CN105072920A - 蛋白质组合物及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
包含乳碱性蛋白质级分和选自由大豆多糖、黄原胶、果胶、阿拉伯胶、茄替胶、角叉菜胶、刺槐豆胶、酪蛋白酸钠、卵磷脂和羧甲基纤维素组成的组中的至少一种稳定剂的蛋白质组合物。该蛋白质组合物实现乳酸性蛋白质级分的耐热性的显著改善。蛋白质组合物和包含蛋白质组合物的饮食品、饲料和药物可在90℃以上的温度下加热处理而不会使乳碱性蛋白质级分失活。
Description
技术领域
本发明涉及耐热性高的蛋白质组合物,并涉及该组合物的生产方法。更具体地,本发明涉及耐热性高的包含乳碱性蛋白质级分和稳定剂的蛋白质组合物,并涉及该组合物的生产方法。
背景技术
已报道了来源于乳的碱性蛋白质级分具有各种生理机能,如骨强化作用、牙周病预防作用、脂质代谢改善作用、降压作用、皮肤胶原蛋白产生促进作用和免疫系统调控作用。为了此类生理机能的有效利用,已开发包含乳碱性蛋白质级分的各种饮食品、饲料和药物。遗憾的是,乳碱性蛋白质级分在中性pH区域中热不稳定,并且在80℃温度下加热10分钟时沉淀(参见,例如,专利文献1)。因此,通常在酸性pH区域中加热乳碱性蛋白质级分。据报道此方法可基本上维持即使在加热处理后乳碱性蛋白质级分的骨强化作用(参见,例如,非专利文献1)。
遗憾的是,此方法仍涉及在90℃以上的温度下灭菌、特别是蒸煮灭菌期间由乳碱性蛋白质级分的低热稳定性引起的问题,如:(1)由于其不充分的耐热性,在90℃以上的温度下加热灭菌期间乳碱性蛋白质级分的凝集和沉淀的高倾向;和(2)特别是在中性(pH值大约为7.0)至碱性的条件下的加热灭菌期间乳碱性蛋白质级分的失活的高倾向。因此,在实际情况下,在加热处理(特别是在超过90℃的温度下)包含乳碱性蛋白质级分的溶液的情况下,不可能采用超高温加热处理,这是因为此处理将使乳碱性蛋白质级分失活。此类情况限制了在不失活的情况下将乳碱性蛋白质级分在饮食品、饲料或药物中的共混。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利申请特开平09-191858号公报
非专利文献
非专利文献1:SeiichiroAoe等人,BioscienceBiotechnologyandBiochemistry,65(4),913-918(2001)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供可在90℃以上的温度下加热而不使包含于其中的乳碱性蛋白质级分失活的蛋白质组合物,和该组合物的生产方法。
用于解决问题的方案
本发明提供以下方面:
方面[1]一种加热稳定性蛋白质组合物,其包含:乳碱性蛋白质级分;和选自由大豆多糖、黄原胶(xanthangum)、果胶(pectin)、阿拉伯胶(gumarabic)、茄替胶(gumghatti)、角叉菜胶(carrageenan)、刺槐豆胶(locustbeangum)、酪蛋白酸钠(sodiumcaseinate)、卵磷脂(lecithin)和羧甲基纤维素组成的组的至少一种稳定剂。
方面[2]根据方面[1]所述的蛋白质组合物,其中乳碱性蛋白质级分具有包含15重量%以上的碱性氨基酸的氨基酸组成。
方面[3]根据方面[1]所述的蛋白质组合物,其中:
1)乳碱性蛋白质级分包含由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的分子量各自在3,000至80,000的范围内的几种蛋白质;
2)乳碱性蛋白质级分包含95重量%以上的蛋白质和少量的脂肪和灰分;
3)乳碱性蛋白质级分中主要包含的蛋白质为乳铁蛋白和乳过氧化物酶;和
4)乳碱性蛋白质级分中的蛋白质具有包含15重量%以上的碱性氨基酸的氨基酸组成。
方面[4]一种饮食品、饲料或药物,其包含根据方面[1]至[3]任一项所述的蛋白质组合物。
方面[5]一种乳碱性蛋白质级分的加热处理方法,其包括:将乳碱性蛋白质级分与选自由大豆多糖、黄原胶、果胶、阿拉伯胶、茄替胶、角叉菜胶、刺槐豆胶、酪蛋白酸钠、卵磷脂和羧甲基纤维素组成的组的至少一种稳定剂混合;和在90℃以上的温度下加热混合物。
方面[6]根据方面[5]所述的乳碱性蛋白质级分的加热处理方法,其中乳碱性蛋白质级分具有包含15重量%以上的碱性氨基酸的氨基酸组成。
方面[7]根据方面[5]所述的乳碱性蛋白质级分的加热处理方法,其中
1)乳碱性蛋白质级分包含由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的分子量各自在3,000至80,000的范围内的几种蛋白质;
2)乳碱性蛋白质级分包含95重量%以上的蛋白质和少量的脂肪和灰分;
3)乳碱性蛋白质级分中主要包含的蛋白质为乳铁蛋白和乳过氧化物酶;和
4)乳碱性蛋白质级分中的蛋白质具有包含15重量%以上的碱性氨基酸的氨基酸组成。
发明的效果
根据本发明,蛋白质组合物可在超过90℃的温度下加热而不使包含于其中的乳碱性蛋白质级分失活。
具体实施方式
为了解决上述问题,本发明人对乳碱性蛋白质级分抵抗热失活的稳定性进行了广泛的研究,结果发现包含乳碱性蛋白质级分和如大豆多糖或黄原胶等稳定剂的蛋白质组合物显示出显著高的耐热性。因此本发明人完成本发明。
具体地,根据本发明的实施方案的蛋白质组合物包含乳碱性蛋白质级分;和选自由大豆多糖、黄原胶、果胶、阿拉伯胶、茄替胶、角叉菜胶、刺槐豆胶、酪蛋白酸钠、卵磷脂和羧甲基纤维素组成的组的至少一种稳定剂。在从酸性延伸到中性和碱性pH区域的更宽的pH范围内,即使在超过90℃的温度下高温加热处理期间和在超过120℃的温度下蒸煮灭菌处理期间,蛋白质组合物也具有高耐热性。
