CN105061194B - 一种利用连续色谱技术从乳酸发酵液中分离乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用连续色谱技术从乳酸发酵液中分离乳酸的方法，将乳酸发酵液经过预处理得到清液，将清液泵入装有超高交联型吸附树脂的连续分离装置中进行吸附、洗杂和洗脱程序，得到D‑乳酸产品。通过本发明方法得到的D‑乳酸产品浓度可达62g/L，纯度可达到98.75％，收率可达到96.1％。本发明具有设备投资少、连续操作性强、生产成本低、产品纯度和浓度高及易于规模化生产等优点。本发明不只局限于D‑乳酸，对于其他有机酸的多组分分离同样适用。
Description
技术领域
本发明涉及高纯度D-乳酸的分离制备技术，属于生物制品加工领域。
背景技术
D-乳酸(DLA)广泛应用于手性药物和农药中间体的合成以及聚乳酸材料的制造。由于聚乳酸优良的机械性能和结构性质，包括可生物降解性、高强度、高模量、低毒性和热塑性，被认为是可以取代传统生物塑料的理想材料以之一。立构复合物聚乳酸由聚D-乳酸和聚L-乳酸组成，比外消旋聚乳酸具有更高的熔点，玻璃化转变温度和冲击强度。因此，D-乳酸的需求大为增加。
目前，99％以上的商业乳酸是由乳酸菌发酵产生，然而它的发酵是一种产物抑制过程。为了减轻抑制，一种方法是中和乳酸，如加入碳酸钙或碱；另一种方法为原位产物分离(ISPR)方法。加入碳酸钙导致下游加工产生的副产物数量巨大，不利于环境。而ISPR方法如反应萃取、电渗析、吸附，既能缓解产物抑制又能回收乳酸。萃取需要大量的有机溶剂，萃取剂和稀释剂的毒性作用限制了它的应用。电渗析膜易污染，而且耗能高。离子交换树脂的再生需要大量的酸和碱，这会产生大量的废水，不利于环境。
其中，基于吸附树脂的吸附色谱法因其具有高吸附容量，良好的吸附速率，易于再生，成本低，并避免使用有毒试剂等优点而广泛应用于乳酸的分离。杨鹏波等(杨鹏波.吸附法分离低浓度乳酸[D].北京化工大学,2007)筛选出NKA-Ⅱ大孔吸附树脂，研究了该树脂对乳酸和谷氨酸的分离效果，实验结果表明：该树脂对乳酸和谷氨酸的吸附选择性系数达到16.19，可以成功的将乳酸和谷氨酸分离开。Vu Hong Thang(Vu Hong Thsng,Senad Navalin.Green Biorefinery:Separation of lactic acid from grass silage juice bychromatography using neutral polymeric resin,Bioresource Technology,2008,99,4368-4379)采用XAD1600树脂分离发酵液中的乳酸，乳酸与糖能够很好的分离，但未涉及到副产物乙酸与产品的分离，而且由于采用的固定床交换技术，所以树脂用量大，利用率低；Lee(Ho-Joon Lee,Yi Xie,Yoon-Mo Koo,Nien-Hwa Linda Wang.Separation of Lactic Acidfrom Acetic Acid Using a Four-Zone SMB,Biotechnology progress,2004,20,179-192)利用PVP树脂采用四区式的模拟移动床分离乳酸和乙酸，得到了纯度99.9％、收率大于93％的乳酸，但未提到产品与葡萄糖的分离，且树脂对乳酸的吸附量不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用连续色谱技术从乳酸发酵液中分离乳酸及其他产品的方法，克服乳酸分离过程成本高、操作繁琐、不易规模化以及乳酸产品浓度低，纯度低的缺点，实现高浓度、高纯度乳酸的清洁规模化生产。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种利用连续色谱技术从乳酸发酵液中分离乳酸的方法，将乳酸发酵液经过预处理得到清液，将清液泵入装有超高交联型吸附树脂的连续分离装置中进行吸附、洗杂和洗脱程序，得到D-乳酸产品。
