CN105052830B - 一种基于基因敲除小鼠的脂肪肝相关肝癌模型构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于基因敲除小鼠的脂肪肝相关肝癌模型构建方法，其特征在于：选用APOE‑/‑和LDLR‑/‑基因敲除小鼠，包括雌鼠和雄鼠，所述雌鼠和雄鼠配额，获得双基因敲除小鼠，设计引物，使用聚合酶链式反应即PCR反应体系鉴定小鼠基因型，所述PCR反应体系包括ApoE基因鉴定PCR反应条件和LDLR基因鉴定PCR反应条件，双基因敲除小鼠受孕，获得乳鼠，注射链脲佐菌素，在乳鼠离乳后开始高脂饮食，最后出现肝癌，经鉴定在离乳后高脂饮食两种即6周开始出现脂肪肝，8‑10周出现NASH、13‑16周出现异型增生结节、18‑24周出现肝癌。24周肝癌发生率约为100％。比单纯基因APOE‑/‑和LDLR‑/‑基因敲除小鼠高脂饮食发生NASH和HCC的时间提前24‑30周，发生率高。
Description
技术领域
本发明属于生命科学和生物技术领域，特别涉及一种基于基因敲除小鼠的脂肪肝相关肝癌模型构建方法，用于模拟人类非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关肝癌(HCC)的发生发展过程。
背景技术
HCC是世界上第五大常见的恶性肿瘤，在癌症相关死亡中居第三位。据统计，我国每年约有11万人死于肝癌，约占全世界肝癌死亡人数的45％左右。有研究显示，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)相关肝癌发病率为2.6％，与丙肝所致的肝癌发病率(4％)相当，并逐渐成为欧美等发达国家HCC的主要病因，但其确切致病机制尚未明确。
目前，用于研究肝癌的动物模型主要分为自发性肿瘤模型、移植性肿瘤模型、诱发性肿瘤模型及转基因肿瘤模型。自发性肿瘤模型由于发生肿瘤情况的不均一，且观察周期长，实验耗费大，故在日常的科研工作中很少使用。移植性肿瘤模型又可分为同种移植和异种移植，移植性实体瘤具有所种植的肿瘤部位明确、成模迅速等优点，但因缺乏类似人类原发性肝癌发生的背景是一大遗憾。诱发性及转基因动物模型可人为控制实验条件以期在限定时间内获得可靠的结果，故科研中使用较多。近年来，致癌物诱导的肝癌模型、肿瘤移植模型、病毒性肝癌模型均有很好地研究，但这些模型无法复制出人类从单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化到肝癌的过程。而NASH相关的HCC模型造模复杂，而且造模时间长，故研究很少。
因此急需建立一个类似于人类NASH相关HCC动物模型，深入研究其发生的机制，为防治NASH向HCC转化提供一个新的思路。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种能够在20-24周内模拟人类从单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎不经过纤维化到肝癌这一过程的小鼠动物模型。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种基于基因敲除小鼠的脂肪肝相关肝癌模型构建方法，其特征在于：选用APOE-/-和LDLR-/-基因敲除小鼠，包括雌鼠和雄鼠，所述雌鼠和雄鼠配额，获得双基因敲除小鼠，剪去1mm小鼠尾巴，加入250μl裂解液进行消化，抽提小鼠基因组DNA，设计引物，使用聚合酶链式反应即PCR反应体系鉴定小鼠基因型，所述PCR反应体系包括ApoE基因鉴定PCR反应条件和LDLR基因鉴定PCR反应条件，对应的引物分别为ApoE共同正向引物和LDLR共同正向引物，双基因敲除小鼠受孕，获得乳鼠，在乳鼠出生后48h-72h内，注射链脲佐菌素，在乳鼠离乳后开始高脂饮食，乳鼠6周开始出现脂肪肝，8-10周出现非酒精性脂肪性肝炎、13-16周出现异型增生结节、18-24周出现肝癌。