乳碱性蛋白质级分优选具有包含15重量%以上碱性氨基酸的氨基酸组成。可使用来自任何来源的乳碱性蛋白质级分。例如,具有以下性质并且已知具有骨强化作用的乳碱性蛋白质可在超过90℃的温度下加热而不会失活:
1)乳碱性蛋白质级分包含由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的分子量各自在3,000至80,000的范围内的几种蛋白质;
2)乳碱性蛋白质级分包含95重量%以上的蛋白质和少量的脂肪和灰分;
3)乳碱性蛋白质级分中主要包含的蛋白质为乳铁蛋白和乳过氧化物酶;和
4)乳碱性蛋白质级分中的蛋白质具有包含15重量%以上的乳碱性氨基酸的氨基酸组成。
乳碱性氨基酸的实例包括赖氨酸、组氨酸和精氨酸。
前述碱性蛋白质级分可通过例如,将乳原料如脱脂乳或乳清与阳离子交换树脂接触以使碱性蛋白质吸附在树脂上,用盐浓度为0.1M至1M的洗脱液洗脱吸附的碱性蛋白质级分,回收洗脱的级分,通过反渗透(RO)或电渗析(ED)脱盐或浓缩回收的级分,并任选地干燥所得物来制备。乳原料的来源的实例包括牛(bovine)、水牛、人类、猪、绵羊、山羊和马的乳。
制备乳碱性蛋白质级分的已知方法的实例包括:通过将乳或来源于乳的原料与阳离子交换剂接触以使乳碱性蛋白质吸附在阳离子交换剂上,然后用pH值大于5且离子强度大于0.5的洗脱液洗脱吸附的乳碱性蛋白质级分的方法(日本专利申请特开平05-202098号公报);使用藻酸胶(alginategel)的方法(日本专利申请特开昭61-246198号公报);使用多孔性无机颗粒将碱性蛋白质级分与乳清分离的方法(日本专利申请特开平01-86839号公报);和使用硫酸酯化合物获得乳碱性蛋白质级分的方法(日本专利申请特开昭63-255300号公报)。本发明中,可使用由此类方法制备的乳碱性蛋白质级分。
稳定剂的主组分优选具有以下特性:
(1)主组分具有高分子量和成膜性(film-formingproperty)。此类组分的实例为大豆多糖;
(2)主组分的侧链与主链的比高。此类组分的实例为具有连接甘露糖和葡萄糖醛酸的葡萄糖主链的黄原胶;
(3)主组分为由半乳糖醛酸主链与结合至主链的半乳糖、阿拉伯糖或木糖的多个侧链组成的果胶;
(4)主组分的侧链与主链的比高。此类组分的实例为具有连接阿拉伯糖和葡萄糖醛酸的半乳糖主链的阿拉伯胶。
具有此类性质的稳定剂防止乳碱性蛋白质级分由于加热期间的凝集和沉淀的失活,因此增加乳碱性蛋白质级分的耐热性。
相比之下,包含乳碱性蛋白质的组合物不优选具有以下性质的稳定剂。
(1)具有疏水性和亲水性基团并显示出多分子层吸附的稳定剂。此类稳定剂的实例为由蔗糖的羟基与脂肪酸的反应得到的蔗糖脂肪酸酯;和
(2)具有线性结构的稳定剂,如结冷胶(gellangum),或侧链与主链的比低的稳定剂。此类稳定剂的实例为瓜耳胶(guargum)和罗望子胶(tamarindgum)。
尽管此类稳定剂的使用不会显著地增加加热期间的乳碱性蛋白质级分的耐热性,但是该组合物可部分包含此类稳定剂。
在这些事实的基础上,与乳碱性蛋白质级分混合来制备包含乳碱性蛋白质的组合物的优选稳定剂的实施包括大豆多糖、黄原胶、果胶、阿拉伯胶、茄替胶、角叉菜胶、刺槐豆胶、酪蛋白酸钠、卵磷脂和羧甲基纤维素。这些稳定剂的至少一种与乳碱性蛋白质级分混合以制备包含乳碱性蛋白质的组合物。这些稳定剂的一些具有其它各种机能,如乳化作用,但仍可毫无问题地使用。
蛋白质组合物可以以任何比包含乳碱性蛋白质级分和稳定剂,并且相对于乳碱性蛋白质级分优选以0.5至100(重量/重量)、更优选1至40(重量/重量)的比包含稳定剂。
蛋白质组合物可由任何方法制备。例如,如果蛋白质组合物以溶液形式制备,则将乳碱性蛋白质级分和稳定剂分别悬浮或溶解在去离子水中,然后通过搅拌将分离的溶液混合并形成饮食品、饲料或药物。乳碱性蛋白质级分和稳定剂可在任何条件下通过搅拌良好地混合。它们可通过用超声波分散器搅拌来混合,必要时可将它们加热至大约40℃至80℃的温度。为了促进组合物用于饮食品、饲料或药物,必要时所得的蛋白质组合物溶液可进一步进行处理如用UF膜等的浓缩或冷冻干燥(lyophilization)等。
蛋白质组合物在从酸性延伸至中性和碱性的pH区域的宽pH范围内具有高的热稳定性,因此可承受饮食品、饲料和药物的生产中通常采用的高温加热处理和蒸煮灭菌处理。粉末形式的蛋白质组合物还可承受干热灭菌。因此,蛋白质组合物可用于制备各种形式如液状、凝胶状、粉末状和颗粒状形式的饮食品、饲料或药物。
蛋白质组合物的pH值可用无机酸例如盐酸或磷酸;有机酸例如柠檬酸或乙酸;或碱剂例如氢氧化钠或碳酸氢钠来调节。如果将蛋白质组合物放在使得该蛋白质组合物维持其热稳定性的pH值的环境中,则蛋白质组合物可进行高温加热处理或蒸煮灭菌处理而不需要pH值的调节。加热灭菌的条件和pH值可根据期望的包含蛋白质组合物的饮食品、饲料或药物的所需品质来适当地选择。
蛋白质组合物可单独或任选地以与通常包含于此类产品的其它原料如糖类、脂质或调味品(flavorings)的混合物的形式用于饮食品、饲料或药物。
现将通过仅为本发明的说明性实施方案且不以任何方式限制本发明的参考例、实施例和试验例来详细描述本发明。
(参考例1:乳碱性蛋白质级分1的制备)