其中，所述的乳酸发酵液由芽孢乳杆菌发酵制得，一般以葡萄糖为碳源，在37℃下全程通入氮气维持厌氧环境发酵制得。在发酵过程中加入碳酸钙或氨水将乳酸转化为乳酸钙或乳酸铵来缓解产物抑制作用。若发酵过程中加入碳酸钙减少产物抑制，则预处理方法是，将乳酸发酵液加热到70℃后趁热离心取上清，向上清液中加入硫酸至不产生沉淀，然后抽滤去除沉淀得到清液；若发酵过程中加入氨水减少产物抑制，则预处理方法是，将乳酸发酵液离心取上清液，向上清液中加入硫酸调节pH值至2。预处理后得到的清液中，硫酸浓度为5～15g/L，葡萄糖浓度为5～10g/L，D-乳酸浓度为100～120g/L，乙酸浓度为2～5g/L。
其中，所述的超高交联型吸附树脂为弱极性树脂，以聚苯乙烯二乙基苯为骨架，以酯基为功能基团。优选的是，所述的超高交联型吸附树脂，其比表面积为850～2000m2/g，平均粒径为0.6～1.2mm，孔径为0.5～10nm，孔容为0.22～0.66cm3/g，空隙率为65％，湿密度为1.02～1.08g/L，含水量为40～70wt％。
单柱分离实验由利用上述大孔树脂完成见附图1，由图可知，此大孔树脂能很好的分离发酵液中的成分，为后续多组分连续分离提供了很好的介质。
若要分离得到两组分，则所述的连续分离装置由6～30根装有超高交联型吸附树脂的树脂柱串联组成，通过组合式阀门将连续分离装置分为吸附区、洗杂区、洗脱区和除水区四个区域，单个区域内的树脂柱保持串联，四个区域按顺序切换，清液进入吸附区进行吸附，吸附区第一根树脂柱在树脂吸附饱和(即第一根柱出口乳酸浓度与料液浓度一致)后立刻移出吸附区送入洗杂区最后一根进行洗杂，洗杂区第一根树脂柱在洗杂结束(即第一根柱出口糖浓度小于1g/L)后立刻移出洗杂区送入洗脱区最后一根进行洗脱，洗脱区第一根树脂柱在洗脱完成(即第一根柱出口乳酸浓度小于1g/L)后立刻移出洗脱区送入除水区最后一根进行除水，除水区第一根树脂柱在除水完成(即第一根柱出口糖浓度与进口糖浓度一致)后立刻移出除水区送入吸附区最后一根再进行吸附，如此循环的操作过程，且每个区的第1根树脂柱的状态切换同步进行，并保证至少有一根树脂柱处于吸附区；
整个连续分离装置有两个进口和两个出口，其中，两个进口分别是清液的进料口和进水口，两个出口分别是葡萄糖和硫酸混合物出口以及D-乳酸和乙酸混合物出口；
进水口位于洗脱区入口处，洗脱区出口分成两个支路，一个支路为D-乳酸和乙酸混合物出口，另一个支路与洗杂区入口连通，洗杂区出口与吸附区入口连通，清液的进料口位于吸附区入口处，吸附区出口分为两个支路，一个支路为葡萄糖和硫酸混合物出口，另一个支路与除水区入口连通，除水区出口与洗脱区入口连通；
所述的洗脱区使用的洗脱液为水，不引入其他杂质，所述的洗杂区使用的洗杂液为洗脱区出口得到的D-乳酸和乙酸混合物，所述的除水区使用的除水剂为吸附区出口得到的葡萄糖和硫酸混合溶液，排出的水直接回到解析区，减少水的用量。
更优选的方式是，若要分离得到三组分，则所述的连续分离装置由6～30根装有超高交联型吸附树脂的树脂柱串联组成，通过组合式阀门将连续分离装置分为吸附区、糖洗杂区、乳酸洗脱区、乳酸洗杂区和乙酸洗脱区五个区域，单个区域内的树脂柱保持串联，五个区域按顺序切换，清液进入吸附区进行吸附，吸附区第一根树脂柱在树脂吸附饱和(即第一根柱出口乳酸浓度与料液浓度一致)后立刻移出吸附区送入糖洗杂区最后一根进行洗杂，树脂间隙的糖会被顶出，糖洗杂区第一根树脂柱在洗杂结束(即第一根柱出口糖浓度小于1g/L)后立刻移出糖洗杂区送入乳酸洗脱区最后一根进行洗脱，乳酸洗脱区第一根树脂柱在乳酸洗脱完成(即第一根柱出口一检测到乙酸)后立刻移出乳酸洗脱区送入乳酸洗杂区最后一根进行洗杂，乳酸洗杂区第一根树脂柱在洗杂完成(即第一根柱出口乳酸浓度小于1g/L)后立刻移出乳酸洗杂区送入乙酸洗脱区最后一根进行乙酸的洗脱，乙酸洗脱区第一根树脂柱在乙酸洗脱完成(即第一根柱出口乙酸浓度小于1g/L)后立刻移出乙酸洗脱区送入吸附区最后一根再进行吸附，如此循环的操作过程，且每个区的第1根树脂柱的状态切换同步进行，并保证至少有一根树脂柱处于吸附区；
整个连续分离装置有三个进口和三个出口，其中，三个进口分别是乳酸洗脱区的进水口、乙酸洗脱区的进水口和清液的进料口，三个出口分别是葡萄糖和硫酸混合物出口、D-乳酸出口以及乙酸出口；
乙酸洗脱区的进水口位于乙酸洗脱区入口处，乙酸洗脱区出口分成两个支路，一个支路为乙酸出口，另一个支路与乳酸洗杂区入口连通，乳酸洗杂区出口与糖洗杂区入口连通，糖洗杂区出口与吸附区入口连通，清液的进料口位于吸附区入口处，吸附区出口为葡萄糖和硫酸混合物出口，乳酸洗脱区与其他四个区独立且分别设立乳酸洗脱区进水口和D-乳酸出口；
