CN105018462A

CN105018462A - 一种扩增剑状矛蚌f型线粒体基因组序列的方法

Info

Publication number: CN105018462A
Application number: CN201510274576.1A
Authority: CN
Inventors: 周春花; 柯美林; 欧阳珊; 吴小平
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2015-05-26
Filing date: 2015-05-26
Publication date: 2015-11-04

Abstract

一种快速扩增剑状矛蚌F型线粒体基因组序列的方法，通过提取总DNA、普通PCR扩增及测序、设计长片段引物、LA-PCR扩增及测序和序列拼接，获得了剑状矛蚌F型线粒体基因组序列，该序列全长15732bp，包括13个蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和28个长度为2到349bp的非编码区。本发明首次公布了获得剑状矛蚌F型线粒体基因组序列的方法，为蚌科的系统发生学、比较和进化基因组学、谱系基因组学、种质资源保护、可持续和合理地利用奠定提供重要的基础材料。

Description

一种扩增剑状矛蚌F型线粒体基因组序列的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及基因组序列的扩增方法。

技术背景

剑状矛蚌(Lanceolaria gladiola)隶属于瓣鳃纲蚌科矛蚌属，软体动物，栖息于我国湖泊、河流及池塘的沙泥底中，贝壳坚厚，中等大小，壳前端有颗粒状的花纹，贝壳多呈灰褐色，外形窄长，呈剑状。长度约为高度的4.5倍。蚌类具有一定的经济价值，如培育珍珠，发展我国的珍珠养殖业，提取抗肿瘤成分，许多贝壳较厚的种类可作为制造纽扣贝雕等工艺品的原料，一些贝壳闪亮的珍珠层可以用来制造各种精美的螺细、器皿和家具等。此外，淡水贝壳的石灰质可作为家禽的饲料，软体部分可供食用，是肉食性鱼类的良好饲料，对水环境中Cu、Zn和Cd有去除与积累的作用，吸收富集重金属，改良水质。蚌科动物是淡水贝类最大的一个科，包括674个物种，淡水蚌类是淡水生态系统中一类重要的水生生物，作为滤食者，能够通过滤食营养物质、有机物和浮游生物来改良水质，对水环境还有生物监测的作用。淡水蚌类在淡水生态系统中不可或缺，其生物量和密度往往都在底栖动物中占优势，对淡水生态系统有重要作用，如果淡水湖泊或者是河流中的淡水蚌类消失，将会引起一系列的生态问题。总而言之，淡水蚌类对淡水生态系统至关重要，对水体的水质、物质循环和能量流动作用巨大，且具有较高的营养、经济和生态价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速扩增剑状矛蚌F型线粒体基因组序列的方法。为了实现上述目的，本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现。

本发明所述方法包括下列步骤：

(1)提取蚌的总DNA；

(2)利用保守引物分别对cox1、16SrRNA和nad1基因进行普通PCR扩增并测序；

(3)根据测序结果设计长片段引物进行LA-PCR扩增并测序；

(4)序列拼接；

(5)基因注释。

所述的长片段引物包括以下三对：

COI-16S-F：5'CGTAACAGCCCAAACAAATA 3'

COI-16S-R：5'CAGAGGTACAAGAAAAGGTAAAGT 3'

16S-NDI-F：5'TGGGGCAATCTTGGAACC 3'

16S-NDI-R：5'GCTATAAACAGGAAAGCAAAACC 3'

NDI-COI-F：5'TAGTCTCAGGGTTCAACATCG 3'

NDI-COI-R：5'CACTCTGGGGCTTCGGT 3'。

本发明首次公开了剑状矛蚌的线粒体基因组，也是首次公开了一种扩增剑状矛蚌线粒体基因组序列的方法，可以为蚌科的线粒体基因组学研究和种质资源保护提供重要的基础材料。

线粒体基因组DNA是裸露的双链超螺旋共价闭合环状分子，少数为线状分子(如原生动物草履虫与四膜虫的mtDNA)，是真核细胞的第二遗传信息系统，或称核外基因及其表达体系。相对于核DNA，mtDNA具有分子量小、多态性高、结构简单、碱基突变率高、母系遗传、进化速度快等特点，已被广泛应用于生理病理、临床诊断、遗传变异、分子标记、系统进化等多方面的研究，与线粒体和线粒体基因组相关的研究已成为临床医学、进化生物学、基因组学、生物信息学等生命科学领域的研究热点和前沿。

蚌科动物线粒体的遗传不单单是母系遗传，还存在线粒体基因组遗传的一种特例——双单亲遗传现象(Doubly-Uniparental Inheritance,DUI)。这种遗传方式使后代中雌性mtDN只来自母系(female-transmitted,F type)，与严格的母系遗传相似；而雄性的mtDNA来自双亲，在体细胞中存在F型mtDNA，在精巢中存在父系mtDNA(male-transmitted,M type)。

本发明的有益效果：通过设计的特异性长片段引物，通过LA-PCR技术对剑状矛蚌F型线粒体基因组进行扩增，再进行测序、拼接和校正，获得了剑状矛蚌F型线粒体基因组全序列。本发明获得的剑状矛蚌F型线粒体基因组序列总长15732bp，可从组成和结构的角度对剑状矛蚌F型线粒体基因组进行分析，可以丰富蚌科线粒体基因组信息，为蚌类的系统发育、种质资源保护、可持续和合理地利用奠定重要的分子遗传学理论基础。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种扩增剑状矛蚌F型线粒体基因组序列的方法如下：