将填充400g磺化Chitopearl(Fuji-SpinningCo.,Ltd.制)作为阳离子交换树脂的柱(直径5cm和长度30cm)用去离子水彻底洗净,然后以25ml/分钟的流速装载40公升未灭菌的脱脂乳(pH值6.7)。然后用去离子水彻底冼净柱之后,将吸附至树脂上的碱性蛋白质级分用包含0.98M氯化钠的0.02M碳酸缓冲液(pH值7.0)洗脱。用反渗透(RO)膜将洗出液脱盐或浓缩,将所得物冷冻干燥,从而生产粉末状的碱性蛋白质级分21g(参考例产品A)。由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定由此制备的乳碱性蛋白质级分。结果显示乳碱性蛋白质级分的分子量在3,000至80,000的范围内并具有如表1所示的组成。乳碱性蛋白质级分还用6N盐酸在110℃下水解24小时,然后用氨基酸分析仪(L-8500,Hitachi,Ltd.制)分析氨基酸组成。结果如表2所示。由ELISA进一步分析乳碱性蛋白质级分的蛋白质组成。表3显示乳碱性蛋白质级分包含大于40%的乳铁蛋白和乳过氧化物酶。
[表1]
[表2]
[表3]
(参考例2:乳碱性蛋白质级分2的制备)
将填充30gSPToyopearl(TOSOHCORPORATION制)作为阳离子交换树脂的柱(直径100cm和长度10cm)用去离子水彻底洗净,然后以10L/分钟的流速装载已在121℃温度下加热灭菌30秒的3t奶酪乳清(pH值6.2)。然后用去离子水彻底冼净柱之后,将吸附至树脂上的碱性蛋白质级分用包含0.9M氯化钠的0.1M柠檬酸缓冲液(pH值5.7)洗脱。用电渗析(ED)将洗出液脱盐或浓缩,将所得物冷冻干燥,从而生产粉末状的碱性蛋白质级分183g(参考例产品B)。
[试验例1]
将参考例产品A的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至100mg%浓度(溶液A),并将作为稳定剂的0.2重量%的大豆多糖溶解在去离子水中(溶液B)。将溶液A和B通过用超声波分散器(ULTRA-TURRAXT-25;IKAJapan制)在8000rpm和50℃温度下搅拌3分钟来混合在一起以制备蛋白质组合物。然后将乳酸或氢氧化钠溶液添加至蛋白质组合物作为pH调节剂,以制备pH值分别为1至10的十个样品。将各样品(2ml)分配至安瓿管(ampules)中,然后在90℃、100℃、110℃、120℃或130℃的温度下加热4分钟。作为参照,将包含乳碱性蛋白质级分但不包含任何稳定剂的溶液(即溶液A)调节为具有上述pH值,并将所得样品在110℃温度下加热4分钟。目视分析加热处理后的各样品和对照样品的凝集和沉淀。
为了测定加热处理后乳碱性蛋白质级分的降解程度,将加热处理后的各样品和参考样品进行如下所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分析乳碱性蛋白质级分的条带谱(bandpattern)。
SDS-PAGE:用15μl的样品缓冲液(包含1.25ml的0.5MTris-HCl(pH值为6.8)、1.0ml的丙三醇、2.0ml的10%SDS、0.5ml的2-巯基乙醇和0.25ml的0.1%BPB)稀释各样品(15μl),并在100℃温度下加热所得溶液5分钟。加热处理之后,用14%的聚丙烯酰胺凝胶(TEFCOSDS-PAGEmini)将各样品(15μl)进行电泳。KaleidoscopePrestainedStandards(BioRad)用作分子量标记。结果如表4所示。
[表4]
注)1:凝集和沉淀的目视观察
“-”表示由于无凝集或沉淀而透明。
“±”表示半透明,但无凝集或沉淀。
“+”表示存在凝集或沉淀。
注)2:通过电泳(SDS-PAGE)的观察
“○”表示通过SDS-PAGE观察到蛋白质类的条带。
“Δ”表示通过SDS-PAGE观察到轻微的蛋白质类的条带。
“×”表示通过SDS-PAGE未观察到蛋白质类的条带。
表4中示出的结果表明对于包含由乳碱性蛋白质级分和大豆多糖组成的蛋白质组合物的溶液在2至9的pH值下目视未观察到凝集或沉淀,并通过SDS-PAGE发现乳碱性蛋白质级分的条带。此类结果表明蛋白质组合物在酸性pH区域中稳定并且在中性和碱性pH区域中具有非常高的热稳定性。还将各样品加热更长一段时间以观察加热处理后的乳碱性蛋白质级分。对于pH值为2至9的各样品,即使在120℃温度下加热处理10分钟之后仍未观察到凝集或沉淀,并发现乳碱性蛋白质级分的条带。这些实验结果清楚地表明即使在蒸煮灭菌处理之后蛋白质组合物仍可保持乳碱性蛋白质级分而不失活。相比之下,在仅包含乳碱性蛋白质级分的溶液中在2至9的pH值下未发现乳碱性蛋白质级分的条带。结果表明乳碱性蛋白质级分由于热变性和降解而丧失其机能。
[试验例2]
将参考例产品B的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至100mg%浓度(溶液A),并将作为稳定剂的黄原胶0.04%(重量)溶解在去离子水中(溶液B)。将溶液A和B通过用超声波分散器(ULTRA-TURRAXT-25;IKAJapan制)在9500rpm和50℃温度下搅拌3分钟来混合在一起以制备蛋白质组合物。然后将乳酸或氢氧化钠溶液添加至蛋白质组合物作为pH调节剂,以制备pH值分别为1至10的十个样品。将各样品(2ml)分配至安瓿管中,然后在90℃、100℃、110℃、120℃或130℃的温度下加热4分钟。作为对照,将包含乳碱性蛋白质级分但不包含任何稳定剂的溶液(即溶液A)调节为具有上述pH值,并将所得样品在110℃温度下加热4分钟。目视分析加热处理后的各样品和对照样品的凝集和沉淀。为了测定加热处理后乳碱性蛋白质级分的降解程度,将加热处理后的各样品和对照样品进行如试验例1中的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分析乳碱性蛋白质级分的条带谱。结果如表5所示。
