺高血压(PH)。
4.5.1 心血管疾病
在一实施例中，本揭示内容提供治疗心血管疾病的方法，其包含向有需要的患者投与有效量的如本文所揭示的化合物或医药组合物。
可有用地使用本文所揭示的化合物和组合物进行治疗的心血管疾病和症状的实例包括对硝酰基疗法具有反应的心血管疾病、冠状动脉阻塞、冠状动脉疾病(CAD)、心绞痛、心脏病发作、心肌梗塞、高血压、缺血性心肌病和梗塞、肺充血、肺水肿、心脏纤维变性、心脏瓣膜病、心包疾病、循环充血状态、周边水肿、腹水、查加斯病(Chgas’disease)、心室肥大、心脏瓣膜病、心力衰竭、舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭、充血性心力衰竭、急性充血性心力衰竭、急性失代偿性心力衰竭和心脏肥大。
4.5.1.1 心力衰竭
可使用本揭示内容的供予硝酰基的化合物和组合物来治疗患有心力衰竭的患者。心力衰竭可为任一类型或形式，包括本文所揭示心力衰竭中的任一者。心力衰竭的非限制性实例包括早期心力衰竭、种类I、II、III和IV心力衰竭、急性心力衰竭、充血性心力衰竭(CHF)和急性充血性心力衰竭。在一实施例中，可使用本揭示内容的化合物和组合物来治疗急性失代偿性心力衰竭。
在使用本揭示内容的供予硝酰基的化合物和组合物来治疗患有心力衰竭的患者的实施例中，还可投与另一治疗心力衰竭的活性剂。在一所述实施例中，可结合正性收缩影响剂(例如β-激动剂)投与硝酰基供体。β-激动剂的实例包括但不限于多巴胺、多巴酚丁氨、异丙肾上腺素、所述化合物的类似物和所述化合物的衍生物。在另一实施例中，可结合β-肾上腺素能受体拮抗剂(在本文中还称为β-拮抗剂或β-阻断剂)投与硝酰基供体。β-拮抗剂的实例包括但不限于普萘洛尔(propranolol)、美托洛尔(metoprolol)、比索洛尔(bisoprolol)、布新洛尔(bucindolol)和卡维地洛(carvedilol)。
如实例6和7中所描述，使用各种心力衰竭模型来评估本揭示内容的若干供予硝酰基的化合物的血液动力学特征。如图1-3(其论述于实例6和7中)中所展示，式(1)和式(2)的化合物显著增强收缩力和舒张力且在并无心动过速下适度减小血压。另外，显著血液动力学效应的发作较为迅速(例如在1小时内)且在2小时内实现近最大效应。
尽管在经静脉内投与时式(1)和式(2)的化合物的血液动力学活性类似于包含硝酰基供体CXL-1020的组合物，但与包含CXL-1020的组合物相比，半衰期长于CXL-1020的式(1)和式(2)的化合物的毒理学特征得以显著增进(参见实例9和图4与5)。举例来说，式(1)和式(2)的化合物的“无可观察不良效应量”(NOAEL)实质上高于CXL-1020的NOAEL(参见描述NOAEL测定的实例9)。特定来说，式(1)化合物具有迄今所测试所有N-羟基磺酰胺型硝酰基供体的最有益毒理学特征，并且展示在以至少高达30μg/kg/min的浓度经静脉内投与时对于炎症的临床标记物并无不良效应(图4)。与之相反，CXL-1020在低达0.3μg/kg/min的浓度下即开始展示不需要的副作用。
4.5.1.2 缺血/再灌注损伤
在另一实施例中，所揭示标的物提供治疗、预防缺血/再灌注损伤或延迟其发作和/或发生的方法，其包含向有需要的个体投与有效量的如本文所揭示的化合物或医药组合物。
在一特定实施例中，所述方法是用于预防缺血/再灌注损伤。在一特定实施例中，在缺血发作之前投与本揭示内容的化合物或医药组合物。在一特定实施例中，在可发生心肌缺血的程序(例如血管成形术或手术，例如冠状动脉旁路移植手术)之前投与本揭示内容的医药组合物。在一特定实施例中，在缺血之后但在再灌注之前投与本揭示内容的医药组合物。在一特定实施例中，在缺血和再灌注之后投与本揭示内容的医药组合物。
在另一实施例中，可向处于缺血事件的风险下的患者投与本揭示内容的医药组合物。在一特定实施例中，向处于未来缺血事件的风险下但并无当前缺血证据的患者投与本揭示内容的医药组合物。可通过业内已知的任一方法来确定患者是否处于缺血事件的风险下，例如通过检验患者或患者病史。在一特定实施例中，患者具有先前缺血事件。因此，患者可处于第一或后续缺血事件的风险下。处于缺血事件的风险下的患者的实例包括具有以下状况的患者：已知高胆固醇血症、与缺血有关的EKG变化(例如在适当临床背景中的具峰或倒立T波或ST段升高或降低)、并非与活动性缺血有关的异常EKG、升高的CKMB、缺血临床证据(例如压榨性胸骨下胸痛或臂痛、呼吸短促和/或发汗)、心肌梗塞先前病史、升高的血清胆固醇、久坐生活方式、部分冠状动脉阻塞的血管造影证据、心肌损害的超声心动图证据或未来缺血事件风险的任一其它证据。缺血事件的实例包括但不限于心肌梗塞(MI)和神经血管缺血(例如脑血管意外(CVA))。
在另一实施例中，治疗个体是拟移植器官。在一特定实施例中，可在移植接受者中再灌注器官之前投与本揭示内容的医药组合物。在一特定实施例中，可在(例如)通过在器官取出过程中使用的灌注插管从供体取出器官之前投与本揭示内容的医药组合物。如果器官供体是活供体(例如肾脏供体)，那么可将本揭示内容的化合物或医药组合物投与器官供体。在一特定实施例中，通过将器官储存于包含本揭示内容的化合物或医药组合物的溶液中来投与所述化合物或医药组合物。举例来说，本揭示内容的化合物或医药组合物可包括于器官保存溶液(例如威斯康辛大学(University of Wisconsin)(“UW”)溶液，其是包含羟乙基淀粉的实质上不含乙二醇、氯乙烯醇和丙酮的溶液)中(参见美国专利第4,798,824号)。在一特定实施例中，投与本揭示内容的医药组合物，从而在移植器官的接受者中再灌注后减小器官组织的缺血/再灌注损伤。在一特定实施例中，所述方法减小风险组织中的组织坏死(梗塞大小)。
缺血/再灌注损伤可损害除那些心肌组织外的组织且所揭示标的物涵盖治疗或预防所述损害的方法。在各种实施例中，缺血/再灌注损伤是非心肌性。在特定实施例中，所述方法减小脑、肝、肠管、肾脏、肠或除心肌外的任一身体部分的组织中来自缺血/再灌注的损伤。在另一实施例中，患者处于所述损伤的风险下。选择处于非心肌性缺血的风险下的人员可包括测定用于评价心肌缺血风险的指示剂。然而，其它因素可指示其它组织中的缺血/再灌注风险。举例来说，手术患者通常经历手术相关性缺血。因此，打算进行手术的患者可视为处于缺血事件的风险下。下列中风风险因素(或这些风险因素的子组)可显示患者的脑组织缺血风险：高血压、吸烟、颈动脉狭窄、体力活动缺乏、糖尿病、高脂血症、短暂性缺血发作、心房颤动、冠状动脉疾病、充血性心力衰竭、陈旧性心肌梗塞、具有附壁血栓的左心室功能障碍和二尖瓣狭窄。英戈尔(Ingall)，研究生医学期刊(Postgrad.Med).107(6):34-50(2000)。另外，老人中未治疗感染性腹泻的并发症可包括心肌、肾脏、脑血管和肠缺血。斯洛文涅(Slotwiner-Nie)等人，北美临床胃肠病学(Gastroenterol.Clin.N.Amer.)30(3):625-635(2001)。另一选择为，可基于关于肠、肾脏和/或肝缺血疾病的风险因素来选择患者。举例来说，在处于低血压性发作(例如手术血液损失)的风险下的老年患者中开始治疗。因此，呈现所述适应症的患者可视为处于缺血事件的风险下。在另一实施例中，患者患有本文所列示病状中的任一者或多者，例如糖尿病和高血压。其它可导致缺血的病状(例如脑动静脉畸形)，可显示患者的缺血事件风险。
4.5.2 肺高血压
在另一实施例中，可使用本揭示内容的化合物或医药组合物来预防肺高血压或延迟其发作和/或发生。在一所述实施例中，可使用本揭示内容的化合物或医药组合物来预防肺动脉高血压(PAH)或延迟其发作和/或发生。
在另一实施例中，所揭示标的物提供减小平均肺动脉压(MPAP)的方法，其包含向有需要的患者投与有效量的本文所揭示的化合物或医药组合物。在另一实施例中，MPAP减小至多约50％。在另一实施例中，MPAP减小至多约25％。在另一实施例中，MPAP减小至多约20％。在另一实施例中，MPAP减小至多约15％。在另一实施例中，MPAP减小至多10％。在另一实施例中，MPAP减小至多约5％。在另一实施例中，将MPAP从约12mmHg减小到约16mmHg。在另一实施例中，将MPAP减小到约15mmHg。