所述PCR反应体系为，2×TaqPCRMasterMix混合液12.5μl，模板3μl，引物各300nM，加双蒸水至25μl，所述ApoE基因鉴定PCR反应条件为：94℃温度进行预变性时间为3min、94℃温度变性时间为30s、68℃温度退火时间为40s、72℃温度延伸时间为1min，总共35个循环，最后72℃延伸2min，所述LDLR基因鉴定PCR反应条件为：94℃温度进行预变性时间为3min、94℃温度变性时间为30s、58℃温度退火时间为40s、72℃温度延伸时间为1min，总共35个循环，最后72℃延伸2min，使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，综合分析小鼠的基因型，以确定小鼠是否为双基因敲除小鼠。
引物如下：ApoE共同正向引物：5’-GCCTAGCCGAGGGAGAGCCG-3’；野生型反向引物：5’-TGTGACTTGGGAGCTCTGCAGC-3’；缺失突变型反向引物：5’-GCCGCCCCGACTGCATCT-3’.LDLR共同正向引物5’-CCATATGCATCCCCAGTCTT-3’；缺失突变型反向引物：5’-AATCCATCTTGTTCAATGGCCGATC-3’；野生型反向引物：5’-GCGATGGATACACTCACTGC-3’。
所述APOE-/-和LDLR-/-基因敲除小鼠购自南京大学模式动物研究所，货号：002052，002207，C57BL/6J品系。
所述乳鼠在出生后第五周开始高脂饮食，高脂饮食选用ResearchDiets，货号D12079B。
所述乳鼠优选为雄性。
采用以上技术方案后：本发明经鉴定在离乳后高脂饮食两种即6周开始出现脂肪肝，8-10周出现NASH、13-16周出现异型增生结节、18-24周出现肝癌。24周肝癌发生率约为100％。比单纯基因APOE-/-和LDLR-/-基因敲除小鼠高脂饮食发生NASH和HCC的时间提前24-30周，发生率高。
附图说明
图1为本发明的肝癌模型小鼠肝脏大体情况；
图2为本发明的肝癌模型小鼠肝脏油红染色和HE染色情况；
图3为本发明的图3APOE-/-基因敲除小鼠NASH模HE染色情况。
具体实施方式
本发明为一种基于基因敲除小鼠的脂肪肝相关肝癌模型构建方法，主要设计思路如下：选用APOE-/-和LDLR-/-基因敲除小鼠，包括雌鼠和雄鼠，所述雌鼠和雄鼠配额，获得双基因敲除小鼠，剪去1mm小鼠尾巴，加入250μl裂解液进行消化，抽提小鼠基因组DNA，设计引物，聚合酶链式反应(PCR)鉴定小鼠基因型，PCR反应体系包括ApoE基因鉴定PCR反应条件和LDLR基因鉴定PCR反应条件，对应的引物分别为ApoE共同正向引物和LDLR共同正向引物，双基因敲除小鼠受孕，获得乳鼠，在乳鼠出生后48h-72h内，注射链脲佐菌素，在乳鼠离乳后开始高脂饮食，乳鼠6周开始出现脂肪肝，8-10周出现非酒精性脂肪性肝炎、13-16周出现异型增生结节、18-24周出现肝癌。
对于上述的主要设计思路，具体的内容解释如下：
1)PCR反应体系为，2×TaqPCRMasterMix混合液12.5μl，模板3μl，引物各300nM，加双蒸水至25μl，所述ApoE基因鉴定PCR反应条件为：94℃温度进行预变性时间为3min、94℃温度变性时间为30s、68℃温度退火时间为40s、72℃温度延伸时间为1min，总共35个循环，最后72℃延伸2min，所述LDLR基因鉴定PCR反应条件为：94℃温度进行预变性时间为3min、94℃温度变性时间为30s、58℃温度退火时间为40s、72℃温度延伸时间为1min，总共35个循环，最后72℃延伸2min，使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，综合分析小鼠的基因型，以确定小鼠是否为双基因敲除小鼠。