[表5]
注)1:凝集和沉淀的目视观察
“-”表示由于无凝集或沉淀而透明。
“±”表示半透明,但无凝集或沉淀。
“+”表示存在凝集或沉淀。
注)2:通过电泳(SDS-PAGE)的观察
“○”表示通过SDS-PAGE观察到蛋白质类的条带。
“Δ”表示通过SDS-PAGE观察到轻微的蛋白质类的条带。
“×”表示通过SDS-PAGE未观察到蛋白质类的条带。
表5中示出的结果表明对于包含含有乳碱性蛋白质级分和黄原胶的蛋白质组合物的溶液在2至9的pH值下目视未观察到凝集或沉淀,并通过SDS-PAGE发现乳碱性蛋白质级分的条带。此类结果表明蛋白质组合物在酸性pH区域中稳定并且在中性和碱性pH区域中具有非常高的热稳定性。还将各样品加热更长一段时间以观察加热处理后的乳碱性蛋白质级分。对于pH值为2至9的各样品,即使在130℃温度下加热处理10分钟之后仍未观察到凝集或沉淀,并发现乳碱性蛋白质级分的条带。这些实验结果清楚地表明即使在蒸煮灭菌处理之后蛋白质组合物仍可充分地保持乳碱性蛋白质级分的活性。
[试验例3]
将参考例产品A的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至100mg%浓度(溶液A),并将作为稳定剂的果胶0.2重量%溶解在去离子水中(溶液B)。将溶液A和B通过用超声波分散器(ULTRA-TURRAXT-25;IKAJapan制)在8000rpm和40℃温度下搅拌3分钟来混合在一起以制备蛋白质组合物。然后将乳酸或氢氧化钠溶液添加至蛋白质组合物作为pH调节剂,以制备pH值分别为1至10的十个样品。将各样品(2ml)分配至安瓿管中,然后在90℃、100℃、110℃、120℃或130℃的温度下加热4分钟。作为对照,将包含乳碱性蛋白质级分但不包含任何稳定剂的溶液(即溶液A)调节为具有上述pH值,并将所得样品在110℃温度下加热4分钟。目视分析加热处理后的各样品和对照样品的凝集和沉淀。为了测定加热处理后乳碱性蛋白质级分的降解程度,将加热处理后的各样品和对照样品进行如试验例1中的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分析乳碱性蛋白质级分的条带谱。结果如表6所示。
[表6]
注)1:凝集和沉淀的目视观察
“-”表示由于无凝集或沉淀而透明。
“±”表示半透明,但无凝集或沉淀。
“+”表示存在凝集或沉淀。
注)2:通过电泳(SDS-PAGE)的观察
“○”表示通过SDS-PAGE观察到蛋白质类的条带。
“Δ”表示通过SDS-PAGE观察到轻微的蛋白质类的条带。
“×”表示通过SDS-PAGE未观察到蛋白质类的条带。
表6中示出的结果表明对于包含含有乳碱性蛋白质级分和果胶的蛋白质组合物的溶液在2至9的pH值下目视未观察到凝集或沉淀,并通过SDS-PAGE发现乳碱性蛋白质级分的条带。此类结果表明蛋白质组合物在酸性pH区域中稳定并且在中性和碱性pH区域中具有非常高的热稳定性。还将各样品加热更长一段时间以观察加热处理后的乳碱性蛋白质级分。对于pH值为2至9的各样品,即使在120℃温度下加热处理8分钟之后仍未观察到凝集或沉淀,并发现乳碱性蛋白质级分的条带。这些实验结果清楚地表明即使在蒸煮灭菌处理之后蛋白质组合物仍可充分地保持乳碱性蛋白质级分的活性。
[试验例4]
将参考例产品B的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至100mg%浓度(溶液A),并将作为稳定剂的阿拉伯胶0.1重量%溶解在去离子水中(溶液B)。将溶液A和B通过用超声波分散器(ULTRA-TURRAXT-25;IKAJapan制)在8000rpm和40℃温度下搅拌3分钟来混合在一起以制备蛋白质组合物。然后将乳酸或氢氧化钠溶液添加至蛋白质组合物作为pH调节剂,以制备pH值分别为1至10的十个样品。将各样品(2ml)分配至安瓿管中,然后在90℃、100℃、110℃、120℃或130℃的温度下加热4分钟。作为对照,将包含乳碱性蛋白质级分但不包含任何稳定剂的溶液(即溶液A)调节为具有上述pH值,并将所得样品在110℃温度下加热4分钟。目视分析加热处理后的各样品和对照样品的凝集和沉淀。为了测定加热处理后乳碱性蛋白质级分的降解程度,将加热处理后的各样品和对照样品进行如试验例1中的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分析乳碱性蛋白质级分的条带谱。
试验例4的结果表明对于包含含有乳碱性蛋白质级分和阿拉伯胶的蛋白质组合物的溶液在3至5的pH值下目视未观察到凝集或沉淀,并通过SDS-PAGE发现乳碱性蛋白质级分的条带。此类结果表明蛋白质组合物在酸性pH区域中具有非常高的热稳定性。还将各样品加热更长一段时间以观察加热处理后的乳碱性蛋白质级分。对于pH值为3至5的各样品,即使在120℃温度下加热处理7分钟之后仍未观察到凝集或沉淀,并发现乳碱性蛋白质级分的条带。这些实验结果清楚地表明即使在蒸煮灭菌处理之后蛋白质组合物仍可充分地保持乳碱性蛋白质级分的活性。
[试验例5]
