CN105039547A - 灿烂弧菌的pcr检测引物及其检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了灿烂弧菌的PCR检测引物及其检测方法和应用，特点是针对灿烂弧菌<i>fur</i>基因的DNA序列设计PCR引物，设计的PCR引物序列为：VSFur？RTF3：5’-ACAACAACCAGATTGCCAACA-3’；VSFurRTR3：5’-GATAACTTCACCGCAGTCTAAACAT-3’？，其检测方法包括以下步骤：（1）海水、刺参表皮、刺参肌肉或刺参体腔液基质的制备；（2）25？μL的PCR反应体系建立；（3）PCR反应，最后进行琼脂糖凝胶电泳进行结果分析，该PCR检测引物可用于海水、刺参表皮、刺参肌肉和刺参体腔液中的灿烂弧菌的检测，优点是检测速度快、灵敏度高。

Description

灿烂弧菌的PCR检测引物及其检测方法和应用
技术领域
本发明涉及灿烂弧菌的检测，尤其是涉及灿烂弧菌的PCR检测引物及其检测方法和应用。
背景技术
灿烂弧菌（Vibriosplendidus）广泛存在于海洋环境，属革兰氏阴性菌，杆状，可运动，有极生单鞭毛，分生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，二者均有致病性，是海洋动物重要致病菌之一，可感染棘皮动物、双壳贝类和甲壳类等宿主，导致水产养殖病害的发生。因此，为了满足水产养殖过程中对该菌的快速诊断和早期预警控制的要求，该菌的灵敏快速检测具有重要的意义。
灿烂弧菌的检测方法主要有免疫学检测和分子生物学检测等方法，这些方法均可为灿烂弧菌的快速定性诊断提供技术依据。选择合适的分子靶标，开发灵敏度高、特异性强的核酸标识序列应用于PCR方法中，以进行灿烂弧菌快速检测方法具有重要的现实意义。目前已用于检测灿烂弧菌的靶标分子包括16S-23S核糖体RNA基因间隔区序列、gyrB基因和鞭毛相关基因FlgF等。根据灿烂弧菌的16S-23S核糖体RNA基因间隔区扩增的177bp的地高辛标记的探针，进行斑点检测方法可检测6.25pg的灿烂弧菌DNA；利用gyrB基因作为靶基因，设计引物进行SYBRGreenI实时定量PCR可检测到20个拷贝的灿烂弧菌。
铁吸收调控蛋白（Ferricuptakeregulator，Fur）是革兰氏阴性菌中重要的核心调控因子之一，几乎所有的细菌中均含有该类调控蛋白。Fur在细菌体内的功能是根据细胞质中铁离子的有效浓度来调节体内的铁代谢。Fur蛋白是由17kDa亚单位组成的二聚体，每个亚基可以结合一个Fe2+，当细胞质中Fe2+充足时，Fur蛋白和Fe2+结合，以复合物的形式结合到铁吸收调控基因的启动子区域阻遏与铁代谢相关基因的转录，而当Fe2+缺乏时，Fur蛋白便从启动子区域解离下来，启动菌体内与铁代谢相关基因的表达。目前，国内外还没有公开任何关于利用根据灿烂弧菌的fur基因的DNA序列设计特异的核酸标识序列用于普通PCR，进行灿烂弧菌检测的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、灵敏度高的PCR检测引物及其检测方法和在灿烂弧菌检测中的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种灿烂弧菌的PCR检测引物，针对灿烂弧菌fur基因的DNA序列设计PCR引物，设计的PCR引物序列为：
正向引物VSFurRTF3：5’-ACAACAACCAGATTGCCAACA-3’
反向引物VSFurRTR3：5’-GATAACTTCACCGCAGTCTAAACAT-3’。
一种灿烂弧菌的PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）25μL的PCR的反应体系建立：2.5μL的10×PCR缓冲液，0.5μL的10μmol/L正向引物VSFurRTF3，0.5μL的10μmol/L反向引物VSFurRTR3，2μL的dNTP混合物，1μL的样品模板，0.25μL的TaqDNA聚合酶，18.25μL的灭菌双蒸水；
（2）PCR反应：94℃变性5min，然后94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸20秒，40个循环，最后72℃继续延伸10分钟，最后进行琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。