4.6投与模式、方案和剂量值
可通过胃肠外(例如皮下、肌内、静脉内或皮内)投与来投与本揭示内容的化合物和医药组合物。在某些实施例中，通过静脉内输注来投与化合物或医药组合物。在其它实施例中，可通过经口投与来投与本揭示内容的化合物和医药组合物。
在投与包含本揭示内容的化合物的医药组合物时，基于活性医药成份的量(也就是医药组合物中存在的本揭示内容的硝酰基供体化合物的量)来表示剂量。
对于静脉内投与来说，剂量可有用地根据单位时间以每单位时间的固定量或每单位时间的基于重量的量的形式来表示。
在各种实施例中，以以下量经静脉内投与本揭示内容的化合物或医药组合物：至少约0.1μg/kg/min、至少约0.2μg/kg/min、至少约0.3μg/kg/min、至少约0.4μg/kg/min、至少约0.5μg/kg/min、至少约1μg/kg/min、至少约2.5μg/kg/min、至少约5μg/kg/min、至少约7.5μg/kg/min、至少约10μg/kg/min、至少约11μg/kg/min、至少约12μg/kg/min、至少约13μg/kg/min、至少约14μg/kg/min、至少约15μg/kg/min、至少约16μg/kg/min、至少约17μg/kg/min、至少约18μg/kg/min、至少约19μg/kg/min、至少约20μg/kg/min、至少约21μg/kg/min、至少约22μg/kg/min、至少约23μg/kg/min、至少约24μg/kg/min、至少约25μg/kg/min、至少约26μg/kg/min、至少约27μg/kg/min、至少约28μg/kg/min、至少约29μg/kg/min、至少约30μg/kg/min、至少约31μg/kg/min、至少约32μg/kg/min、至少约33μg/kg/min、至少约34μg/kg/min、至少约35μg/kg/min、至少约36μg/kg/min、至少约37μg/kg/min、至少约38μg/kg/min、至少约39μg/kg/min或至少约40μg/kg/min。
在各种实施例中，以以下量经静脉内投与本揭示内容的化合物或医药组合物：不高于约100μg/kg/min、不高于约90μg/kg/min、不高于约80μg/kg/min、不高于约70μg/kg/min、不高于约60μg/kg/min、不高于约50μg/kg/min、不高于约49μg/kg/min、不高于约48μg/kg/min、不高于约47μg/kg/min、不高于约46μg/kg/min、不高于约45μg/kg/min、不高于约44μg/kg/min、不高于约43μg/kg/min、不高于约42μg/kg/min、不高于约41μg/kg/min、不高于约40μg/kg/min、不高于约39μg/kg/min、不高于约38μg/kg/min、不高于约37μg/kg/min、不高于约36μg/kg/min、不高于约35μg/kg/min、不高于约34μg/kg/min、不高于约33μg/kg/min、不高于约32μg/kg/min、不高于约31μg/kg/min或不高于约30μg/kg/min。
在一些实施例中，以以下范围的量经静脉内投与本揭示内容的化合物或医药组合物：约0.1μg/kg/min到约100μg/kg/min、约1μg/kg/min到约100μg/kg/min、约2.5μg/kg/min到约100μg/kg/min、约5μg/kg/min到约100μg/kg/min、约10μg/kg/min到约100μg/kg/min、约1.0μg/kg/min到约80μg/kg/min、约10.0μg/kg/min到约70μg/kg/min、约20μg/kg/min到约60μg/kg/min、约15μg/kg/min到约50μg/kg/min、约0.01μg/kg/min到约1.0μg/kg/min、约0.01μg/kg/min到约10μg/kg/min、约0.1μg/kg/min到约1.0μg/kg/min、约0.1μg/kg/min到约10μg/kg/min、约1.0μg/kg/min到约5μg/kg/min、约70μg/kg/min到约100μg/kg/min或约80μg/kg/min到约90μg/kg/min。
在特定实施例中，以以下范围的量经静脉内投与本揭示内容的化合物或医药组合物：约10μg/kg/min到约50μg/kg/min、约20μg/kg/min到约40μg/kg/min、约25μg/kg/min到约35μg/kg/min或约30μg/kg/min到约40μg/kg/min。在特定实施例中，以约20μg/kg/min到约30μg/kg/min的量经静脉内投与本揭示内容的化合物或医药组合物。
在各种实施例(包括各种经口投与实施例)中，根据基于重量的日投药方案以单一日剂量(QD)或多个分开剂量来投与本揭示内容的化合物或医药组合物，例如以每天两次(BID)、每天三次(TID)或每天四次(QID)的形式投与。
在某些实施例中，以以下剂量投与本揭示内容的化合物或医药组合物：至少约0.5mg/kg/d、至少约0.75mg/kg/d、至少约1.0mg/kg/d、至少约1.5mg/kg/d、至少约2mg/kg/d、至少约2.5mg/kg/d、至少约3mg/kg/d、至少约4mg/kg/d、至少约5mg/kg/d、至少约7.5mg/kg/d、至少约10mg/kg/d、至少约12.5mg/kg/d、至少约15mg/kg/d、至少约17.5mg/kg/d、至少约20mg/kg/d、至少约25mg/kg/d、至少约30mg/kg/d、至少约35mg/kg/d、至少约40mg/kg/d、至少约45mg/kg/d、至少约50mg/kg/d、至少约60mg/kg/d、至少约70mg/kg/d、至少约80mg/kg/d、至少约90mg/kg/d或至少约100mg/kg/d。
在某些实施例中，以以下剂量投与本揭示内容的化合物或医药组合物：不高于约100mg/kg/d、不高于约100mg/kg/d、不高于约90mg/kg/d、不高于约80mg/kg/d、不高于约80mg/kg/d、不高于约75mg/kg/d、不高于约70mg/kg/d、不高于约60mg/kg/d、不高于约50mg/kg/d、不高于约45mg/kg/d、不高于约40mg/kg/d、不高于约35mg/kg/d、不高于约30mg/kg/d。
在各种实施例中，剂量为约0.001mg/kg/d到约10,000mg/kg/d。在某些实施例中，剂量为约0.01mg/kg/d到约1,000mg/kg/d。在某些实施例中，剂量为约0.01mg/kg/d到约100mg/kg/d。在某些实施例中，剂量为约0.01mg/kg/d到约10mg/kg/d。在某些实施例中，剂量为约0.1mg/kg/d到约1mg/kg/d。在某些实施例中，剂量小于约1g/kg/d。
在某些实施例中，以如下剂量范围投与本揭示内容的化合物或医药组合物：其中所述范围的下端是约0.1mg/kg/天到约90mg/kg/天的任一量且所述范围的上端是约1mg/kg/天到约100mg/kg/天的任一量(例如在一系列实施例中为约0.5mg/kg/天到约2mg/kg/天且在另一系列实施例中为约5mg/kg/天到约20mg/kg/天)。
在特定实施例中，以约3mg/kg到约30mg/kg的剂量范围投与本揭示内容的化合物或医药组合物，以每天一次(QD)到每天三次(TID)的形式投与。
在某些实施例中，根据平坦(也就是非基于重量)投药方案以单一日剂量(QD)或多个分开剂量来投与本揭示内容的化合物或医药组合物，例如以每天两次(BID)、每天三次(TID)或每天四次(QID)的形式投与。