将参考例产品A的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至100mg%浓度(溶液A),并将作为稳定剂的茄替胶0.1重量%溶解在去离子水中(溶液B)。将溶液A和B通过用超声波分散器(ULTRA-TURRAXT-25;IKAJapan制)在8000rpm和40℃温度下搅拌4分钟来混合在一起以制备蛋白质组合物。然后将乳酸或氢氧化钠溶液添加至蛋白质组合物作为pH调节剂,以制备pH值分别为1至10的十个样品。将各样品(2ml)分配至安瓿管中,然后在90℃、100℃、110℃、120℃或130℃的温度下加热4分钟。作为对照,将包含乳碱性蛋白质级分但不包含任何稳定剂的溶液(即溶液A)调节为具有上述pH值,并将所得样品在110℃温度下加热4分钟。目视分析加热处理后的各样品和对照样品的凝集和沉淀。为了测定加热处理后乳碱性蛋白质级分的降解程度,将加热处理后的各样品和对照样品进行如试验例1中的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分析乳碱性蛋白质级分的条带谱。
试验例5的结果表明对于包含含有乳碱性蛋白质级分和茄替胶的蛋白质组合物的溶液在3至8的pH值下目视未观察到凝集或沉淀,并通过SDS-PAGE发现乳碱性蛋白质级分的条带。此类结果表明蛋白质组合物在酸性pH区域中稳定并且在中性和碱性pH区域中具有非常高的热稳定性。还将各样品加热更长一段时间以观察加热处理后的乳碱性蛋白质级分。对于pH值为3至8的各样品,即使在120℃温度下加热处理7分钟之后仍未观察到凝集或沉淀,并发现乳碱性蛋白质级分的条带。这些实验结果清楚地表明即使在蒸煮灭菌处理之后蛋白质组合物仍可充分地保持乳碱性蛋白质级分的活性。
[试验例6]
将参考例产品B的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至100mg%浓度(溶液A),并将作为稳定剂的角叉菜胶0.2重量%溶解在去离子水中(溶液B)。将溶液A和B通过用超声波分散器(ULTRA-TURRAXT-25;IKAJapan制)在8000rpm和40℃温度下搅拌3分钟来混合在一起以制备蛋白质组合物。然后将乳酸或氢氧化钠溶液添加至蛋白质组合物作为pH调节剂,以制备pH值分别为1至10的十个样品。将各样品(2ml)分配至安瓿管中,然后在90℃、100℃、110℃、120℃或130℃的温度下加热4分钟。作为对照,将包含乳碱性蛋白质级分但不包含任何稳定剂的溶液(即溶液A)调节为具有上述pH值,并将所得样品在110℃温度下加热4分钟。目视分析加热处理后的各样品和对照样品的凝集和沉淀。为了测定加热处理后乳碱性蛋白质级分的降解程度,将加热处理后的各样品和对照样品进行如试验例1中的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分析乳碱性蛋白质级分的条带谱。
试验例6的结果表明对于包含含有乳碱性蛋白质级分和角叉菜胶的蛋白质组合物的溶液在4至8的pH值下目视未观察到凝集或沉淀,并通过SDS-PAGE发现乳碱性蛋白质级分的条带。此类结果表明蛋白质组合物在酸性pH区域中稳定并且在中性和碱性pH区域中具有非常高的热稳定性。还将各样品加热更长一段时间以观察加热处理后的乳碱性蛋白质级分。对于pH值为4至8的各样品,即使在120℃温度下加热处理6分钟之后仍未观察到凝集或沉淀,并发现乳碱性蛋白质级分的条带。这些实验结果清楚地表明即使在蒸煮灭菌处理之后蛋白质组合物仍可充分地保持乳碱性蛋白质级分的活性。
[试验例7]
将参考例产品A的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至100mg%浓度(溶液A),并将作为稳定剂的刺槐豆胶0.15重量%溶解在去离子水中(溶液B)。将溶液A和B通过用超声波分散器(ULTRA-TURRAXT-25;IKAJapan制)在8000rpm和40℃温度下搅拌3分钟来混合在一起以制备蛋白质组合物。然后将乳酸或氢氧化钠溶液添加至蛋白质组合物作为pH调节剂,以制备pH值分别为1至10的十个样品。将各样品(2ml)分配至安瓿管中,然后在90℃、100℃、110℃、120℃或130℃的温度下加热4分钟。作为对照,将包含乳碱性蛋白质级分但不包含任何稳定剂的溶液(即溶液A)调节为具有上述pH值,并将所得样品在110℃温度下加热4分钟。目视分析加热处理后的各样品和对照样品的凝集和沉淀。为了测定加热处理后乳碱性蛋白质级分的降解程度,将加热处理后的各样品和对照样品进行如试验例1中的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分析乳碱性蛋白质级分的条带谱。
试验例7的结果表明对于包含含有乳碱性蛋白质级分和刺槐豆胶的蛋白质组合物的溶液在4至7的pH值下目视未观察到凝集或沉淀,并通过SDS-PAGE发现乳碱性蛋白质级分的条带。此类结果表明蛋白质组合物在酸性pH区域中稳定并且在中性pH区域中具有非常高的热稳定性。还将各样品加热更长一段时间以观察加热处理后的乳碱性蛋白质级分。对于pH值为4至7的各样品,即使在120℃温度下加热处理5分钟之后仍未观察到凝集或沉淀,并发现乳碱性蛋白质级分的条带。这些实验结果清楚地表明即使在蒸煮灭菌处理之后蛋白质组合物仍可充分地保持乳碱性蛋白质级分的活性。
[试验例8]