由于乳酸与乙酸相对难于分离，所以将乳酸洗杂区与糖洗杂区串联连接，这样可以延长床层长度，使得D-乳酸和乙酸区分的更明显，从乳酸洗杂区排出的D-乳酸和乙酸混合物溶液会直接进入糖洗杂区，如此，在糖洗杂区切换至乳酸洗脱区时，产物D-乳酸在乙酸前面，从而保证乙酸不从乳酸洗脱区出口出来污染D-乳酸；
所述的乙酸洗脱区使用的洗脱液为水，所述的乳酸洗杂区使用的洗杂液为乙酸洗脱区出口得到的乙酸，所述的乳酸洗脱区使用的洗脱液为水，所述的糖洗杂区使用的洗杂液为乳酸洗杂区出口得到的D-乳酸和乙酸的混合溶液。
最优选的方式是，若要分离得到四组分，所述的连续分离装置由7～30根装有超高交联型吸附树脂的树脂柱串联组成，通过组合式阀门将连续分离装置分为缓冲区、吸附区、硫酸洗杂区、糖洗脱区、乳酸洗脱区、乳酸回收区和乙酸洗脱区七个区域，单个区域内的树脂柱保持串联，七个区域按顺序切换，清液进入吸附区进行吸附，吸附区第一根树脂柱在树脂吸附饱和(即第一根柱出口乳酸浓度与料液浓度一致)后立刻移出吸附区送入硫酸洗杂区最后一根进行洗杂，硫酸洗杂区第一根树脂柱在洗杂结束(即第一根柱出口硫酸浓度小于1g/L)后立刻移出硫酸洗杂区送入糖洗脱区最后一根进行洗脱，糖洗脱区第一根树脂柱在糖洗脱完成(即第一根柱出口糖浓度小于1g/L)后立刻移出糖洗脱区送入乳酸洗脱区最后一根进行洗脱，乳酸洗脱区第一根树脂柱在洗脱完成(即第一根柱出口一检测到乙酸)后立刻移出乳酸洗脱区送入乳酸回收区最后一根，乳酸回收区第一根树脂柱出口在乳酸浓度小于1g/L后立刻移出乳酸回收区送入乙酸洗脱区最后一根进行洗脱，乙酸洗脱区第一根树脂柱在乙酸洗脱完成(即第一根柱出口乙酸浓度小于1g/L)后立刻移出乙酸洗脱区送入缓冲区最后一根，缓冲区第一根树脂柱一检测到硫酸就立刻移出缓冲区送入吸附区最后一根再进行吸附，如此循环的操作过程，且每个区的第1根树脂柱的状态切换同步进行，并保证至少有一根树脂柱处于吸附区；
整个连续分离装置有三个进口和四个出口，其中，三个进口分别是乳酸洗脱区的进水口、乙酸洗脱区的进水口和清液的进料口，四个出口分别是葡萄糖出口、硫酸出口、D-乳酸出口以及乙酸出口；
乙酸洗脱区的进水口位于乙酸洗脱区入口处，乙酸洗脱区出口分成两个支路，一个支路为乙酸出口，另一个支路与乳酸回收区入口连通，乳酸回收区出口与糖洗脱区入口连通，糖洗脱区出口分成两个支路，一个支路为葡萄糖出口，另一个与硫酸洗杂区入口连通，硫酸洗杂区出口与缓冲区连同，缓冲区出口与乙酸洗脱区入口相连通；乳酸洗脱区和吸附区与其他五个区独立，乳酸洗脱区分别设立乳酸洗脱区进水口和D-乳酸出口，吸附区分别设立清液的进料口和硫酸出口；
由于乳酸与乙酸相对难于分离，所以将乳酸回收区与糖洗脱区串联连接，这样可以延长床层长度，使得D-乳酸和乙酸区分的更明显，从乳酸回收区排出的D-乳酸和乙酸混合物溶液会直接进入糖洗脱区，如此，在糖洗脱区切换至乳酸洗脱区时，产物D-乳酸在乙酸前面，从而保证乙酸不从乳酸洗脱区出口出来污染D-乳酸；同理，由于硫酸与葡萄糖相对难于分离，所以将硫酸洗杂区与缓冲区相连。
所述的乙酸洗脱区使用的洗脱液为水，所述的乳酸洗脱区使用的洗脱液为水，所述的糖洗脱区使用的洗脱液乳酸回收区出口得到的D-乳酸和乙酸的混合溶液，所述的硫酸洗杂区使用的洗杂液为糖洗脱区出口得到的葡萄糖溶液。
本领域技术人员可以根据上述思路调试设备运转的时机以及液体流速以达到各区树脂柱同步切换，且成功分离D-乳酸的目的。
有益效果：与现有技术相比，本发明提供了一种分离提取乳酸的方法，其优点在于：
1、现有的分离乳酸的连续色谱技术多为分离二组分的操作方式，本发明不仅采用了原有的四区二组分分离模式，而且还在此基础上开发了乳酸多组分分离操作方式，提高了乳酸的纯度，同时使得糖和硫酸可以回用，减少废液的排放。
2、本发明的二组分分离方式如图2所示，现有的连续色谱技术多采用四段式的操作方式，即吸附、洗杂、解吸、再生。本发明中由于解吸区采用的解析剂为水，因此在解析完成的同时，树脂已完成再生，因此将再生区改为除水区，利用糖液排出柱子内的部分水分，这样既减少了废液的排放和用水量，又保证了乳酸产品的高浓度。
3、本发明的三组分分离方式如图3所示，加入了糖洗杂区，这样从乳酸洗杂区出来的D-乳酸和强吸附组分乙酸进入糖洗杂区，如此，在糖洗杂区切换至乳酸洗脱区位置时，D-乳酸在强吸附组分乙酸前面，从而保证强吸附组分乙酸不从乳酸洗脱区出口出来污染产物D-乳酸。本发明的四组分分离方式如图4所示，同理将乳酸回收区和糖洗脱区相连，硫酸洗杂区和缓冲区相连。