在各种实施例中，以以下剂量投与本揭示内容的化合物或医药组合物：至少约0.01克/天(g/d)、至少约0.05g/d、至少约0.1g/d、至少约0.5g/d、至少约1g/d、至少约1.5g/d、至少约2.0g/d、至少约2.5g/d、至少约3.0g/d或至少约3.5g/d。
在各种实施例中，以以下剂量投与本揭示内容的化合物或医药组合物：不高于约5g/d、不高于约4.5g/d、不高于约4g/d、不高于约3.5g/d、不高于约3g/d、不高于约2.5g/d或不高于约2g/d。
在某些实施例中，以约0.01克/天到约4.0克/天的剂量投与本揭示内容的化合物或医药组合物。在某些实施例中，可以如下剂量范围投与本揭示内容的化合物或医药组合物：其中所述范围的下限是约0.1毫克/天到约400毫克/天的任一量，并且所述范围的上限是约1毫克/天到约4000毫克/天的任一量。在某些实施例中，以约5毫克/天到约100毫克/天的剂量投与化合物或医药组合物。在各种实施例中，以约150毫克/天到约500毫克/天的剂量投与化合物或医药组合物。
可根据患者需要来调节胃肠外或经口投与的投药间隔。对于较长投与间隔来说，可使用延迟释放或储积型调配物。
如本文所揭示的化合物或医药组合物可在投与其它治疗剂之前、实质上同时或之后投与。投与方案可包括使用其它治疗剂预先治疗和/或共投与。在所述情形下，化合物或医药组合物和其它治疗剂可同时、分开或依序投与。
投与方案的实例包括但不限于：以依序方式投与每一化合物、医药组合物或治疗剂；和以实质上同时的方式(例如以单一单位剂型)或以用于每一化合物、医药组合物或治疗剂的多个单独的单位剂型共投与每一化合物、医药组合物或治疗剂。
所属领域技术人员应了解，“有效量”或“剂量”(“剂量值”)取决于各种因素，例如所选择的特定投与模式、投与方案、化合物和医药组合物，以及所治疗的特定病状和患者。举例来说，适当剂量值可取决于以下因素而变化：所采用的具体化合物或医药组合物的活性、排泄速率和毒性可能；所治疗患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；投与频率；共投与的其它治疗剂；以及病状的类型和严重程度。
4.7包含化合物或医药组合物的试剂盒
本揭示内容提供包含本文所揭示的化合物或医药组合物的试剂盒。在一特定实施例中，试剂盒包含本文所揭示的化合物或医药组合物(各自呈干燥形式)和医药上可接受的液体稀释剂。
在特定实施例中，呈干燥形式的化合物或呈干燥形式的医药组合物含有约2.0重量％或更少水、约1.5重量％或更少水、约1.0重量％或更少水、约0.5重量％或更少水、约0.3重量％或更少水、约0.2重量％或更少水、约0.1重量％或更少水、约0.05重量％或更少水、约0.03重量％或更少水或约0.01重量％或更少水。
业内已知医药上可接受的液体稀释剂且包括但不限于无菌水、盐水溶液、右旋糖水溶液、甘油、甘油溶液和诸如此类。适宜液体稀释剂的其它实例揭示于奈恩(Nairn)，“(溶液、乳液、悬浮液和萃取物(Solutions,Emulsions,Suspensions and Extracts))”，第721-752页，雷明顿：药物科学与实践，第20版(利平科特威廉姆斯与威尔金斯公司，巴尔的摩，马里兰州，2000)中。
在一实施例中，试剂盒进一步包含使用化合物或医药组合物的说明书。说明书可呈任一适当形式，例如书面或电子形式。在另一实施例中，说明书可为书面说明书。在另一实施例中，说明书含于电子储存介质(例如磁盘或光盘)中。在另一实施例中，说明书包括关于化合物或医药组合物和将化合物或医药组合物投与患者的方式的信息。在另一实施例中，说明书涉及本文所揭示的使用方法(例如治疗、预防选自心血管疾病、缺血/再灌注损伤、肺高血压和其它对硝酰基疗法具有反应的病状的病状和/或延迟其发作和/或发生)。
在另一实施例中，试剂盒进一步包含适宜封装。在试剂盒包含一种以上的化合物或医药组合物的情形下，可将化合物或医药组合物耐心地封装于单独容器中，或组合于一个容器(在交叉反应性和储架寿命允许时)中。
5.实例
呈现下列实例以用于阐释性目的且不应用于限制所揭示标的物的范围。
5.1 化合物的合成
可根据下文所揭示的方法或通过业内已知程序来制备本文所揭示的化合物。用于反应的起始材料可购得或可通过已知程序或其明显修改制得。举例来说，一些起始材料可购自商业供应商，例如西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(圣·路易斯(St.Louis)，密苏里州(MO))。其它起始材料可通过揭示于诸如以下标准参考文件中的程序或其明显修改制得：马奇高等有机化学(March’s Advanced Organic Chemistry)(约翰威利父子公司(John Wiley and Sons))和拉罗奇综合性有机转化(Larock’s Comprehensive OrganicTransformations)(VCH出版社)。
实例1：N-羟基-5-甲基呋喃-2-磺酰胺(1)的制备
向存于THF(6mL)和水(2mL)中且冷却到0℃的羟基胺(0.92mL 50％水溶液；13.8mmol)的溶液中逐滴添加存于THF(6mL)中的5-甲基呋喃-2-磺酰氯(1g,5.5mmol)的溶液以维持温度低于10℃。将反应液搅拌5分钟，然后TLC(1:1己烷:乙酸乙酯(H:EA))展示磺酰氯实质上完全消耗。使用50mL二氯甲烷(DCM)将反应液稀释两次且分离有机部分并使用水(10mL)洗涤。通过硫酸钠干燥有机部分，过滤并在减压下浓缩。通过硅胶管柱(使用庚烷:EtOAc洗脱)对产物实施色谱分析，随后使用庚烷研磨以提供黄色固体形式的标题化合物(0.59g，产率为61％)。LC-MS tR＝0.91min；1H NMR(DMSO,500MHz)δppm 9.82(1H,d,J＝3.1Hz),9.64(1H,d,J＝3.2Hz),7.10(1H,d,J＝3.4Hz),6.36(1H,d,J＝3.4Hz),2.36(3H,s)。
实例2：N-羟基-3-甲磺酰基苯-1-磺酰胺(2)的制备
3-甲磺酰基苯-1-磺酰氯
根据揭示于帕克等人，医药化学期刊(J.Med.Chem.)51(21):6902-6915(2008)中的方法合成中间体3-甲磺酰基苯-1-磺酰氯。具体来说，将甲基磺酰基苯(110g,0.7mol)在90℃下于氯磺酸(450mL,6.7mol)中加热18小时，然后将反应混合物冷却到约21℃的温度，随后缓慢倾倒于碎冰上。使用EtOAc(每次萃取使用2L)将所得浆液萃取两次。合并有机部分并使用盐水(50mL)洗涤，然后通过硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩以提供灰白色固体形式的中间体磺酰氯(125g，产率为75％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 8.61(1h,t,J＝1.7Hz),8.35-8.31(2H,m),7.90(1H,t,J＝7.9Hz),3.15(3H,s)。
N-羟基-3-甲磺酰基苯-1-磺酰胺
向存于THF(150mL)和水(25mL)中且冷却到-5℃的羟基胺(16mL 50％水溶液，245mmol)的水溶液中缓慢添加3-甲磺酰基苯-1-磺酰氯(25g,98mmol)，同时维持反应温度小于10℃。将反应液维持于此温度下直到观察到磺酰氯实质上完全消耗为止(约5min)，然后使用DCM(250mL)稀释反应液，分离有机部分并使用50mL水洗涤两次。合并水性萃取物并使用DCM(每次洗涤使用250mL)再洗涤两次。合并所有有机部分，通过硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩以提供灰棕色固体形式的标题化合物。使用庚烷:EtOAc(1:1；v:v)实施研磨以提供灰棕色固体形式的标题化合物(14g，产率为56％)。LC-MS tR＝0.90min；高分辨率质谱(HRMS)：理论值(C7H9NO5S2)＝249.9844，测量值＝249.9833；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm9.85(2H,q,J＝3.3Hz),8.31(1H,t,J＝1.6Hz),8.28(1H,dt,J＝7.8,1.3Hz),8.14-8.19(1H,m),7.93(1H,t,J＝7.9Hz),3.32(3H,s)。