将参考例产品B的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至100mg%浓度(溶液A),并将作为稳定剂的酪蛋白酸钠0.15重量%溶解在去离子水中(溶液B)。将溶液A和B通过用超声波分散器(ULTRA-TURRAXT-25;IKAJapan制)在9500rpm和40℃温度下搅拌3分钟来混合在一起以制备蛋白质组合物。然后将乳酸或氢氧化钠溶液添加至蛋白质组合物作为pH调节剂,以制备pH值分别为1至10的十个样品。将各样品(2ml)分配至安瓿管中,然后在90℃、100℃、110℃、120℃或130℃的温度下加热4分钟。作为对照,将包含乳碱性蛋白质级分但不包含任何稳定剂的溶液(即溶液A)调节为具有上述pH值,并将所得样品在110℃温度下加热4分钟。目视分析加热处理后的各样品和对照样品的凝集和沉淀。为了测定加热处理后乳碱性蛋白质级分的降解程度,将加热处理后的各样品和对照样品进行如试验例1中的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分析乳碱性蛋白质级分的条带谱。
试验例8的结果表明对于包含含有乳碱性蛋白质级分和酪蛋白酸钠的蛋白质组合物的溶液在5至9的pH值下目视未观察到凝集或沉淀,并通过SDS-PAGE发现乳碱性蛋白质级分的条带。此类结果表明蛋白质组合物在酸性pH区域中稳定并且在中性和碱性pH区域中具有非常高的热稳定性。还将各样品加热更长一段时间以观察加热处理后的乳碱性蛋白质级分。对于pH值为5至9的各样品,即使在120℃温度下加热处理5分钟之后仍未观察到凝集或沉淀,并发现乳碱性蛋白质级分的条带。这些实验结果清楚地表明即使在蒸煮灭菌处理之后蛋白质组合物仍可充分地保持乳碱性蛋白质级分的活性。
[试验例9]
将参考例产品A的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至100mg%浓度(溶液A),并将作为稳定剂的卵磷脂0.25重量%溶解在去离子水中(溶液B)。将溶液A和B通过用超声波分散器(ULTRA-TURRAXT-25;IKAJapan制)在8000rpm和40℃温度下搅拌3分钟来混合在一起以制备蛋白质组合物。然后将乳酸或氢氧化钠溶液添加至蛋白质组合物作为pH调节剂,以制备pH值分别为1至10的十个样品。将各样品(2ml)分配至安瓿管中,然后在90℃、100℃、110℃、120℃或130℃的温度下加热4分钟。作为对照,将包含乳碱性蛋白质级分但不包含任何稳定剂的溶液(即溶液A)调节为具有上述pH值,并将所得样品在110℃温度下加热4分钟。目视分析加热处理后的各样品和对照样品的凝集和沉淀。为了测定加热处理后乳碱性蛋白质级分的降解程度,将加热处理后的各样品和对照样品进行如试验例1中的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分析乳碱性蛋白质级分的条带谱。
试验例9的结果表明对于包含含有乳碱性蛋白质级分和卵磷脂的蛋白质组合物的溶液在3至8的pH值下目视未观察到凝集或沉淀,并通过SDS-PAGE发现乳碱性蛋白质级分的条带。此类结果表明蛋白质组合物在酸性pH区域中稳定并且在中性和碱性pH区域中具有非常高的热稳定性。还将各样品加热更长一段时间以观察加热处理后的乳碱性蛋白质级分。对于pH值为3至8的各样品,即使在120℃温度下加热处理6分钟之后仍未观察到凝集或沉淀,并发现乳碱性蛋白质级分的条带。这些实验结果清楚地表明即使在蒸煮灭菌处理之后蛋白质组合物仍可充分地保持乳碱性蛋白质级分的活性。
[试验例10]
将参考例产品B的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至100mg%浓度(溶液A),并将作为稳定剂的羧甲基纤维素0.15重量%溶解在去离子水中(溶液B)。将溶液A和B通过用超声波分散器(ULTRA-TURRAXT-25;IKAJapan制)在8000rpm和40℃温度下搅拌3分钟来混合在一起以制备蛋白质组合物。然后将乳酸或氢氧化钠溶液添加至蛋白质组合物作为pH调节剂,以制备pH值分别为1至10的十个样品。将各样品(2ml)分配至安瓿管中,然后在90℃、100℃、110℃、120℃或130℃的温度下加热4分钟。作为对照,将包含乳碱性蛋白质级分但不包含任何稳定剂的溶液(即溶液A)调节为具有上述pH值,并将所得样品在110℃温度下加热4分钟。目视分析加热处理后的各样品和对照样品的凝集和沉淀。为了测定加热处理后乳碱性蛋白质级分的降解程度,将加热处理后的各样品和对照样品进行如试验例1中的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分析乳碱性蛋白质级分的条带谱。
试验例10的结果表明对于包含含有乳碱性蛋白质级分和羧甲基纤维素的蛋白质组合物的溶液在3至7的pH值下目视未观察到凝集或沉淀,并通过SDS-PAGE发现乳碱性蛋白质级分的条带。此类结果表明蛋白质组合物在酸性pH区域中稳定并且在中性pH区域中具有非常高的热稳定性。还将各样品加热更长一段时间以观察加热处理后的乳碱性蛋白质级分。对于pH值为3至7的各样品,即使在120℃温度下加热处理6分钟之后仍未观察到凝集或沉淀,并发现乳碱性蛋白质级分的条带。这些实验结果清楚地表明即使在蒸煮灭菌处理之后蛋白质组合物仍可充分地保持乳碱性蛋白质级分的活性。
[试验例11]
将试验例1至10中制备的各样品调节至pH值为7并在140℃温度下加热5分钟。然后使用对抗乳碱性蛋白质级分的抗体通过ELISA分析各样品的抗原性。作为对照,将不与任何稳定剂混合的乳碱性蛋白质级分在140℃温度下加热5分钟,然后与抗体反应。对于对照所观察到的反应性设定为1。各蛋白质组合物与抗体的反应性计算为相对于对照的相对值。结果如表7所示。
[表7]
*反应性由仅乳碱性蛋白质级分与抗体的值(设定为1)的相对值表示。
*数值表示平均值±标准偏差(n=6)。
*“a”表示与对照的反应性的显著不同(p<0.05)。
表7示出的结果显示出,相对于加热至140℃温度之后对于仅乳碱性蛋白质级分观察到的结果,所有蛋白质组合物与抗体的相对反应性维持在1以上。此类结果表明本发明的蛋白质组合物对抗140℃温度的超高温加热处理是稳定的。