4、本发明的连续分离工艺简便易行，设备投资、运行成本低廉，并可进行工艺放大，废水排放量低，避免环境污染问题，是一种清洁高效的生产工艺。
5、通过此连续装置得到的D-乳酸产品浓度可达62g/L，纯度可达到98.75％，收率可达到96.1％。
附图说明
图1为本发明发酵液单柱色谱分离图；
图2为本发明二组分连续分离工艺示意图；
图3为本发明三组分连续分离工艺示意图；
图4为本发明四组分连续分离工艺示意图。
图5为实施例1的连续分离装置的状态一。
图6为实施例1的连续分离装置的状态二。
图7为实施例2的连续分离装置的状态一。
图8为实施例2的连续分离装置的状态二。
图9为实施例3的连续分离装置的状态一。
图10为实施例3的连续分离装置的状态二。
具体实施方式
实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
1、产品检测方法
高效液相色谱分析产品纯度。色谱条件为：
1)检测器：Agilent 1200型高效液相色谱仪-示差检测器；
2)色谱柱：Bio-radHPX-87H(300mm×7.5mm i.d.,5μm)；
3)流动相：0.5mmol/L硫酸；
4)流速：0.6mL/min；
5)柱温：55℃；
6)进样体积：10μL。
2、树脂
以下实施例，所使用的超高交联聚合物吸附剂为：弱极性树脂，以聚苯乙烯二乙基苯为骨架，功能基团为酯基。所述的超高交联聚合物吸附剂的比表面积为850～2000m2/g，平均粒径为0.6～1.2mm，孔径为0.5～10nm，孔容为0.22～0.66cm3/g，空隙率为65％，湿密度为1.02～1.08g/L，含水量为40～70wt％。树脂厂家可以根据上述条件自行合成。例如，其合成方法可以为在高溶胀状态下的低交联聚苯乙稀中加入交联剂以及傅-克反应催化剂进行反应，得到超高交联度的刚性三维网络聚合物，反应温度为60～90℃，反应时间为4～18h，所用催化剂为氯化铁或氯化铝，交联剂为二乙烯基苯，反应溶剂为二氯乙烷或硝基苯。
实施例1：连续色谱分离D-乳酸发酵液。
发酵液由芽孢乳杆菌Sporolactobacillus 07发酵所得。其培养基组成：糖150g/L，酵母膏5g/L，玉米浆15ml/L，七水合硫酸镁1g/L，麸皮15g/L，CaCO390g/L，无水乙酸钠3g/L，硫酸亚铁0.01g/L，硫酸锰0.01g/L，摇瓶加玻璃珠10颗左右，自来水配制，调pH7.0，121℃15min灭菌。发酵完成后将发酵液加热到70℃后趁热离心取上清，向上清液中加入硫酸至不产生沉淀，然后抽滤去除沉淀得到清液；得到的清液中，硫酸浓度为10g/L，葡萄糖浓度为10g/L，D-乳酸浓度为120g/L，乙酸浓度为3g/L。
树脂合成方式为将高溶胀状态下的低交联聚苯乙稀中加入交联剂以及傅-克反应催化剂进行反应，可得到交联度极高的刚性三维网络聚合物，反应温度为85℃，反应时间为8h，所用催化剂为氯化铁，交联剂为二乙烯基苯，反应溶剂为二氯乙烷。所制得的超高交联聚合物吸附剂的比表面积为1528m2/g，平均粒径为0.56～0.62mm，孔径为1.9nm，孔容为0.61cm3/g，空隙率为65％，湿密度为1.02g/L，含水量为65wt％。
将清夜泵入装有上述超高交联型吸附树脂的连续分离装置中。连续分离系统分为四区，由10根装有超高交联型吸附树脂的树脂柱串联组成，如图2。通过组合式阀门将连续分离装置分为吸附区、洗杂区、洗脱区和除水区四个区域，吸附区为3根，洗杂区2根，解吸区为3根，除水区为2根，每根树脂柱装填90g树脂，树脂柱直径3.0cm，高度24cm。单个区域内的树脂柱保持串联，四个区域按顺序切换，清液进入吸附区进行吸附，吸附区第一根树脂柱在树脂吸附饱和后立刻移出吸附区送入洗杂区最后一根进行洗杂，洗杂区第一根树脂柱在洗杂结束后立刻移出洗杂区送入洗脱区最后一根进行洗脱，洗脱区第一根树脂柱在洗脱完成后立刻移出洗脱区送入除水区最后一根进行除水，除水区第一根树脂柱在除水完成后立刻移出除水区送入吸附区最后一根再进行吸附，如此循环的操作过程(树脂柱每切换一次，柱子的状态就由图5显示的状态一切换到图6显示的状态二)，且每个区的第1根树脂柱的状态切换同步进行，并保证至少有一根树脂柱处于吸附区。整个连续分离装置有两个进口和两个出口，其中，两个进口分别是清液的进料口和进水口，两个出口分别是葡萄糖和硫酸混合物出口以及D-乳酸和乙酸混合物出口。