5.2实例3：如通过N2O量化所测定的硝酰基产生
氧化亚氮(N2O)是通过HNO的二聚合和脱水产生，并且是用于硝酰基产生的最常见标记物(服藤(Fukuto)等人，毒理学中的化学研究(Chem.Res.Toxicol.)18:790-801(2005))。然而，硝酰基还可部分地由氧淬灭以提供并不产生N2O的产物(参见明乔内(Mincione)等人，酶抑制期刊(J.Enzyme Inhibition)13:267-284(1998)；和斯科扎法瓦(Scozzafava)等人，医药化学期刊，43:3677-3687(2000))。使用氧化亚氮气体或安格里盐(Angeli’s salt，AS)作为标准，通过气相色谱(GC)顶部空间分析来检验从本揭示内容的化合物释放的N2O的相对量。
用于测定从本揭示内容的化合物释放的N2O的相对量的程序如下。在安捷伦(Agilent)气相色谱上执行GC，所述安捷伦气相色谱配备有分流注射器(10:1分流)、微电子捕获检测器和HP-MOLSIV 30m×0.32mm×25μm分子筛毛细管柱。使用氦作为载剂(4mL/min)气体且使用氮作为补充(20mL/min)气体。将注射器烘箱和检测器烘箱分别保持于200℃和325℃。使用保持于200℃的恒定温度下的管柱烘箱执行所有氧化亚氮分析。
使用自动化顶部空间分析仪进行所有气体注射。小瓶加压为15psi。将分析仪的试样烘箱、取样阀门和转移管线分别保持于40℃、45℃和50℃。烘箱稳定、小瓶加压、回路填充、回路平衡和试样注射时间分别为1.00min.、0.20min.、0.20min.、0.05min.和1.00min.。
所有测定都使用标称20mL顶部空间小瓶批次且出于试样均匀性对体积进行预测量(实际小瓶体积变化≤2.0％相对标准偏差(n＝6))。通过以下方式从6个随机选择小瓶测定批次的平均小瓶体积：使用去离子水的已知密度计算加盖且密封空(也就是空气填充)小瓶与加盖且密封去离子水填充小瓶之间的重量差，然后平均化。通过以下方式来制备空白试样：密封且加盖两个小瓶，然后各自使用轻微氩流吹扫20秒。通过以下方式来制备硝酰基标准：密封且密封4个小瓶，然后各自从贮气瓶使用3000ppm硝酰基标准的轻微流吹扫1分钟。
通过一式两份准确称量10±0.5mg CXL-1020且将其添加到每一4mL小瓶中来制备CXL-1020(N-羟基-2-甲磺酰基苯-1-磺酰胺)“标准”。使用自动吸管，将1mL氩吹扫无水DMF(西格玛-奥德里奇公司)添加到每一4mL小瓶中以形成用于每一试样的CXL-1020储备溶液，并且将小瓶加盖并摇动和/或超声波处理以确保在目测观察时完全溶解。使用自动吸管，向20mL小瓶中装填5mL PBS(在使用之前使用氩吹扫至少30min.)，使用氩吹扫至少20sec.，并且使用橡胶隔片密封。使用50μL注射器，将50μL CXL-1020储备溶液注射到每一含有PBS的20mL小瓶中。
如下所述来制备试样。一式两份，将18±1mg每一试样准确称量到每一4mL小瓶中。使用自动吸管，将1mL氩吹扫无水DMF添加到每一4mL小瓶中以形成用于每一试样的试样储备溶液，并且将小瓶加盖并摇动和/或超声波处理以确保在目测观察时试样完全溶解。使用自动吸管，向20mL小瓶中装填5mL PBS(在使用之前使用氩吹扫至少30min.)，使用氩吹扫至少20sec.，并且使用橡胶隔片密封。将小瓶在37℃下于干块加热器中平衡至少10min。。然后，使用50μL注射器，将50μL试样储备溶液注射到每一含有PBS的20mL小瓶中。然后将小瓶在37℃下于干块加热器中保持一定时间段，从而在干块加热器中消耗的时间加上在试样注射之前于自动化顶部空间分析仪烘箱中消耗的时间的总和等于所需培育时间。
自动注射的顺序如下：空白复制品1，空白复制品2，N2O标准复制品1，N2O标准复制品2，CXL-1020标准复制品1，CXL-1020标准复制品2，试样1复制品1，试样1复制品2，试样2复制品1，试样2复制品2等，最后是N2O标准复制品3和N2O标准复制品4。使用EXCEL试算表来输入由此测得的数据并计算对于每一培育时间来说每一试样的相对N2O产率(以百分比表示)。所获得结果提供于表2中。
表2.N2O顶部空间分析的结果
对于式(3)和(4)的化合物来说，如上所述进行测定，只是还如下所述来制备酶活化试样：(i)将50mg猪肝酯酶(PLE，E3019-20KU，粗制物，西格玛-奥德里奇公司)准确称量到20mL顶部空间小瓶中；(ii)使用自动吸管，添加5mL氩吹扫无水PBS以形成PLE储备溶液；(iii)将小瓶加盖且摇动以确保在目测观察时完全溶解；(iv)如上文所揭示来制备硝酰基供体的试样，只是添加4.75mL PBS而非5mL；和(v)使用自动吸管，然后向20mL小瓶中装填250μmL PLE储备溶液，随后添加试样。自动注射的顺序如下：空白复制品1，空白复制品2，N2O标准复制品1，N2O标准复制品2，CXL-1020标准复制品1，CXL-1020标准复制品2，试样1(无PLE)复制品1，试样1(无PLE)复制品2，试样1(具有PLE)复制品1，试样1(具有PLE)复制品2，试样2(无PLE)复制品1，试样2(无PLE)复制品2，试样2(具有PLE)复制品1，试样2(具有PLE)复制品2等，最后是N2O标准复制品3和N2O标准复制品4。
用于测定从本揭示内容的化合物释放的N2O的相对量的另一程序如下。在配备有1041人工注射器、电子捕获检测器和25m 分子筛毛细管柱的瓦里安(Varian)CP-3800仪器上执行GC。使用5.0级氮作为载剂(8mL/min)和补充(22mL/min)气体。将注射器烘箱和检测器烘箱分别保持于200℃和300℃。使用保持于150℃的恒定温度的管柱烘箱执行所有氧化亚氮分析。使用具有试样锁的100μL气密性注射器进行所有气体注射。在15mL琥珀色顶部空间小瓶中制备试样且出于试样均匀性对体积进行预测量(实际小瓶体积介于15.19mL到15.20mL之间)。向小瓶中装填5mL含有二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)的PBS，使用氩吹扫，并且使用橡胶隔片密封。将小瓶在37℃下于干块加热器中平衡至少10分钟。在10mM氢氧化钠中制备AS的10mM储备溶液，并且在乙腈或甲醇中制备硝酰基供体的溶液且在制备之后立即使用。从这些储备溶液，使用具有试样锁的100μL气密性注射器将50μL引入个别热平衡顶部空间小瓶中以提供0.1mM的最终基质浓度。然后将基质培育90分钟或360分钟。然后从顶部空间(60μL)取样且使用具有试样锁的气密性注射器连续5次注射到GC装置中。对于每一供体来说，重复此程序两个或更多个小瓶。
5.3. 实例4：硝酰基供体在血浆中的活体外稳定性
测试化合物(1)、化合物(2)和CXL-1020在血浆中的稳定性。分析系统包含(i)PBS或来自大鼠、狗或人类的血浆(至少3个供体，雄性，汇集)，pH 7.4下，和(ii)对于在血浆中实施的测试来说，抗凝血剂(肝素钠或柠檬酸钠)。在37℃下于PBS或血浆中且在上于摇动下培育每一测试化合物(5μM)。在7个以下取样时间点中的每一者处获取三份试样(n＝3)：0分钟、10分钟、30分钟、60分钟、90分钟、180分钟和360分钟。将试样立即与3体积(也就是3倍于PBS或血浆体积)含有1％甲酸的乙腈和内部标准组合以终止反应。在并无标准曲线下，执行测试化合物的AB SCIEX API 3000LC-MS/MS分析。使用峰面积反应比从剩余值百分比的图形来测定测试化合物的半衰期(T1/2)。所测得的半衰期提供于表3中。