所述的正向引物VSFurRTF3序列为：5’-ACAACAACCAGATTGCCAACA-3’；反向引物VSFurRTR3序列为：5’-GATAACTTCACCGCAGTCTAAACAT-3’。
所述的10×PCR缓冲液的配方为pH8.4的200mmol/LTris–HCl,200mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2；所述的dNTP混合物为dATP、dGTP、dCTP和dTTP的浓度分别为2.5mmol/L。
一种灿烂弧菌的PCR检测引物的应用，该PCR检测引物可用于海水、刺参表皮、刺参肌肉和刺参体腔液中的灿烂弧菌的检测。该方法对灿烂弧菌浓度的检出线可低至102CFU/mL。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明灿烂弧菌的PCR检测引物及其检测方法和应用，该对引物针对灿烂弧菌的fur基因DNA序列设计，因此用灿烂弧菌的DNA或菌液作为PCR反应的模板能够得到扩增的fur基因，因此在凝胶电泳分析后能够看到223bp的DNA片段；而在本实验中测定的其它种细菌中含有的fur基因与灿烂弧菌的fur基因在碱基组成上差异较大，因此用其它种细菌的DNA或菌液作为PCR反应的模板不能够得到fur基因的部分序列，因此在凝胶电泳分析后就不能够看到223bp的DNA片段。该PCR检测引物可检测海水、刺参表皮、刺参肌肉和刺参体腔液等多种不同环境和仿刺参生物体中的灿烂弧菌。具有操作简便、检测速度快速、检测结果易于观察、灵敏度高、可实现半定量检测及检测线低等优点。
附图说明
图1为灿烂弧菌fur基因与其它细菌fur基因的序列比对；1：灿烂弧菌fur基因的DNA序列；2：溶藻弧菌fur基因的DNA序列；3：副溶血弧菌的fur基因的DNA序列；4：哈维氏弧菌fur基因的DNA序列；
图2为灿烂弧菌PCR检测引物的特异性试验。泳道6和泳道8：以灿烂弧菌Vs和HS0的菌体细胞作为PCR反应的模板；泳道7：DNA分子量标准：自上而下分别是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。泳道1-6和9-10：分别以科氏葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、巴西弧菌、希瓦氏菌、霍乱弧菌、Vibriogigantissp.nov.和Vibriocyclitrophicus等细菌菌体作为PCR反应的模板；
图3为灿烂弧菌PCR检测引物用于检测海水环境中的灿烂弧菌。用于PCR的模板分别为：泳道1，海水，泳道2-10，海水中分别添加1.0×100CFUmL-1、1.0×101CFUmL-1、1.0×102CFUmL-1、1.0×103CFUmL-1、1.0×104CFUmL-1、1.0×105CFUmL-1、1.0×106CFUmL-1、1.0×107CFUmL-1和1.0×108CFUmL-1的灿烂弧菌；泳道11，DNA分子量标准；
图4为灿烂弧菌PCR检测引物用于检测刺参表皮组织中的灿烂弧菌。用于PCR的模板分别为：泳道1，刺参表皮匀浆液，泳道2-10，表皮匀浆液中分别添加1.0×100CFUmL-1、1.0×101CFUmL-1、1.0×102CFUmL-1、1.0×103CFUmL-1、1.0×104CFUmL-1、1.0×105CFUmL-1、1.0×106CFUmL-1、1.0×107CFUmL-1和1.0×108CFUmL-1的灿烂弧菌。泳道11，DNA分子量标准；
图5为灿烂弧菌PCR检测引物用于检测刺参肌肉组织中的灿烂弧菌。用于PCR的模板分别为：泳道1，刺参肌肉匀浆液，泳道2-10，肌肉匀浆液中分别添加1.0×100CFUmL-1、1.0×101CFUmL-1、1.0×102CFUmL-1、1.0×103CFUmL-1、1.0×104CFUmL-1、1.0×105CFUmL-1、1.0×106CFUmL-1、1.0×107CFUmL-1和1.0×108CFUmL-1的灿烂弧菌。泳道11，DNA分子量标准；
图6为灿烂弧菌PCR检测引物用于检测刺参体腔液中的灿烂弧菌。用于PCR的模板分别为：泳道1，刺参体腔液，泳道2-10，体腔液中分别添加1.0×100CFUmL-1、1.0×101CFUmL-1、1.0×102CFUmL-1、1.0×103CFUmL-1、1.0×104CFUmL-1、1.0×105CFUmL-1、1.0×106CFUmL-1、1.0×107CFUmL-1和1.0×108CFUmL-1的灿烂弧菌。泳道11，DNA分子量标准。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例1