进水口位于洗脱区入口处，洗脱区出口分成两个支路，一个支路为D-乳酸和乙酸混合物出口，另一个支路与洗杂区入口连通，洗杂区出口与吸附区入口连通，清液的进料口位于吸附区入口处，吸附区出口分为两个支路，一个支路为葡萄糖和硫酸混合物出口，另一个支路与除水区入口连通，除水区出口与洗脱区入口连通。所述的洗脱区使用的洗脱液为水，不引入其他杂质，所述的洗杂区使用的洗杂液为洗脱区出口得到的D-乳酸和乙酸混合物，所述的除水区使用的除水剂为吸附区出口得到的葡萄糖和硫酸混合溶液，排出的水直接回到解析区，减少水的用量。
预处理后的D-乳酸发酵液上柱，上柱浓度：硫酸10g/，葡萄糖10g/L，D-乳酸120g/L，乙酸3g/L。原料从吸附区进入系统，在吸附区末端收集弱吸附组分硫酸和葡萄糖的混合物；洗脱液水从洗脱区进入系统，在洗脱区末端收集产品，但此产品中也包含副产物乙酸。料液流加流量为3mL/min，洗脱剂水的流加流量为7mL/min，产品收集流量为6ml/min，糖收集流量为4ml/min，20min切换一次树脂柱。最终产品浓度可达68g/L，纯度可达到92％，收率可达到98％。
实施例2：连续色谱分离D-乳酸发酵液。
发酵液由芽孢乳杆菌Sporolactobacillus 07发酵所得。其培养基组成：糖150g/L，酵母膏5g/L，玉米浆15ml/L，七水合硫酸镁1g/L，麸皮15g/L，CaCO390g/L，无水乙酸钠3g/L，硫酸亚铁0.01g/L，硫酸锰0.01g/L，摇瓶加玻璃珠10颗左右，自来水配制，调pH7.0,121℃15min灭菌。发酵完成后将发酵液加热到70℃后趁热离心取上清，向上清液中加入硫酸至不产生沉淀，然后抽滤去除沉淀得到清液；得到的清液中，硫酸浓度为10g/L，葡萄糖浓度为10g/L，D-乳酸浓度为120g/L，乙酸浓度为3g/L。
树脂合成方式为将高溶胀状态下的低交联聚苯乙稀中加入交联剂以及傅-克反应催化剂进行反应，可得到交联度极高的刚性三维网络聚合物，反应温度为85℃，反应时间为8h，所用催化剂为氯化铁，交联剂为二乙烯基苯，反应溶剂为二氯乙烷。所制得的超高交联聚合物吸附剂的比表面积为1528m2/g，平均粒径为0.56～0.62mm，孔径为1.9nm，孔容为0.61cm3/g，空隙率为65％，湿密度为1.02g/L，含水量为65wt％。
将清夜泵入装有上述超高交联型吸附树脂的连续分离装置中。所述的连续分离装置由12根装有上述超高交联型吸附树脂的树脂柱串联组成，通过组合式阀门将连续分离装置分为吸附区、糖洗杂区、乳酸洗脱区、乳酸洗杂区和乙酸洗脱区五个区域，吸附区3根、糖洗杂区2根、乳酸洗脱区3根、乳酸洗杂区2根和乙酸洗脱区2根，每根树脂柱装填90g树脂，树脂柱直径3.0cm，高度24cm，单个区域内的树脂柱保持串联，五个区域按顺序切换。清液进入吸附区进行吸附，吸附区第一根树脂柱在树脂吸附饱和后立刻移出吸附区送入糖洗杂区最后一根进行洗杂，树脂间隙的糖会被顶出，糖洗杂区第一根树脂柱在洗杂结束后立刻移出糖洗杂区送入乳酸洗脱区最后一根进行洗脱，乳酸洗脱区第一根树脂柱在乳酸洗脱完成后立刻移出乳酸洗脱区送入乳酸洗杂区最后一根进行洗杂，乳酸洗杂区第一根树脂柱在洗杂完成后立刻移出乳酸洗杂区送入乙酸洗脱区最后一根进行乙酸的洗脱，乙酸洗脱区第一根树脂柱在乙酸洗脱完成后立刻移出乙酸洗脱区送入吸附区最后一根再进行吸附，如此循环的操作过程(树脂柱每切换一次，柱子的状态就由图7显示的状态一切换到图8显示的状态二)，且每个区的第1根树脂柱的状态切换同步进行，并保证至少有一根树脂柱处于吸附区。整个连续分离装置有三个进口和三个出口，其中，三个进口分别是乳酸洗脱区的进水口、乙酸洗脱区的进水口和清液的进料口，三个出口分别是葡萄糖和硫酸混合物出口、D-乳酸出口以及乙酸出口。乙酸洗脱区的进水口位于乙酸洗脱区入口处，乙酸洗脱区出口分成两个支路，一个支路为乙酸出口，另一个支路与乳酸洗杂区入口连通，乳酸洗杂区出口与糖洗杂区入口连通，糖洗杂区出口与吸附区入口连通，清液的进料口位于吸附区入口处，吸附区出口为葡萄糖和硫酸混合物出口，乳酸洗脱区与其他四个区独立且分别设立乳酸洗脱区进水口和D-乳酸出口。由于乳酸与乙酸相对难于分离，所以将乳酸洗杂区与糖洗杂区串联连接，这样可以延长床层长度，使得D-乳酸和乙酸区分的更明显，从乳酸洗杂区排出的D-乳酸和乙酸混合物溶液会直接进入糖洗杂区，如此，在糖洗杂区切换至乳酸洗脱区时，产物D-乳酸在乙酸前面，从而保证乙酸不从乳酸洗脱区出口出来污染D-乳酸。所述的乙酸洗脱区使用的洗脱液为水，所述的乳酸洗杂区使用的洗杂液为乙酸洗脱区出口得到的乙酸，所述的乳酸洗脱区使用的洗脱液为水，所述的糖洗杂区使用的洗杂液为乳酸洗杂区出口得到的D-乳酸和乙酸的混合溶液。