2)引物如下：ApoE共同正向引物：5’-GCCTAGCCGAGGGAGAGCCG-3’；野生型反向引物：5’-TGTGACTTGGGAGCTCTGCAGC-3’；缺失突变型反向引物：5’-GCCGCCCCGACTGCATCT-3’.鉴定结果判读：由共同正向引物和野生型反向引物作为一对引物扩增出一段野生型序列，长度为155bp.则认为是野生型小鼠。由共同正向引物和缺失突变型反向引物作为一对引物仅扩增出一条序列，长度为245bp.则认为是ApoE基因敲除纯合型小鼠。若两条序列都扩增出来，则认为是ApoE基因敲除杂合型小鼠。LDLR共同正向引物5’-CCATATGCATCCCCAGTCTT-3’；缺失突变型反向引物：5’-AATCCATCTTGTTCAATGGCCGATC-3’；野生型反向引物：5’-GCGATGGATACACTCACTGC-3’。鉴定结果判读：由共同正向引物和野生型反向引物作为一对引物扩增出一段野生型序列，长度为167bp.则认为是野生型小鼠。由共同正向引物和缺失突变型反向引物作为一对引物仅扩增出一条序列，长度为350bp.则认为是LDLR基因敲除纯合型小鼠。若两条序列都扩增出来，则认为是LDLR基因敲除杂合型小鼠。
3)APOE-/-和LDLR-/-基因敲除小鼠购自南京大学模式动物研究所，货号：002052，002207，C57BL/6J品系。
4)乳鼠在出生后第五周开始高脂饮食，高脂饮食选用ResearchDiets，货号D12079B。
5)乳鼠优选为雄性。
基于上述给出的内容，具体实施例如下：
实施例1
一种基于基因敲除小鼠的脂肪肝相关肝癌模型构建方法，主要设计思路如下：选用APOE-/-和LDLR-/-基因敲除小鼠包括雌鼠和雄鼠，APOE-/-和LDLR-/-基因敲除小鼠购自南京大学模式动物研究所，货号：002052，002207，C57BL/6J品系，所述雌鼠和雄鼠配额，获得双基因敲除小鼠，剪去1mm小鼠尾巴，加入250μl裂解液进行消化，抽提小鼠基因组DNA，设计引物：ApoE共同正向引物：5’-GCCTAGCCGAGGGAGAGCCG-3’；野生型反向引物：5’-TGTGACTTGGGAGCTCTGCAGC-3’；缺失突变型反向引物：5’-GCCGCCCCGACTGCATCT-3’.LDLR共同正向引物5’-CCATATGCATCCCCAGTCTT-3’；缺失突变型反向引物：5’-AATCCATCTTGTTCAATGGCCGATC-3’；野生型反向引物：5’-GCGATGGATACACTCACTGC-3’，聚合酶链式反应鉴定小鼠基因型，PCR反应体系为，2×TaqPCRMasterMix混合液12.5μl，模板3μl，引物各300nM，加双蒸水至25μl。ApoE基因鉴定PCR反应条件为：94℃温度进行预变性时间为3min、94℃温度变性时间为30s、68℃温度退火时间为40s、72℃温度延伸时间为1min，总共35个循环，最后72℃延伸2min.LDLR基因鉴定PCR反应条件为：94℃温度进行预变性时间为3min、94℃温度变性时间为30s、58℃温度退火时间为40s、72℃温度延伸时间为1min，总共35个循环，最后72℃延伸2min.使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，综合分析小鼠的基因型，双基因敲除小鼠受孕，获得乳鼠，在乳鼠出生后48h-72h内，注射链脲佐菌素，在乳鼠离乳后开始高脂饮食，具体是乳鼠在出生后第五周开始高脂饮食，高脂饮食选用ResearchDiets，货号D12079B，结果显示8周开始出现脂肪肝，在10周出现NASH，16周出现核异常、异型增生结节，20周已表现出大量结节，在24周全部出现肝癌，部分病理结果如图1、图2所示。
实施例2(对照试验)基于APOE-/-基因敲除小鼠NASH模型