表3.硝酰基供体的半衰期(T1/2)
为测量式(3)或式(4)的化合物的半衰期，在添加所述化合物之前，将猪肝酯酶(PLE)的储备溶液添加到PBS或血浆中。
5.4. 实例5：硝酰基供体的溶解度
首先，通过在100μg/mL和1000μg/mL下于pH 4缓冲剂中目测评价来测量式(1)和式(2)的化合物的溶解度。通过混合660mL溶液A(10.5023g溶于1L水中的柠檬酸)和450mL溶液B(14.7010g溶于1L水中的柠檬酸三钠二水合物)来制备缓冲剂。缓冲剂的pH为3.98，如通过pH计所测量。
将每一化合物在两种浓度点(100μg/mL和1000μg/mL)下于上文制得的pH 4缓冲剂溶液中摇动约5分钟且目测观察溶解度。所获得结果呈现于表4中。
表4.在100μg/mL和1000μ/mL下于pH 4缓冲剂中的溶解度
另外，在水中制备式(1)化合物的试样以测定化合物在不存在赋形剂(例如)下的近似溶解度。不考虑化合物的体积贡献，实现大约300mg/mL的浓度。试样的pH经测定为2.8，使用0.1N NaOH调节到4.0的目标。在pH调节后，观察少量固体发生沉淀。将澄清溶液稀释于乙腈中并通过HPLC分析，从而得到268mg/mL的观察溶液浓度。对式(2)化合物执行类似分析。式(2)化合物具有大约10mg/mL的溶解度。
5.5实例6：硝酰基供体在正常和心力衰竭犬(心动过速-起搏模型)中的血液动力学效能
5.5.1 材料和方法
借助压力-体积(PV)曲线(回路)分析在清醒、吊索束缚小猎犬中检验硝酰基供体的心血管效应。使动物在标准实验室条件下自由获取饮水和商业犬饮食。通过自动化计时器提供荧光照明大约12小时/天。偶尔地，暗循环因研究相关性活动而间歇性地中断。每天监测并记录温度和湿度且最大可能程度地分别维持于介于64℉与84℉之间和介于30％到70％之间。使狗在手术之前适应至少1周的时段。在手术和回收后，使动物适应吊索束缚长达4.5小时的时段。在手术之前使动物禁食过夜。
手术程序
麻醉
将留置静脉导管置于周边静脉(例如头部静脉)中以用于投与麻醉剂。使用丁丙诺啡(buprenorphine)(约0.015mg/kg)和随后的丙泊酚(propofol)静脉内浓注(约6mg/kg)经静脉内(浓注)诱导全身麻醉。另外，在诱导后给予预防性抗生素(20mg/kg到50mg/kg头孢唑林(cefazolin)，通过静脉内方式投与)。置放套囊气管导管且用于使用100％O2通过体积循环动物呼吸机使肺以机械方式换气(约12呼吸数/分钟且潮气量为约12.5mL/kg)以将PaCO2值维持于生理学范围内。使用吸入的异氟烷(1％到3％)维持麻醉。
心血管仪器装备
在已确立稳定(手术)麻醉平面后，执行左胸廓切开术(在严格无菌条件下)且对每一动物长期使用声纳微测量晶体仪器，从而提供左心室(LV)尺寸/体积。另外，将流体填充导管和固态压力计置于左心室中以用于压力监测。将流体填充导管置于右心室(RV)和主动脉(Ao)中以用于压力监测/测试物品投与。将水囊(因维美追思(In-Vivo Metrics))缩窄器置于/固定于下腔静脉(IVC)周围，从而使其在异量性自我调控期间可受控性地收缩以生成LV压力-体积曲线。使导管/导线以无菌方式在肩胛骨之间穿隧并外露。在研究过程中，定期(至少每周一次)使用封管溶液冲洗流体填充导管以防止凝血和细菌生长(2-3mL牛磺罗定(Taurolidine)-柠檬酸盐溶液，TCS-04；爱克斯技术公司(Access Technologies))。
起搏器植入
在心血管仪器装备后，小心暴露右颈静脉且插入双极起搏引线/导管(诺乌斯(Novus)；美敦力(Medtronic))。在透视导向下，将此起搏引线以顺行性推进到右心室中且以活动方式附着(拧入)到顶心内膜。将引线的近端固定到起搏器件(卡帕(Kappa)900；美敦力)。随后，将起搏器置入/固定于颈部的皮下袋。
考虑到通过胸廓切开术暴露心脏，将双极起搏导线固定于右心室中层心肌中。使此起搏引线在肩胛骨之间穿隧/外露，并且与外部脉冲生成器/起搏器结合使用。使用植入的心内膜起搏器作为外部/心外膜起搏器之后备。
恢复
在从胸廓切开术缝合胸腔之前，置入胸管以用于抽取任何从手术程序累积的流体和/或气体。每天使用管吸取两次直到在大约24小时时段内所取出流体的量小于35mL/吸取为止。然后去除胸腔管。
向所有动物投与预防性抗生素(20mg/kg到50mg/kg头孢唑林，通过静脉内方式投与)和疼痛剂(约0.2mg/kg美洛昔康(meloxicam)，通过静脉内方式投与)。如果需要，那么还投与其它镇痛剂，包括芬太尼(fentanyl)贴剂(25mcg/小时到50mcg/小时)。将所有手术切口缝合成层；使用可吸收缝线缝合底层肌肉组织且使用钉缝合皮肤。
在手术后，使动物恢复至少14天。每天两次在至少7天内经口投与头孢氨苄(cephalexin)(20mg/kg到50mg/kg)，并且在手术之后每天一次在至少2天内经口或经皮下投与美洛昔康(0.1mg/kg)。在整个恢复阶段，每天观察动物的常规恢复体征且观察伤口位点的潜在感染的任一体征。将经历疼痛、窘迫和/或感染的动物提请主治兽医和研究主管的注意。在手术之后使皮肤切口钉保持并不去除至少7天。
心力衰竭的诱导
在从手术恢复和/或从使用硝酰基供体投药的足够清除期后，对动物实施3周超速起搏(210ppm)方案以旨在触发与心力衰竭综合症一致的左心室功能障碍/重塑。简单来说，通过植入的起搏器/右心室引线，使心室以210次心跳/分钟(bpm)异步且连续地起搏。通过在大约3周起搏之后超声心动图(例如射血分数(EF)从约60％降低到约35％的目标，左心室(LV)扩张)和神经介质(例如N-末端前脑钠尿肽(NT proBNP)从约300pM/L的基线升高到大于1800pM/L)变化来证实左心室重塑(和心力衰竭诱导)。在不存在起搏下(至少15min)收集超声心动图和血样。
5.5.2 结果
血液动力学功效评价
在使用媒剂(对照)和硝酰基供体(CXL-1020、式(1)化合物或式(2)化合物)治疗期间研究动物(正常或心力衰竭)。在每一投药时段中，连续监测清醒吊索束缚动物长达二到三小时。在血液动力学稳定后，开始输注媒剂。然后立即借助简短腔静脉闭塞(通过血管闭塞器的短暂膨胀)急剧减小左心室前负荷以生成一系列力-体积曲线/回路；执行至多三个闭塞，从而实现测试之间的血液动力学恢复。继续输注媒剂且在30min之后收集另一组血液动力学数据(基线)。在收集基线血液动力学数据后，开始输注所测试的硝酰基供体化合物且在选自下列的至多四(4)个时间点获得/执行衍生的血液动力学/功能参数：在开始输注媒剂/测试化合物之后30分钟、60分钟、90分钟、120分钟和180分钟。对于安慰剂或时间对照治疗组来说，经至多180分钟向每一动物投与适当安慰剂的输注。在所有情形下，以1mL/kg/hr的恒定静脉内输注速率递送测试化合物且在摩尔等效的投药速率下进行比较。
分析所得左心室压力和体积数据以生成代表心肌的收缩和能量状态的关系。收集收缩性动脉压(SAP)、舒张性动脉压(DAP)和平均动脉压(MAP)。从压力(ESP、EDP、dP/dtmax/min、弛豫时间常数-τ[基于具有非零渐近线的单指数衰变])和体积(收缩末期体积(ESV)、舒张末期体积(EDV)、每搏输出量(SV))信号获得左心室机械和/或几何指数。此外，从在前负荷减小的短暂时段期间生成的左心室压力-体积数据(PV回路)衍生下列测量：压力体积面积(PVA)和每搏作功(SW)、收缩末期(ESPVR)和舒张末期(EDPVR)压力体积关系和收缩末期压力和每搏输出量关系(动脉弹性(Ea))。从正常狗和心力衰竭狗中的研究获得的代表性数据分别展示于表5和表6中。SVR(全身血管阻力)降低与血管舒张相关。
表5.正常犬中的硝酰基供体的血液动力学参数(从基线的变化％)
表6.心力衰竭犬中的硝酰基供体的血液动力学参数(从基线的变化％)