灿烂弧菌fur基因的DNA序列与其它弧菌的fur基因的DNA序列比对
将灿烂弧菌Vs中fur基因的DNA序列（图1，DNAMAN1）与NCBI中得到的其它弧菌，包括溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌中fur基因的DNA序列，于DNAMAN软件中的“多重序列比对”模块进行DNA相似性分析，结果如图1所示。fur Vs 的核酸序列与溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌的同源性仅为78%左右，因此可用作灿烂弧菌检测的特异标签。
具体实施例2
灿烂弧菌PCR检测引物的设计及PCR方法的建立
利用Primer5.0设计引物，得到灿烂弧菌PCR检测引物VSFurRTF3：5’-ACAACAACCAGATTGCCAACA-3’和VSFurRTR3：5’-GATAACTTCACCGCAGTCTAAACAT-3’。其中VSFurRTF3位于同源性非常低的位置，因此可以用来特异检测灿烂弧菌。以VSFurRTF3和VSFurRTR3分别为正向引物和反向引物，25μL的PCR的反应体系中，分别加入以下的物质制成PCR反应混合液：2.5μL的10×PCR缓冲液(200mmolL-1Tris–HCl(pH8.4),200mmolL-1KCl,15mmolL-1MgCl2)，0.5μL的10μmolL-1正向引物，0.5μL的10μmolL-1反向引物，2μL的dNTP混合物(dATP、dGTP、dCTP和dTTP的浓度分别为2.5mmolL-1)，1μL的模板，0.25μL的TaqDNA聚合酶和18.25μL的灭菌双蒸水。PCR体系的反应条件为94℃变性5min，然后94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸20秒，从第二步开始进行40个循环，最后72℃继续延伸10分钟。取5μL的PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳结果在凝胶成像分析系统中进行分析，检测PCR产物的有无和大小。
为了检测该PCR方法用于检测灿烂弧菌的特异性，在本案列中选用了其它的细菌，尤其是包含哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌等弧菌，同时进行PCR扩增并进行凝胶电泳。凝胶电泳结果如图2所示，灿烂弧菌菌株Vs和HS0均可得到阳性克隆，而其它细菌均无明显的阳性条带产生。因此，将引物VSFurRTF3/VSFurRTR3用于PCR反应可以进行灿烂弧菌的特异检测。
具体实施例3
灿烂弧菌PCR检测引物用于检测海水中的灿烂弧菌，具体步骤如下：
（1）海水过滤除菌后，利用上述具体实施例2建立的PCR方法进行灿烂弧菌的检测。结果表明，利用该方法对海水中的灿烂弧菌进行检测呈现阴性结果。因此利用灿烂弧菌的加标方法进行海水中灿烂弧菌的检测；
（2）将生长至OD600约为0.5的灿烂弧菌，按10倍的浓度梯度稀释到终浓度分别为1.0×108，1.0×107，1.0×106，1.0×105，1.0×104，1.0×103，1.0×102，1.0×101和1.0×100CFUmL-1的海水中，分别取1μL作为PCR反应的模板；
（3）25μL的PCR的反应体系，分别加入以下体积的物质：2.5μL的10×PCR缓冲液(200mmolL-1Tris–HCl(pH8.4)，200mmolL-1KCl,15mmolL-1MgCl2)，0.5μL的10μmolL-1正向引物，0.5μL的10μmolL-1反向引物，2μL的dNTP混合物(dATP、dGTP、dCTP和dTTP的浓度分别为2.5mmolL-1)，1μL的模板，0.25μL的TaqDNA聚合酶和18.25μL的灭菌双蒸水。PCR体系的反应条件为94℃变性5min，然后94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸20秒，从第二步开始进行40个循环，最后72℃继续延伸10分钟，5μL的PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳；