[试验例12]
将试验例1至10中制备的各样品调节至pH值为7并在140℃温度下加热5分钟。然后测量各样品的成骨细胞增殖活性。作为对照,将不与任何稳定剂混合的乳碱性蛋白质级分在140℃温度下加热5分钟,然后测量成骨细胞增殖活性(设定为1)。各蛋白质组合物的成骨细胞增殖活性作为相对于对照的相对值如表8所示。
[表8]
*成骨细胞增殖活性值由仅乳碱性蛋白质级分的值(设定为1)的相对值表示。
*数值表示平均值±标准偏差(n=6)。
*“a”表示与对照的活性的显著不同(p<0.05)。
表8示出的结果显示出,相对于加热至140℃温度之后仅乳碱性蛋白质级分观察到的结果,所有蛋白质组合物的成骨细胞增殖活性维持在1以上。此类结果表明本发明的蛋白质组合物对抗140℃温度的超高温加热处理是稳定的。
[试验例13]
将包含试验例2中制备的蛋白质组合物(包含50mg%的乳碱性蛋白质级分和0.04重量%的黄原胶)的溶液调节至pH值分别为2至9。将各样品(150ml)包装并密封在灭菌袋中。作为对照,将仅包含LF(乳铁蛋白)的溶液调节至pH值分别为2至9,并将各样品(150ml)包装并密封在灭菌袋中。用灭菌釜(一级压力容器,型号:RCS-4CRTGN;HISAKAWORKS,LTD.制)在120℃温度下加热溶液4分钟。将加热后的各样品保存在25℃并通过目视观察分析有无凝集或沉淀,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析乳碱性蛋白质级分的条带谱。
结果,对于对照样品,即,仅包含LF并将pH值调节为2至9的溶液,在第1天观察到凝集和沉淀。相比之下,对于包含各蛋白质组合物并将pH值调节为2至9的溶液,甚至在保存一个月之后仍未观察到凝集或沉淀。在通过SDS-PAGE的乳碱性蛋白质级分的条带谱的分析中,对于包含各蛋白质组合物并将pH值调节为2至9的溶液,观察到乳碱性蛋白质级分的条带并且在保存初期和甚至保存一个月之后未观察到其它变化。此类实验结果表明本发明的蛋白质组合物在蒸煮灭菌处理中也是有效的。
[试验例14]
将200g的试验例2中制备的蛋白质组合物(包含50mg%的乳碱性蛋白质级分和0.04重量%的黄原胶)与800g的还原脱脂乳粉溶液(包含3重量%的脱脂乳粉)混合以制备包含蛋白质组合物的溶液(1)。作为对照,通过将200g的包含乳碱性蛋白质级分的溶液(乳碱性蛋白质级分的50mg%溶液)与800g的还原脱脂乳粉溶液(包含3重量%的脱脂乳粉)混合来制备溶液(2),并制备1000g的仅还原脱脂乳粉的溶液(3)(包含3重量%的脱脂乳粉)。将各溶液(150ml)包装并密封在灭菌袋中。然后用灭菌釜(一级压力容器,型号:RCS-4CRTGN;HISAKAWORKS,LTD.制)在120℃温度下加热这些溶液20分钟。结果,溶液(1)和(3)未显示出凝集或沉淀并具有优良的风味,而溶液(2)显示出凝集和沉淀。此实验结果表明本发明的蛋白质组合物在蒸煮灭菌处理中显著有效。
[试验例15]
将参考例产品A的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至100mg%浓度(溶液A),并将作为稳定剂的大豆多糖0.4重量%、黄原胶0.04重量%、罗望子胶0.05重量%和蔗糖脂肪酸酯0.1重量%分别溶解在去离子水中(溶液B)。将溶液A和各溶液B通过用超声波分散器(ULTRA-TURRAXT-25;IKAJapan制)在8000rpm和50℃温度下搅拌3分钟来混合以制备蛋白质组合物。然后将乳酸或氢氧化钠溶液添加至蛋白质组合物作为pH调节剂,以制备pH值为6.5的样品。根据试验例1中的方法,在120℃温度下加热由此制备的各样品4分钟,在加热处理前后,通过目视观察分析凝集和沉淀,并通过SDS-PAGE分析蛋白质组合物的降解程度。结果如表9所示。
[表9]
注)1:凝集和沉淀的目视观察
“-”表示由于无凝集或沉淀而透明。
“±”表示半透明,但无凝集或沉淀。
“+”表示存在凝集或沉淀。
注)2:通过电泳(SDS-PAGE)的观察
“○”表示通过SDS-PAGE观察到蛋白质类的条带。
“Δ”表示通过SDS-PAGE观察到轻微的蛋白质类的条带。
“×”表示通过SDS-PAGE未观察到蛋白质类的条带。
表9示出的结果表明加热处理之前的任何蛋白质组合物由于无凝集或沉淀而为透明,并且观察到乳碱性蛋白质级分的条带。加热处理之后,包含大豆多糖的蛋白质组合物和包含黄原胶的蛋白质组合物为透明的并且对于这些蛋白质组合物观察到乳碱性蛋白质级分的条带。相比之下,包含罗望子胶的蛋白质组合物和包含蔗糖脂肪酸酯的蛋白质组合物二者为半透明或显示出凝集或沉淀,并且对于这些蛋白质组合物在SDS-PAGE中未观察到乳碱性蛋白质级分的条带。
实施例
[实施例1]
将参考例产品B的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至50mg%浓度(溶液A,300g),并将作为稳定剂的大豆多糖0.4重量%溶解在去离子水中(溶液B,300g)。将溶液A和B通过用超声波分散器(ULTRA-TURRAXT-25;IKAJapan制)在9500rpm和50℃温度下搅拌3分钟来混合在一起以制备600g的本发明的蛋白质组合物。
[实施例2]