该实验展示了6周龄APOE-/-基因敲除小鼠高脂喂养4周，8周，16周肝脏HE染色结果(图3)。从图3可以看出，基因敲除小鼠在不经过STZ注射，只是单纯高脂喂养在第22周也只是表现出NASH，发展到肝癌还要很长一段时间。有文献指出，APOE-/-和LDLR-/-双基因敲除小鼠在高脂饮食35周可以自发形成肝癌。我们的模型不仅可以模拟出人类NASH不经过纤维化直接发展成HCC的过程，同时具有周期短，诱发率高，便于进行药物干预和疗效分析的优势。
本发明的有益效果：本发明经鉴定在离乳后高脂饮食两种即6周开始出现脂肪肝，8-10周出现NASH、13-16周出现异型增生结节、18-24周出现肝癌。24周肝癌发生率约为100％。比单纯基因APOE-/-和LDLR-/-基因敲除小鼠高脂饮食发生NASH和HCC的时间提前24-30周，发生率高。
Claims (6)
1.一种基于基因敲除小鼠的脂肪肝相关肝癌模型构建方法，其特征在于：选用APOE-/-和LDLR-/-基因敲除小鼠包括雌鼠和雄鼠，所述雌鼠和雄鼠配额，获得双基因敲除小鼠，剪去1mm小鼠尾巴，加入250μl裂解液进行消化，抽提小鼠基因组DNA，设计引物，使用聚合酶链式反应即PCR反应体系鉴定小鼠基因型，所述PCR反应体系包括ApoE基因鉴定PCR反应条件和LDLR基因鉴定PCR反应条件，对应的引物分别为ApoE共同正向引物和LDLR共同正向引物，双基因敲除小鼠受孕，获得乳鼠，在乳鼠出生后48h-72h内，注射链脲佐菌素，在乳鼠离乳后开始高脂饮食，乳鼠6周开始出现脂肪肝，8-10周出现非酒精性脂肪性肝炎、13-16周出现异型增生结节、18-24周出现肝癌。
2.根据权利要求1所述的一种基于基因敲除小鼠的脂肪肝相关肝癌模型构建方法，其特征在于：所述PCR反应体系为，2×TaqPCRMasterMix混合液12.5μl，模板3μl，引物各300nM，加双蒸水至25μl，所述ApoE基因鉴定PCR反应条件为：94℃温度进行预变性时间为3min、94℃温度变性时间为30s、68℃温度退火时间为40s、72℃温度延伸时间为1min，总共35个循环，最后72℃延伸2min，所述LDLR基因鉴定PCR反应条件为：94℃温度进行预变性时间为3min、94℃温度变性时间为30s、58℃温度退火时间为40s、72℃温度延伸时间为1min，总共35个循环，最后72℃延伸2min，使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，综合分析小鼠的基因型，以确定小鼠是否为双基因敲除小鼠。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于基因敲除小鼠的脂肪肝相关肝癌模型构建方法，其特征在于：所述引物如下：ApoE共同正向引物：5’-GCCTAGCCGAGGGAGAGCCG-3’；野生型反向引物：5’-TGTGACTTGGGAGCTCTGCAGC-3’；缺失突变型反向引物：5’-GCCGCCCCGACTGCATCT-3’，LDLR共同正向引物5’-CCATATGCATCCCCAGTCTT-3’；缺失突变型反向引物：5’-AATCCATCTTGTTCAATGGCCGATC-3’；野生型反向引物：5’-GCGATGGATACACTCACTGC-3’。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于基因敲除小鼠的脂肪肝相关肝癌模型构建方法，其特征在于：所述APOE-/-和LDLR-/-基因敲除小鼠购自南京大学模式动物研究所，货号：002052，002207，C57BL/6J品系。
5.根据权利要求1或2所述的一种基于基因敲除小鼠的脂肪肝相关肝癌模型构建方法，其特征在于：所述乳鼠在出生后第五周开始高脂饮食，高脂饮食选用ResearchDiets，货号D12079B。
6.根据权利要求1或2所述的一种基于基因敲除小鼠的脂肪肝相关肝癌模型构建方法，其特征在于：所述乳鼠为雄性。
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