1、总DNA提取：

使用购自天根生化科技有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，提取剑状矛蚌的总DNA，包括以下步骤：

(1)剪取剑状矛蚌新鲜闭壳肌组织100-150mg，置于1.5ml已灭菌离心管中，用洁净的灭好菌的剪刀充分剪碎放入装有200l GA缓冲液的离心管中，涡旋振荡15sec。

(2)加入20l proteinase K(20mg/ml)溶液，涡旋混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。在56℃放置，直至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(3)加入200l缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(4)加入200l无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13400*g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(6)向吸附柱CB3中加入500l缓冲液GD(GD中已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400*g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600l漂洗液PW(PW中已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400*g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(8)重复操作步骤7。

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(～13400*g)离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm(～13400*g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

(11)将纯化好的线粒体DNA置于-20℃保存，以备后用。

2、普通PCR扩增及测序：

对于剑状矛蚌F型线粒体的cox1、16SrRNA和nad1基因的扩增分别采用LCO1490/HCO2198、16SarL/16SbrH和Leu-uurF/LoGlyR引物扩增。扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。包括以下几个步骤：

(1)cox1、16SrRNA和nad1三个基因所用引物的选择，用于扩增剑状矛蚌F型线粒体基因片段的是cox1、16SrRNA和nad1的通用引物，

所述cox1通用引物的序列为F：5’GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 3’和R：5’TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3’；

所述16SrRNA的通用引物的序列为F：5’CGCCTGTTTATCAAAAACAT 3’和R：5’CCGGTCTGAACTCAGATCACGT 3’；

所述nad1的通用引物的序列为F：5’TGGCAGAAAAGTGCATCAGATTAAAGC3’和R：5’CCTGCTTGGAAGGCAAGTGTACT 3’；

(2)三个基因片段扩增的PCR反应：反应的模板为上述提取的剑状矛蚌的总DNA100ng，反应总体系为50μl，其中10×Ex Taq PCR Buffer 5μl，

dNTPs4μl、各2.5mmol/L，引物各2μl、0.4μmol/L，LATaq酶0.25μl、2.5U；

PCR反应条件为：98℃预变性10sec；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，循环35次；最后72℃延伸7min。

3、LA-PCR扩增及测序

把cox1、16SrRNA和nad1基因的部分片段的测序结果在NCBI中进行nucleotideblast，确定都为蚌科动物线粒体DNA基因片段且均为正义链。利用Primer premier5.0将前期得到的cox1、16SrRNA和nad1基因三段序列为模板设计三对长PCR引物结果为：

COI-16S-F：5'CGTAACAGCCCAAACAAATA 3'

COI-16S-R：5'CAGAGGTACAAGAAAAGGTAAAGT 3'

16S-NDI-F：5'TGGGGCAATCTTGGAACC 3'

16S-NDI-R：5'GCTATAAACAGGAAAGCAAAACC 3'

NDI-COI-F：5'TAGTCTCAGGGTTCAACATCG 3'

NDI-COI-R：5'CACTCTGGGGCTTCGGT 3'

使用设计的三对长PCR引物及TaKaLa生物公司的LA Taq聚合酶进行扩增；LA-PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，68℃延伸5min，30个循环；最后72℃延伸10min。LA-PCR产物产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，有清晰的条带；产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

4、序列拼接

把实验所得的全部序列片段利用DNASTAR7.1软件中的SeqMan组件进行拼接，组装成一条首尾相接的序列，并仔细检查，对照测序峰图人工校正序列中相冲突的位点，校正完后再利用SeqMan把首尾的重复序列去除其中一个，最终得到完整的线粒体DNA全序列。

5、基因注释

剑状矛蚌F型线粒体DNA全序列的注释参考珠蚌亚科已测物种的线粒体DNA，用在线工具ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)和Blast查找线粒体基因组的13个蛋白质基因，利用在线工具ARWEN(http://130.235.46.10/ARWEN)和MITOS(http://mtos.biinf.unileizig.de/help.py)查找22个tRNA基因和2个rRNA基因以及控制区(Control Region，CR)。该序列总长15732bp。包括13个蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和28个长度为2～328bp不等的非编码区。其中ND3～ND5、ND4L、COI～COIII、ATP6、ATP8、tRNAAsp、tRNAHis在H链编码，其他基因在L链上编码，这与其他淡水蚌类基因编码方式一致。F型剑状矛蚌Nad2与tRNAMet之间存在1bp的重叠，线粒体基因组的排列算得上紧密，没有间隔的基因对总共有9处。动物线粒体基因虽然没有内含子，但是存在28处的基因间隔序，间隔的序列总长度为1029bp。

Claims

1.一种扩增剑状矛蚌F型线粒体基因组序列的方法，其特征是包括下列步骤：

(1)提取蚌的总DNA；

(3)根据测序结果设计长片段引物进行LA-PCR扩增并测序；

(4)序列拼接；

(5)基因注释。

2.根据权利要求1所述的扩增剑状矛蚌F型线粒体基因组序列的方法，其特征是所述的长片段引物包括以下三对：

COI-16S-F：5' CGTAACAGCCCAAACAAATA 3'

COI-16S-R：5' CAGAGGTACAAGAAAAGGTAAAGT 3'

16S-NDI-F：5' TGGGGCAATCTTGGAACC 3'

16S-NDI-R：5' GCTATAAACAGGAAAGCAAAACC 3'

NDI-COI-F：5' TAGTCTCAGGGTTCAACATCG 3'

NDI-COI-R：5' CACTCTGGGGCTTCGGT 3'。