将参考例产品A的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至40mg%浓度(溶液A,10kg),并将作为稳定剂的黄原胶0.08重量%溶解在去离子水中(溶液B,10kg)。将溶液A和B通过用T.K.均质混合机(MARKII160型;TokushuKikaKogyoCo.,Ltd.制)在3600rpm下搅拌30分钟来混合在一起。将所得混合物用截止分子量为10kDa的UF膜浓缩以制备10kg的本发明的蛋白质组合物。
[实施例3]
将参考例产品B的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至100mg%浓度(溶液A,1000kg),并将作为稳定剂的果胶0.4重量%溶解在去离子水中(溶液B,1000kg)。将溶液A和B通过用T.K.均质混合机(MARKII2500型;TokushuKikaKogyoCo.,Ltd.制)在3600rpm和40℃温度下搅拌40分钟来混合在一起。然后将所得混合物冷冻干燥以制备3.9kg的本发明的蛋白质组合物。
[实施例4]
将参考例产品A的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至100mg%浓度(溶液A,500g),并将作为稳定剂的大豆多糖0.4重量%溶解在去离子水中(溶液B,500g)。将溶液A和B通过用超声波分散器(ULTRA-TURRAXT-25;IKAJapan制)在9500rpm和40℃温度下搅拌3分钟来混合在一起。然后通过搅拌将混合溶液与80g山梨糖醇、4g酸化剂、4g香料、10g果胶、10g乳清蛋白质浓缩物、2g乳酸钙和890g水混合以制备本发明的蛋白质组合物。将蛋白质组合物包装在200ml铝箔包装袋(cheerpacks)中。将包装袋在85℃温度下灭菌20分钟,然后密封,以制备10袋包含本发明的蛋白质组合物的凝胶状食品。在由此制备的任何凝胶状食品中未发现沉淀或异常风味。
[实施例5]
将参考例产品B的乳碱性蛋白质级分溶解在去离子水中至500mg%浓度(溶液A,200g),并将作为稳定剂的大豆多糖4重量%溶解在去离子水中(溶液B,200g)。通过混合100g麦芽糖酸、20g还源糖浆、2g酸化剂、2g香料、200g溶液A、200g溶液B和476g水来制备本发明的蛋白质组合物。将所得蛋白质组合物填充在50ml的玻璃瓶中。将瓶在90℃温度下灭菌15分钟,然后密封,以制备20瓶包含本发明的蛋白质组合物的饮品。在由此制备的任何饮品中未发现沉淀或异常风味。
[实施例6]
将0.2kg的实施例2中制备的蛋白质组合物(包含20mg%的乳碱性蛋白质级分和0.04重量%的黄原胶)与12kg大豆粉、14kg脱脂乳粉、4kg大豆油、2kg玉米油、28kg棕榈油、15kg玉米淀粉、9kg小麦粉、2kg麦麸、9kg维生素混合物、2.8kg纤维素和2kg矿物质混合物混合。将所得混合物在120℃温度下灭菌4分钟以制备100kg的狗饲料。
[实施例7]
将3kg的实施例3中制备的蛋白质组合物(包含50mg%的乳碱性蛋白质级分和0.2重量%的果胶)与5kg酪蛋白、5kg大豆蛋白质、1kg鱼油、3kg紫苏子油、19kg糊精、6kg矿物质混合物、1.95kg维生素混合物、2kg乳化剂、4kg稳定剂和0.05kg香料混合。将所得混合物包装在200ml的灭菌袋中。用灭菌釜(一级压力容器,型号:RCS-4CRTGN;HISAKAWORKS,LTD.制)在121℃温度下将灭菌袋灭菌20分钟以制备50kg的经肠营养剂(enteralnutrient)。
Claims (7)
1.一种加热稳定性蛋白质组合物,其包括:
乳碱性蛋白质级分;和
选自由大豆多糖、黄原胶、果胶、阿拉伯胶、茄替胶、角叉菜胶、刺槐豆胶、酪蛋白酸钠、卵磷脂和羧甲基纤维素组成的组中的至少一种稳定剂。
2.根据权利要求1所述的蛋白质组合物,其中所述乳碱性蛋白质级分具有包含15重量%以上的碱性氨基酸的氨基酸组成。
3.根据权利要求1所述的蛋白质组合物,其中:
1)所述乳碱性蛋白质级分包含由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的分子量各自在3,000至80,000的范围内的几种蛋白质;
2)所述乳碱性蛋白质级分包含95重量%以上的蛋白质和少量的脂肪和灰分;
3)所述乳碱性蛋白质级分中主要包含的所述蛋白质为乳铁蛋白和乳过氧化物酶;和
4)所述乳碱性蛋白质级分中的所述蛋白质具有包含15重量%以上的碱性氨基酸的氨基酸组成。
4.一种饮食品、饲料或药物,其包含根据权利要求1至3任一项所述的蛋白质组合物。
5.一种乳碱性蛋白质级分的加热处理方法,其包括:
将所述乳碱性蛋白质级分与选自由大豆多糖、黄原胶、果胶、阿拉伯胶、茄替胶、角叉菜胶、刺槐豆胶、酪蛋白酸钠、卵磷脂和羧甲基纤维素组成的组中的至少一种稳定剂混合;和
在90℃以上的温度下加热所述混合物。
6.根据权利要求5所述的乳碱性蛋白质级分的加热处理方法,其中所述乳碱性蛋白质级分具有包含15重量%以上的碱性氨基酸的氨基酸组成。
7.根据权利要求5所述的乳碱性蛋白质级分的加热处理方法,其中:
1)所述乳碱性蛋白质级分包含由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的分子量各自在3,000至80,000的范围内的几种蛋白质;
2)所述乳碱性蛋白质级分包含95重量%以上的蛋白质和少量的脂肪和灰分;
3)所述乳碱性蛋白质级分中主要包含的所述蛋白质为乳铁蛋白和乳过氧化物酶;和
4)所述乳碱性蛋白质级分中的所述蛋白质具有包含15重量%以上的碱性氨基酸的氨基酸组成。
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