预处理后的D-乳酸发酵液上柱，上柱浓度：硫酸10g/，葡萄糖10g/L，D-乳酸120g/L，乙酸3g/L。原料从吸附区进入系统，在吸附区末端收集弱吸附组分硫酸和葡萄糖的混合物；洗脱液水从乳酸洗脱区进入系统，在乳酸洗脱区末端收集乳酸产品；洗脱液水也从乙酸洗脱区进入系统，在乙酸洗脱区末端收集副产物乙酸。料液流加流量为4mL/min，乙酸洗脱区洗脱剂水的流加流量为5mL/min，乳酸洗脱区洗脱剂水的流加流量为7ml/min。产品收集流量为7ml/min，糖收集流量为7ml/min，乙酸收集流量为2ml/min，20min切换一次树脂柱。最终产品D-乳酸浓度可达62g/L，纯度可达到98.75％，收率可达到96.1％。副产物乙酸的产率可达97.3％，纯度可达98.8％。
实施例3：连续色谱分离D-乳酸发酵液。
发酵液由芽孢乳杆菌Sporolactobacillus 07发酵所得。其培养基组成：糖150g/L，酵母膏5g/L，玉米浆15ml/L，七水合硫酸镁1g/L，麸皮15g/L，无水乙酸钠3g/L，硫酸亚铁0.01g/L，硫酸锰0.01g/L，摇瓶加玻璃珠10颗左右，自来水配制，调pH7.0,121℃15min灭菌。发酵过程中流加氨水减轻产物抑制。发酵完成后离心取上清液，向上清液中加入硫酸调节PH至2；得到的清液中，硫酸浓度为10g/L，葡萄糖浓度为10g/L，D-乳酸浓度为120g/L，乙酸浓度为3g/L。
树脂合成方式为将高溶胀状态下的低交联聚苯乙稀中加入交联剂以及傅-克反应催化剂进行反应，可得到交联度极高的刚性三维网络聚合物，反应温度为90℃，反应时间为12h，所用催化剂为氯化铁，交联剂为二乙烯基苯，反应溶剂为硝基苯。所制得的超高交联聚合物吸附剂的比表面积为1528m2/g，平均粒径为0.56～0.62mm，孔径为1.9nm，孔容为0.61cm3/g，空隙率为65％，湿密度为1.02g/L，含水量为65wt％。
所述的连续分离装置由14根装有超高交联型吸附树脂的树脂柱串联组成，通过组合式阀门将连续分离装置分为缓冲区、吸附区、硫酸洗杂区、糖洗脱区、乳酸洗脱区、乳酸回收区和乙酸洗脱区七个区域，缓冲区2根、吸附区2根、硫酸洗杂区1根、糖洗脱区2根、乳酸洗脱区3根、乳酸回收区2根和乙酸洗脱区2根，每根树脂柱装填90g树脂，树脂柱直径3.0cm，高度24cm。单个区域内的树脂柱保持串联，七个区域按顺序切换。清液进入吸附区进行吸附，吸附区第一根树脂柱在树脂吸附饱和后立刻移出吸附区送入硫酸洗杂区最后一根进行洗杂，硫酸杂区第一根树脂柱在洗杂结束后立刻移出硫酸洗杂区送入糖洗脱区最后一根进行洗脱，糖洗脱区第一根树脂柱在糖洗脱完成后立刻移出糖洗脱区送入乳酸洗脱区最后一根进行洗脱，乳酸洗脱区第一根树脂柱在洗脱完成后立刻移出乳酸洗脱区送入乳酸回收区最后一根，乳酸回收区第一根树脂柱不再有乳酸洗出后立刻移出乳酸回收区送入乙酸洗脱区最后一根进行洗脱，乙酸洗脱区第一根树脂柱在乙酸洗脱完成后立刻移出乙酸洗脱区送入缓冲区最后一根，缓冲区第一根树脂柱一检测到硫酸就立刻移出缓冲区送入吸附区最后一根再进行吸附，如此循环的操作过程(树脂柱每切换一次，柱子的状态就由图9显示的状态一切换到图10显示的状态二)，且每个区的第1根树脂柱的状态切换同步进行，并保证至少有一根树脂柱处于吸附区。整个连续分离装置有三个进口和四个出口，其中，三个进口分别是乳酸洗脱区的进水口、乙酸洗脱区的进水口和清液的进料口，四个出口分别是葡萄糖出口、硫酸出口、D-乳酸出口以及乙酸出口。乙酸洗脱区的进水口位于乙酸洗脱区入口处，乙酸洗脱区出口分成两个支路，一个支路为乙酸出口，另一个支路与乳酸回收区入口连通，乳酸回收区出口与糖洗脱区入口连通，糖洗脱区出口分成两个支路，一个支路为葡萄糖出口，另一个与硫酸洗杂区入口连通，硫酸洗杂区出口与缓冲区连同，缓冲区出口与乙酸洗脱区入口相连通；乳酸洗脱区和吸附区与其他五个区独立，乳酸洗脱区分别设立乳酸洗脱区进水口和D-乳酸出口，吸附区分别设立清液的进料口和硫酸出口。由于乳酸与乙酸相对难于分离，所以将乳酸回收区与糖洗脱区串联连接，这样可以延长床层长度，使得D-乳酸和乙酸区分的更明显，从乳酸回收区排出的D-乳酸和乙酸混合物溶液会直接进入糖洗脱区，如此，在糖洗脱区切换至乳酸洗脱区时，产物D-乳酸在乙酸前面，从而保证乙酸不从乳酸洗脱区出口出来污染D-乳酸；同理，由于硫酸与葡萄糖相对难于分离，所以将硫酸洗杂区与缓冲区相连。所述的乙酸洗脱区使用的洗脱液为水，所述的乳酸洗脱区使用的洗脱液为水，所述的糖洗脱区使用的洗脱液乳酸回收区出口得到的D-乳酸和乙酸的混合溶液，所述的硫酸洗杂区使用的洗杂液为糖洗脱区出口得到的葡萄糖溶液。