图1展示使用心力衰竭的心动过速-起搏模型在投与CXL-1020和本揭示内容的两种化合物(式(1)和式(2)的化合物)之后180分钟的血液动力学特征。以100μg/kg/min的速率经静脉内投与每一化合物。图2展示使用心动过速-起搏模型式(1)化合物在各种剂量下的心力衰竭血液动力学特征。结果显示，式(1)和(2)的化合物与CXL-1020在正常和衰竭犬模型中具有相当的血液动力学活性。特定来说，式(1)和(2)的化合物显著增强收缩力和舒张力，并且适度减小血压。
5.6实例7：硝酰基供体在心力衰竭犬(犬微血栓形成心力衰竭模型)中的血液动力学功效
5.6.1 材料和方法
使用健康、健壮、有目的饲喂的杂种狗(20-26kg)利用连续微血栓形成模型来产生心力衰竭。执行冠状动脉微血栓形成直到LV-射血分数(在麻醉下以血管造影术方式测得)为大约30％或更低为止。然后在最后微血栓形成之后空出两周以确保每一动物在开始实验之前稳定。
在3只狗中执行初始剂量探索研究(2-100μg/kg/min，40min)以确定式(1)化合物的治疗相关剂量。基于这些数据，研究6只动物的初级组，其经4小时时段接受3或10μg/kg/min式(1)化合物，随后是一小时的清除期。在特定之日仅研究一种剂量，在至少一周后研究另一剂量，并且顺序随机化。在左心和右心导管检查期间于麻醉狗中(诱导：氢吗啡酮(hydromorphone)(0.22mg/kg，静脉内)和地西泮(diazepam)(0.17mg/kg，静脉内)，维持：1-2％异氟烷(isofluorane))进行血液动力学、心室造影和超声心动图测量。
使用面积-长度方法从心室图计算LV收缩末期体积(ESV)和舒张末期体积(EDV)。使用用于测量峰值功率指数(PPI)的血流多普勒测定系统(flow Doppler)在升主动脉中获得峰值主动脉血流速度。从LV短轴影像在从2维超声心动图获得的乳头肌层面上测量LV缩短区分数(FAS)。LV舒张功能的所测量指数包括二尖瓣流入速度的减速时间(DT)、早期二尖瓣流入速度(Ei)对心房收缩期间速度(Ai)的积分比(Ei/Ai)和LV舒张末期周壁应力(EDWS)。
在基线时和在10μg/kg/min输注之后4小时测量心肌耗氧量。具体来说，在基线时和在每一研究时间点结束时同时汲取动脉和冠状窦血样。使用血氧仪测定氧含量。使用置于邻近第一边缘枝的左回旋支冠状动脉中或置于紧邻第一对角枝的冠状动脉左前降支中的多普勒血流速度导丝测量冠状动脉血流速度。通过计算来自冠状血管造影术的速度测量位点处的冠状动脉的横截面面积来估计血流量。假定总冠状血流量为在回旋支或左前降支冠状动脉中测量的流量的两倍。将左心室耗氧量(MVO2)计算为总冠状血流量与动脉和冠状窦血液之间的氧含量差的乘积。
5.6.2 结果
血液动力学功效评价
在使用媒剂和硝酰基供体治疗期间研究动物。图3展示在使用犬微血栓形成心力衰竭模型评估的狗中诱导心力衰竭后式(1)化合物的血液动力学特征。展示在两种输注速率输注期间最终时间点的数据。结果显示，式(1)化合物与CXL-1020具有相当的血液动力学活性。
5.7使用硝酰基供体的毒理学研究
5.7.1 实例8：使用CXL-1020的活体内试验
在硝酰基供体CXL-1020(N-羟基-2-甲磺酰基苯-1-磺酰胺)的活体内试验期间，实施14天研究以评估以至多90μg/kg/min的投药速率使用CXL-1020的连续输注治疗的狗的耐受性。此第一研究发现，在以60μg/kg/min的投药速率投与时，CXL-1020较为耐受。然而，出人意料地，在60μg/kg/min投药速率下观察到与炎症过程一致的临床病理学变化，如炎症的临床病理学标记物变化所反映。为进一步探究此不需要的副作用，开始狗的随访14天研究。随访研究需要在仅4天之后终止，这是因为出现以下其它不需要的副作用：在以手术方式植入输注导管的狗后肢中意外发生显著肿胀和炎症，其不时地干扰正常肢功能；在腹股沟区域中皮肤褪色；活动性降低；无食要；和在最高剂量组中，皮肤冷触摸。
为确定炎症和后肢肿胀的病因，在随后6个月中实施一系列72小时连续输注探究性研究。那些研究的结果展示，在以稀释到5％右旋糖水溶液中的CXL-1020:摩尔比率为1:1的pH 4调配物投与时，CXL-1020引起与在狗中在大于或等于0.03μg/kg/min的投药速率下的炎症过程一致的临床病理学变化。在股静脉中的导管插入位点周围(导管尖端上游15cm)、导管尖端和导管尖端下游观察到血管炎症。第一炎症位点(导管插入位点)导致在早期终止的随访研究中观察到的狗后肢肿胀和炎症。将输注液的pH从4增加到6会降低炎症，从而将炎症性特征改良大约3倍。然而，在狗中在以大于或等于3μg/kg/min的投药速率投与CXL-1020时，仍显示显著不需要的副作用。
为避免导管插入位点的相关副作用且评价血管炎症是否是由植入导管的设计所致，使用置于周边(头部)静脉中的经皮导管在狗中实施24小时连续输注研究。在6小时输注之后，在导管尖端下游的上前肢中观察到显著水肿。在24小时输注之后，检测到类似于在使用植入中心导管的先前研究中所观察的那些结果的临床病理学变化。还检测显微病理学，其显示在导管尖端处具有严重血栓性静脉炎且进一步显示在导管尖端下游具有减轻严重程度的梯度。
为确定在较长持续时间投药后在人类中是否发生局部静脉炎，在健康志愿者中实施较长持续时间研究。较长持续时间研究包括剂量递增研究，其中以10μg/kg/min、20μg/kg/min和30μg/kg/min的投药速率向10名志愿者的小组依序投与CXL-1020的24小时连续输注，并且在每一小组之间进行安全性评价。每一小组由2个安慰剂治疗和8个活性剂治疗组成，其具有1个活性剂和1个安慰剂的标记对和随后1个安慰剂治疗和7个活性剂治疗的主组。输注是通过插入前臂静脉的经皮导管进行。在12小时输注之后，将导管转向对侧臂。发现10μg/kg/min的投药速率(24小时)耐受良好。在第二小组中，经24小时投与20μg/kg/min的剂量，在2名安慰剂治疗的志愿者中并无不良发现，但在具有输注位点静脉炎的所有8名个体中具有轻微发现(临床体征和/或临床病理学变化)。基于这些结果，中止较长持续时间安全性研究。
继续探索性研究以确定CXL-1020在较高但仍在临床上所需剂量下的不需要的副作用的病因。使用CXL-1020副产物(在硝酰基供予之后剩余的部分)实施的研究为阴性，从而指示CXL-1020的副作用可归因于母体化合物CXL-1020或从其产生的HNO。使用在结构上与CXL-1020无关但针对硝酰基供予具有类似半衰期(约2分钟的半衰期)的替代硝酰基供体来实施研究。对于这些供体来说，在导管尖端和紧邻插入导管的静脉下游处，硝酰基处于其最高血管内浓度下。在所有情况下，在导管尖端处观察到局部血管副作用。这些结果表明，炎症是由从短半衰期硝酰基供体迅速释放的硝酰基引起。
5.7.2 实例9：本揭示内容的化合物相对于CXL-1020拥有增进的毒理学特征
在雄性和雌性小猎犬中实施研究。使动物在标准实验室条件下自由获取饮水和商业犬饮食。在由研究方案指示进行血样收集之前，使动物禁食。通过自动化计时器提供荧光照明大约12小时/天。偶尔地，暗循环因研究相关性活动而间歇性地中断。每天监测并记录温度和湿度且最大可能程度地分别维持于介于64℉到84℉之间和介于30％到70％之间。使狗适应至少1周的时段。在此时段期间，每周称量动物并观察总体健康状况和任一疾病体征。使动物在剂量投与之前适应戴夹套至少三天。另外，还使动物在夹套适应期间适应戴伊式颈圈(Elizabethan collar)(e-颈圈)。
手术程序和投药程序
在剂量投与之前一天向动物插入导管。将经皮导管置入(使用无菌技术和无菌绷带包扎)于肘部远端的头部静脉中。在连续输注剂量投与期间，动物在其笼中自由移动。为促进连续输注剂量投与，将周边导管附接到取道犬夹套下方的延长部分且然后附接到系链输注系统。为防止动物接近/去除周边置放的经皮导管，在治疗持续时间(也就是插入导管时段)内使用维特卷(Vet Wrap)包扎导管位点且将e-颈圈置于动物上。在预治疗时段期间，以大约2-4mL/hr的速率向静脉导管连续输注0.9％注射用氯化钠(USP，盐水)以维持导管通畅。在投药之前，使用相应投药溶液预填充输注系统(缓慢浓注输注)以确保在开启输注泵后立即开始投药。将输注管线连结到含有对照或测试化合物的储存器且开始输注。以预定恒定输注速率(1mL/kg/hr或2mL/kg/hr)将测试组合物连续输注24小时，并且在摩尔等效投药速率下进行比较。