（4）结果如图3所示，从1.0×108到1.0×103CFUmL-1的灿烂弧菌稀释液，经过如上的PCR反应后能够得到强阳性的结果；1.0×102CFUmL-1的灿烂弧菌稀释液经过PCR后有时可得到弱的阳性结果，而有时得不到相应的PCR产物，在凝胶电泳分析中呈现的阳性结果不够稳定。
具体实施例4
灿烂弧菌PCR检测引物用于检测刺参组织中的灿烂弧菌，具体步骤如下：
（1）取健康刺参的表皮组织、肌肉组织和体腔液。6g的刺参表皮和肌肉分别加入2mL的磷酸盐缓冲液PBS于匀浆器中进行匀浆，匀浆液在10，000rpm离心5min，收集上清液。分别取1μL的刺参表皮、刺参肌肉和刺参体腔液作为模板，采用上述具体实施例2建立的PCR方法进行PCR反应。结果表明，利用该方法检测健康的刺参表皮、肌肉和体腔液基质中灿烂弧菌，结果显示为阴性。因此利用加标准样品的方法进行刺参表皮、肌肉和体腔液中灿烂弧菌的检测；
（2）25μL的PCR的反应体系，分别加入以下体积的物质：2.5μL的10×PCR缓冲液(200mmolL-1Tris–HCl(pH8.4),200mmolL-1KCl,15mmolL-1MgCl2)，0.5μL的10μmolL-1正向引物，0.5μL的10μmolL-1反向引物，2μL的dNTP混合物(dATP、dGTP、dCTP和dTTP的浓度分别为2.5mmolL-1)，1μL的模板，0.25μL的TaqDNA聚合酶和18.25μL的灭菌双蒸水。PCR体系的反应条件为94℃变性5min，然后94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸20秒，从第二步开始40个循环，最后72℃继续延伸10分钟，5μL的PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳；
（3）5μL的PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果在凝胶成像分析系统中进行分析。
在刺参表皮组织中，灿烂弧菌的检测结果如图4所示，浓度从1.0×108到1.0×105CFUmL-1的稀释液为阳性结果；在刺参肌肉中，灿烂弧菌的检测结果如图5所示，浓度为1.0×108到1.0×103CFUmL-1的灿烂弧菌稀释液，经PCR反应后能够得到强阳性的结果，1.0×102CFUmL-1的灿烂弧菌有时能够得到弱的阳性结果，而有时得不到相应的PCR产物，在凝胶电泳分析中呈现的阳性结果不稳定；在刺参体腔液中，灿烂弧菌的检测结果如图6所示，浓度为1.0×108到1.0×102CFUmL-1的灿烂弧菌稀释液，PCR反应后能够得到强阳性的结果。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (4)

1.一种灿烂弧菌的PCR检测引物，其特征在于：针对灿烂弧菌fur基因的DNA序列设计PCR引物，设计的PCR引物序列为：
正向引物VSFurRTF3：5’-ACAACAACCAGATTGCCAACA-3’
反向引物VSFurRTR3：5’-GATAACTTCACCGCAGTCTAAACAT-3’。
2.一种按权利要求1所述的灿烂弧菌的PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）25μL的PCR的反应体系建立：2.5μL的10×PCR缓冲液，0.5μL的10μmol/L正向引物VSFurRTF3，0.5μL的10μmol/L反向引物VSFurRTR3，2μL的dNTP混合物，1μL的样品模板，0.25μL的TaqDNA聚合酶和18.25μL的灭菌双蒸水；
（2）PCR反应：94℃变性5min，然后94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸20秒，40个循环，最后72℃继续延伸10分钟，最后进行琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。
3.根据权利要求2所述的灿烂弧菌的PCR检测方法，其特征在于：所述的正向引物VSFurRTF3序列为：5’-ACAACAACCAGATTGCCAACA-3’；反向引物VSFurRTR3序列为：5’-GATAACTTCACCGCAGTCTAAACAT-3’。
4.一种按权利要求1所述的灿烂弧菌的PCR检测引物的应用，其特征在于：该引用应用于PCR检反应可用于海水、刺参表皮、刺参肌肉和刺参体腔液中灿烂弧菌的检测。
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