预处理后的D-乳酸发酵液上柱，上柱浓度：硫酸10g/L，葡萄糖10g/L，D-乳酸120g/L，乙酸3g/L。原料从吸附区进入系统，在吸附区末端收集硫酸；在糖洗脱区末端收集葡萄糖；洗脱液水从乳酸洗脱区进入系统，在乳酸洗脱区末端收集乳酸产品；洗脱液水也从乙酸洗脱区进入系统，在乙酸洗脱区末端收集副产物乙酸。料液流加流量为5mL/min，乙酸洗脱区洗脱剂水的流加流量为5mL/min，乳酸洗脱区洗脱剂水的流加流量为7ml/min。产品收集流量为7ml/min，硫酸氨收集流量为5ml/min，糖收集流量为3ml/min，乙酸收集流量为2ml/min，20min切换一次树脂柱。最终产品浓度可达59g/L，纯度可达到99.3％，收率可达到95.6％。副产物乙酸的收率可达98.3％，纯度可达99.1％。糖的收率可达76％，纯度可达96.7％。
Claims (8)
1.一种利用连续色谱技术从乳酸发酵液中分离乳酸的方法，其特征在于，将乳酸发酵液经过预处理得到清液，将清液泵入装有超高交联型吸附树脂的连续分离装置中进行吸附、洗杂和洗脱程序，得到D-乳酸产品；
其中，所述的连续分离装置由6～30根装有超高交联型吸附树脂的树脂柱串联组成，通过组合式阀门将连续分离装置分为吸附区、洗杂区、洗脱区和除水区四个区域，单个区域内的树脂柱保持串联，四个区域按顺序切换，清液进入吸附区进行吸附，吸附区第一根树脂柱在树脂吸附饱和后立刻移出吸附区送入洗杂区最后一根进行洗杂，洗杂区第一根树脂柱在洗杂结束后立刻移出洗杂区送入洗脱区最后一根进行洗脱，洗脱区第一根树脂柱在洗脱完成后立刻移出洗脱区送入除水区最后一根进行除水，除水区第一根树脂柱在除水完成后立刻移出除水区送入吸附区最后一根再进行吸附，如此循环的操作过程，且每个区的第1根树脂柱的状态切换同步进行，并保证至少有一根树脂柱处于吸附区；
整个连续分离装置有两个进口和两个出口，其中，两个进口分别是清液的进料口和进水口，两个出口分别是葡萄糖和硫酸混合物出口以及D-乳酸和乙酸混合物出口；
进水口位于洗脱区入口处，洗脱区出口分成两个支路，一个支路为D-乳酸和乙酸混合物出口，另一个支路与洗杂区入口连通，洗杂区出口与吸附区入口连通，清液的进料口位于吸附区入口处，吸附区出口分为两个支路，一个支路为葡萄糖和硫酸混合物出口，另一个支路与除水区入口连通，除水区出口与洗脱区入口连通；
所述的洗脱区使用的洗脱液为水，所述的洗杂区使用的洗杂液为洗脱区出口得到的D-乳酸和乙酸混合物，所述的除水区使用的除水剂为吸附区出口得到的葡萄糖和硫酸混合溶液。
2.根据权利要求1所述的利用连续色谱技术从乳酸发酵液中分离乳酸的方法，其特征在于，所述的乳酸发酵液由芽孢乳杆菌发酵制得，在发酵过程中加入碳酸钙或氨水将乳酸转化为乳酸钙或乳酸铵来缓解产物抑制作用。
3.根据权利要求2所述的利用连续色谱技术从乳酸发酵液中分离乳酸的方法，其特征在于，若发酵过程中加入碳酸钙减少产物抑制，则预处理方法是，将乳酸发酵液加热到70℃后趁热离心取上清，向上清液中加入硫酸至不产生沉淀，然后抽滤去除沉淀得到清液；若发酵过程中加入氨水减少产物抑制，则预处理方法是，将乳酸发酵液离心取上清液，向上清液中加入硫酸调节pH值至2。
4.根据权利要求3所述的利用连续色谱技术从乳酸发酵液中分离乳酸的方法，其 特征在于，预处理后得到的清液中，硫酸浓度为5～15g/L，葡萄糖浓度为5～10g/L，D-乳酸浓度为100～120g/L，乙酸浓度为2～5g/L。
5.根据权利要求1所述的利用连续色谱技术从乳酸发酵液中分离乳酸的方法，其特征在于，所述的超高交联型吸附树脂为弱极性树脂，以聚苯乙烯二乙基苯为骨架，以酯基为功能基团。