临床观察、临床病理学和显微病理学
每天两次执行每一动物的详细临床检验且在投药前和开始组合物输注后6小时、12小时、24小时和72小时从所有动物收集体温测量和用于临床病理学的血样。在终止研究之后，在预期尸检时将所有动物无痛致死且执行完整尸检检验。收集所选组织，固定并储存以用于可能的未来显微检验。沿臂静脉完整解剖含有输注导管的头部静脉并沿其整个长度进行检验。将导管尖端的位置标志于未固定样品上。在固定之后，修整样品并处理至滑动以提供代表导管尖端和导管尖端的近端和远端的周围组织(也就是在导管尖端远端1cm处；在导管尖端处，和在导管尖端近端1cm、5cm、10cm、15cm和20cm处)的横切组织学切片。相对于导管尖端，“近端”定义为更接近心脏且“远端”定义为远离心脏。
安全性评价
在式(1)、式(2)的化合物和CXL-1020的一些投药速率下观察到与炎症性综合症一致的临床病理学变化。将每一化合物与(7％w/v)在pH 4下于无菌水中一起调配。炎症的最敏感生物标记物为：(1)白细胞计数(WBC，通过使图4最右端部分中的值乘以103以(白细胞数)/μL形式来获得)，(2)纤维蛋白原浓度(以mg/dL形式在图4的最右端部分中给出)，和(3)C-反应蛋白(CRP)浓度(以mg/L形式在图4的最右端部分中给出)。变化严重程度取决于化合物的身份和投与所述化合物的投药速率(图4)。在图4中，根据所述图中的最右端部分，将介于0(低严重程度)到2(高严重程度)之间的评分指配到炎症的这些生物标记物中的每一者。从这些标记物评分的总和计算累积评分。NOAEL(基于这些临床病理学标记物测定并表示为CXL-1020的摩尔等效投药速率(μg/kg/min))提供于表7中。
表7.硝酰基供体的无可观察不良效应量(NOAEL)
对于CXL-1020来说，即使在低达0.03μg/kg/min的浓度下，还观察到WBC、纤维蛋白原和CRP显著升高。式(1)化合物和式(2)化合物在各剂量下各自具有显著高于CXL-1020的NOAEL。式(1)化合物具有最有益毒理学特征，其展示在至少高达20μg/kg/min的剂量下并无不良效应。此代表相对于CXL-1020增进大于660倍。
总而言之，这些发现表明，CXL-1020输注会引起炎症性综合症，使用式(1)化合物和式(2)化合物体会实质上减少此情形。
所述发现表明，在导管尖端、导管尖端下游和(在某些情况下)导管尖端上游与CXL-1020有关的不需要的血管副作用是由硝酰基释放引起的局部炎症所致。另外，据假设，在这些位点处使用较长半衰期硝酰基供体可显著减轻炎症。此可通过以下方式来证实：借助血管系统在股静脉插入位点处(在导管尖端远端15cm)、沿导管到导管尖端的轨迹和越过尖端下游20cm处的详细组织病理学来评估硝酰基供体。在硝酰基供体的特定投药速率下测定水肿、失血、血管炎症和血管周围炎症的显微病理学发现。
图5绘示展示显微病理学发现的复合实验室评分的“热图”，其中在如上文所描述的血管系统中对血管炎症、失血、血栓和血管退化/再生的严重程度进行评分。在始于导管尖端远端1cm(上游)且前进到导管尖端近端20cm(下游)的血管切片中对(1)水肿、(2)血管和血管周围炎症和(3)失血的发现进行评分(各自指配选自以下的值：0＝在正常限值内；1＝最小；2＝轻度；3＝中等；4＝严重)。从这些发现评分的总和计算复合实验室评分。在图5中，累积组织学复合实验室评分介于0-2(低严重程度)到11-12(高严重程度)之间。据观察，显微变化的严重程度和距导管尖端的距离(其中检测所述显微变化)取决于硝酰基供体的身份和投与硝酰基供体的投药速率。NOAEL值(基于用于一系列硝酰基供体的这些显微病理学标记物测定并表示为CXL-1020的摩尔等效投药速率(μg/kg/min))提供于表8中。
表8.硝酰基供体的无可观察不良效应量(NOAEL)
呈现于表8中的发现提供式(1)和式(2)的化合物相对于CXL-1020具有实质上增进的毒理学特征的额外证据。任一剂量下的血管副作用的严重程度随距导管尖端的距离而降低，并且所述血管副作用的严重程度随剂量的降低而降低。这些发现证实，式(1)和式(2)的化合物具有较大安全余裕，此可转变为人类中的实质性治疗指数和用于以治疗有效的剂量和投药速率经静脉内投与的适用性。
5.8静脉内投药溶液的稳定性
5.8.1 实例10：储存于25℃下的式(1)化合物-投药溶液
在25℃下于48小时内评价从稀释到市售IV稀释剂中的浓缩物制得的式(1)化合物的投药溶液的稳定性，并且分析点位于稀释之后0、8、12、16、24和48小时。因所需的分析点，使用单独投药溶液组实施两个研究。第一组(A组)涵盖除16小时外的所有时间点。第二组(B组)仅需在0小时和16小时下进行分析。从相同批号的冻干药物产品(24mg/mL式(1)化合物/30％)的两个单独小瓶来制备用于制备两组投药溶液的浓缩物。
浓缩物制备
使用10mL注射质量水(WFI)重构一小瓶冻干药物产品(24mg/mL式(1)化合物/30％pH 4)以制备每一浓缩物(用于投药溶液的A组和B组)。测量所得溶液的pH值，并且经测定两个小瓶为大约3.9。并不执行pH调节。稀释浓缩物并通过HPLC(西丽格(Xbridge)苯基管柱(沃特斯(Waters))；UV吸光度检测器，272nm；流动相：含有0.1％(v/v)甲酸的乙腈水溶液的分级梯度)分析，并且两种浓缩物经测定含有20-21mg/mL式(1)化合物而非24mg/mL的标称值，此表面上是由于所溶解API和对于总溶液体积的贡献。
稀释剂制备
选择市售乙酸钾和磷酸钾溶液用于评估。获得商业乙酸钾，并且根据用于商业产品的郝普拉(Hospira)产品插页来制备USP磷酸钾溶液。将每一溶液以10mM稀释于5％右旋糖(D5W)和2.5％右旋糖(D2.5W)中。使用WFI质量水将市售D5W稀释2倍以产生D2.5W溶液。测量每一浓缩且稀释溶液的pH；结果呈现于表9中。
表9.所选稀释剂的pH测量结果
投药溶液制备
以5mL规模体积将式(1)化合物浓缩物稀释到10mM稀释剂溶液中以实现8mg/mL、1mg/mL和0.1mg/mL的式(1)化合物浓度，如表10中所汇总。一式两份制备每一试样。减小10％溶液中的右旋糖含量以确保投药溶液实质上等渗。将每一溶液储存于25℃下。
表10.用于稳定性评估的投药溶液的制备
试样分析
在制备后和在储存于25℃下8、12、16、24和48小时之后分析试样。观测每一试样的目测外观，测量pH，并且通过HPLC分析每一试样中主要降解物(式(5)化合物，绘示于下文中，在释放HNO基团之后形成)的浓度和存在。
结果
稳定性评估的结果呈现于表11、表12和表13中。对应于试样中降解物(式(5)化合物)的峰的存在由“X”表示。
在试样对内和在A组和B组中制备的相应投药溶液之间每一复制物的结果通常一致。对于含有存于磷酸盐中的0.1mg/mL式(1)化合物的制备试样来说，在复制物之间于24小时和48小时时间点处观察到回收差异。
对于制成存于基于乙酸盐和磷酸盐的稀释剂中的8mg/mL式(1)化合物的试样来说，在48小时内维持完全回收(在HPLC方法的准确度内)和不存在可检测量的式(5)化合物的峰。这些试样实际上含有大约7mg/mL式(1)化合物，这与浓缩物中20-21mg/mL式(1)化合物的浓度一致。在两种稀释剂中，制成8mg/mL式(1)化合物的试样的稳定性优于制成较低浓度的试样。不受限于理论，这些试样与那些制成较低式(1)化合物浓度者相比的优选稳定性可归因于较高浓度(10％，存于稀释溶液中)。
所有试样在48小时储存中都保持澄清和无色。所有试样的pH都随时间而降低。在t0(在制备试样后即刻)于所有含有0.1mg/mL式(1)化合物的制备试样中和在所有后续时间点时于所有含有0.1mg/mL和1mg/mL式(1)化合物的制备试样中都观察到已知降解物(式(5)化合物)。
一般来说，稳定性随式(1)化合物的浓度的降低而降低。不受限于理论，降低的稳定性可能是由于投药溶液的较低百分比。在含有存于基于乙酸盐和磷酸盐的稀释剂中的0.1mg/mL式(1)化合物的制备试样中，初始降解程度(经16小时)类似。然而，含有1mg/mL的制备试样的稳定性显示在乙酸盐中的稳定性显著优于磷酸盐。
表11. 25℃下的投药溶液稳定性评估结果，回收百分比
表12. 25℃下的投药溶液稳定性评估结果，pH
表13. 25℃下的投药溶液稳定性评估结果-测量式(5)化合物的外观
5.8.2 实例11：储存于2℃-8℃下随后储存于25℃下的式(1)化合物-投药溶液
如实例10中所描述来评价从稀释到市售IV稀释剂中的浓缩物制得的式(1)化合物的投药溶液的稳定性。在2℃-8℃下于24小时内评价溶液，随后在25℃下储存48小时。如表14中所展示，对于所有投药溶液来说，式(1)化合物的回收率通常高于储存于25℃下的相应试样(参见来自先前实例的表12)，从而表明在储存于25℃下之前在2℃-8℃下制备和储存的投药溶液的稳定性有所增进。
表14. 2℃-8℃和25℃下的投药溶液稳定性评估结果，回收百分比
5.8.3 实例12：储存于25℃下的式(2)化合物-投药溶液
评价用于静脉内投与的式(2)化合物的一系列投药溶液。在低、中和高浓度(分别为0.1mg/mL、1mg/mL和5mg/mL)下于稀释成各种投药溶液后评估式(2)化合物的所选浓缩物(以30mg/mL在pH 4.0下于30％的媒剂中制得)。对于将式(2)化合物稀释到0.1mg/mL和1mg/mL来说，评估三种投药溶液：(1)D5W，(2)D5W以及5mM磷酸钾(pH＝6)，和(3)D5W以及20mM磷酸钾(pH＝6)。为将式(2)化合物的稀释液的等渗透压维持于5mg/mL，将投药溶液的右旋糖浓度减小到2.5％(w/v)。因此，所评估的投药溶液为：(1)D2.5W，(2)D2.5W以及5mM磷酸钾(pH＝6)，和(3)D2.5W以及20mM磷酸钾(pH＝6)。
在储存于25℃下之后大约0、16、24和48小时评价潜在投药溶液的目测外观、pH、渗透压和浓度且通过HPLC(西丽格苯基管柱(沃特斯)；UV吸光度检测器，272nm；流动相：含有0.1％(v/v)甲酸的乙腈水溶液的分级梯度)评价纯度。所有试样都是澄清、无色溶液，唯一例外是存于D2.5W以及5mM磷酸盐中的5mg/mL式(2)化合物，其在25℃下48小时之后具有澄清、浅黄色外观。所有溶液都等渗(290+/-50mOsm/kg)，唯一例外是存于D5W以及20mM磷酸盐中的1mg/mL式(2)化合物，其具有大约350mOsm/kg的渗透压。另外，所有其它投药溶液在48小时内都将式(2)化合物维持于0.1mg/mL、1mg/mL和5mg/mL的目标浓度，唯一例外是存于D2.5W以及5mM磷酸盐中的5mg/mL式(2)化合物。
此外，在25℃下于16小时之后通过HPLC在含有磷酸盐缓冲剂的投药溶液中观察到少量已知降解物式(6)化合物(绘示于下文中，在释放活性HNO基团之后形成)。
式(6)化合物的所观察量约为所述方法的检测限值。
随pH和缓冲剂的变化，另外评估5mg/mL式(2)化合物投药溶液的稳定性。将式(2)化合物的浓缩溶液(以30mg/mL在30％的媒剂中于pH 4.0下制得)稀释到5mg/mL并稀释成4种潜在投药溶液。评估4种投药溶液：(1)D2.5W、5mM磷酸钾(pH＝6.0)，(2)D2.5W以及5mM柠檬酸钾(pH＝6.0)，(3)D2.5W、5mM柠檬酸钾(pH＝5.0)，和(4)D2.5W、5mM乙酸钾(pH＝5.0)。式(2)化合物的所有投药溶液都等渗(290+/-50mOsm/kg)。在25℃下储存大约24小时和48小时之后，评价投药溶液的目测外观、pH和浓度且通过HPLC评价纯度。非磷酸盐投药溶液是澄清、无色的且在48小时内将式(2)化合物维持于5mg/mL的目标浓度；而与投药溶液筛选一致，存于D2.5W以及5mM磷酸盐(pH 6.0)投药溶液中的5mg/mL式(2)化合物具有澄清、浅黄色外观，并且式(2)化合物在48小时之后仅回收60％。另外，除存于D2.5W、5mM柠檬酸盐(pH 5.0)中的5mg/mL式(2)化合物外，通过HPLC在所有试样中都观察到少量已知降解物式(6)化合物。
在25℃下储存7天之后，非磷酸盐投药溶液仍具有澄清和无色的外观。在存于D2.5W、5mM柠檬酸盐pH 6.0投药溶液中的5mg/mL式(2)化合物中于7天内测量到最小酸度增加，而D2.5W、5mM柠檬酸盐pH 5.0投药溶液在最初24-48h内具有最小pH变化。另外，在25℃下储存14天之后，含有5mM柠檬酸盐的pH 6.0投药溶液试样仍是澄清、无色溶液，而含有5mM柠檬酸盐或5mM乙酸盐的pH 5.0投药溶液是澄清、黄色溶液。结果汇总于表15中。
表15.式(2)化合物从5mg/mL投药溶液的回收率
所属领域技术人员应明了，所揭示标的物的具体实施例可涉及上文和下文所指示实施例中的一或多者的任一组合。
尽管已出于清晰理解的目的借助阐释和实例略微详细地揭示本发明，但所属领域技术人员应明了，可作出各种变化且可替代等效内容，此并不背离本发明的真实精神和范围。因此，不应将说明和实例解释为限制本发明的范围。
本文所揭示的所有参考文献、出版物、专利和专利申请案的全部内容都以引用方式并入本文中。

Claims (18)

1.一种式(1)化合物，
2.一种式(2)化合物，
3.一种医药组合物，其包含根据权利要求1或2所述的化合物和至少一种医药上可接受的赋形剂。
4.根据权利要求3所述的医药组合物，其中所述医药组合物适于静脉内投与。
5.根据权利要求3或4所述的医药组合物，其中所述医药组合物具有4到6的pH值。
6.根据权利要求3或4所述的医药组合物，其中所述医药组合物具有4到5的pH值。
7.根据权利要求3或4所述的医药组合物，其中所述医药组合物具有4的pH值。
8.一种试剂盒，其包含呈干燥形式的根据权利要求1或2所述的化合物或呈干燥形式的根据权利要求3到7中任一权利要求所述的医药组合物；和
医药上可接受的液体稀释剂。
9.一种根据权利要求1或2所述的化合物的用途或根据权利要求3到7中任一权利要求所述的医药组合物的用途，其用以制造可用于治疗心血管疾病的药物。
10.一种根据权利要求1或2所述的化合物的用途或根据权利要求3到7中任一权利要求所述的医药组合物的用途，其用以制造可用于治疗心力衰竭的药物。
11.一种根据权利要求1或2所述的化合物的用途或根据权利要求3到7中任一权利要求所述的医药组合物的用途，其用以制造可用于治疗急性失代偿性心力衰竭的药物。
12.根据权利要求1或2所述的化合物或根据权利要求3到7中任一权利要求所述的医药组合物，其用于治疗心血管疾病。
13.根据权利要求1或2所述的化合物或根据权利要求3到7中任一权利要求所述的医药组合物，其用于治疗心力衰竭。
14.根据权利要求1或2所述的化合物或根据权利要求3到7中任一权利要求所述的医药组合物，其用于治疗急性失代偿性心力衰竭。
15.一种根据权利要求1或2所述的化合物的用途或根据权利要求3到7中任一权利要求所述的医药组合物的用途，其用以制造用于增加体内硝酰基水平的药物。
16.一种根据权利要求1或2所述的化合物的用途或根据权利要求3到7中任一权利要求所述的医药组合物的用途，其用以制造用于治疗选自以下病症的药物：缺血/再灌注损伤和肺高血压。
17.根据权利要求1或2所述的化合物或根据权利要求3到7中任一权利要求所述的医药组合物，其用于增加体内硝酰基水平。
18.根据权利要求1或2所述的化合物或根据权利要求3到7中任一权利要求所述的医药组合物，其用于治疗选自以下的病症：缺血/再灌注损伤和肺高血压。
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