6.根据权利要求5所述的利用连续色谱技术从乳酸发酵液中分离乳酸的方法，其特征在于，所述的超高交联型吸附树脂，其比表面积为850～2000m2/g，平均粒径为0.6～1.2mm，孔径为0.5～10nm，孔容为0.22～0.66cm3/g，空隙率为65％，湿密度为1.02～1.08g/L，含水量为40～70wt％。
7.根据权利要求1所述的利用连续色谱技术从乳酸发酵液中分离乳酸的方法，其特征在于，所述的连续分离装置由如下装置替换，所述的连续分离装置由6～30根装有超高交联型吸附树脂的树脂柱串联组成，通过组合式阀门将连续分离装置分为吸附区、糖洗杂区、乳酸洗脱区、乳酸洗杂区和乙酸洗脱区五个区域，单个区域内的树脂柱保持串联，五个区域按顺序切换，清液进入吸附区进行吸附，吸附区第一根树脂柱在树脂吸附饱和后立刻移出吸附区送入糖洗杂区最后一根进行洗杂，糖洗杂区第一根树脂柱在洗杂结束后立刻移出糖洗杂区送入乳酸洗脱区最后一根进行洗脱，乳酸洗脱区第一根树脂柱在乳酸洗脱完成后立刻移出乳酸洗脱区送入乳酸洗杂区最后一根进行洗杂，乳酸洗杂区第一根树脂柱在洗杂完成后立刻移出乳酸洗杂区送入乙酸洗脱区最后一根进行乙酸的洗脱，乙酸洗脱区第一根树脂柱在乙酸洗脱完成后立刻移出乙酸洗脱区送入吸附区最后一根再进行吸附，如此循环的操作过程，且每个区的第1根树脂柱的状态切换同步进行，并保证至少有一根树脂柱处于吸附区；
整个连续分离装置有三个进口和三个出口，其中，三个进口分别是乳酸洗脱区的进水口、乙酸洗脱区的进水口和清液的进料口，三个出口分别是葡萄糖和硫酸混合物出口、D-乳酸出口以及乙酸出口；
乙酸洗脱区的进水口位于乙酸洗脱区入口处，乙酸洗脱区出口分成两个支路，一个支路为乙酸出口，另一个支路与乳酸洗杂区入口连通，乳酸洗杂区出口与糖洗杂区入口连通，糖洗杂区出口与吸附区入口连通，清液的进料口位于吸附区入口处，吸附区出口为葡萄糖和硫酸混合物出口，乳酸洗脱区与其他四个区独立且分别设立乳酸洗脱区进水 口和D-乳酸出口；
所述的乙酸洗脱区使用的洗脱液为水，所述的乳酸洗杂区使用的洗杂液为乙酸洗脱区出口得到的乙酸，所述的乳酸洗脱区使用的洗脱液为水，所述的糖洗杂区使用的洗杂液为乳酸洗杂区出口得到的D-乳酸和乙酸的混合溶液。
8.根据权利要求1所述的利用连续色谱技术从乳酸发酵液中分离乳酸的方法，其特征在于，所述的连续分离装置由如下装置替换，所述的连续分离装置由7～30根装有超高交联型吸附树脂的树脂柱串联组成，通过组合式阀门将连续分离装置分为缓冲区、吸附区、硫酸洗杂区、糖洗脱区、乳酸洗脱区、乳酸回收区和乙酸洗脱区七个区域，单个区域内的树脂柱保持串联，七个区域按顺序切换，清液进入吸附区进行吸附，吸附区第一根树脂柱在树脂吸附饱和后立刻移出吸附区送入硫酸洗杂区最后一根进行洗杂，硫酸杂区第一根树脂柱在洗杂结束后立刻移出硫酸洗杂区送入糖洗脱区最后一根进行洗脱，糖洗脱区第一根树脂柱在糖洗脱完成后立刻移出糖洗脱区送入乳酸洗脱区最后一根进行洗脱，乳酸洗脱区第一根树脂柱在洗脱完成后立刻移出乳酸洗脱区送入乳酸回收区最后一根，乳酸回收区第一根树脂柱不再有乳酸洗出后立刻移出乳酸回收区送入乙酸洗脱区最后一根进行洗脱，乙酸洗脱区第一根树脂柱在乙酸洗脱完成后立刻移出乙酸洗脱区送入缓冲区最后一根，缓冲区第一根树脂柱一检测到硫酸就立刻移出缓冲区送入吸附区最后一根再进行吸附，如此循环的操作过程，且每个区的第1根树脂柱的状态切换同步进行，并保证至少有一根树脂柱处于吸附区；
整个连续分离装置有三个进口和四个出口，其中，三个进口分别是乳酸洗脱区的进水口、乙酸洗脱区的进水口和清液的进料口，四个出口分别是葡萄糖出口、硫酸出口、D-乳酸出口以及乙酸出口；
乙酸洗脱区的进水口位于乙酸洗脱区入口处，乙酸洗脱区出口分成两个支路，一个支路为乙酸出口，另一个支路与乳酸回收区入口连通，乳酸回收区出口与糖洗脱区入口连通，糖洗脱区出口分成两个支路，一个支路为葡萄糖出口，另一个与硫酸洗杂区入口连通，硫酸洗杂区出口与缓冲区连同，缓冲区出口与乙酸洗脱区入口相连通；乳酸洗脱区和吸附区与其他五个区独立，乳酸洗脱区分别设立乳酸洗脱区进水口和D-乳酸出口，吸附区分别设立清液的进料口和硫酸出口；
所述的乙酸洗脱区使用的洗脱液为水，所述的乳酸洗脱区使用的洗脱液为水，所述的糖洗脱区使用的洗脱液乳酸回收区出口得到的D-乳酸和乙酸的混合溶液，所述的硫 酸洗杂区使用的洗杂液为糖洗脱区出口得到的葡萄糖溶液。
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