CN105037466A - 一种从田基黄中提取分离白前苷b的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从田基黄中提取分离白前苷B的方法，取田基黄药材，加入水加热提取，滤过，收集滤液，浓缩至相当于每毫升相当于含田基黄药材生药量0.5～2g；加入聚乙二醇溶液，混匀，再加入一定量乙酸乙酯萃取，振荡，静置使分成不相溶的两层；取乙酸乙酯层，浓缩回收乙酸乙酯，得固体，适量水洗，干燥，得粉末状黄色提取物，即得。和现有技术中所用多步、多种柱色谱方法相结合的工艺相比本发明的制备方法简便，使用仪器简单，适宜放大化工业生产，进行大规模提取分离。
Description
技术领域
本发明涉及一种从田基黄中提取分离白前苷B的方法，属于中药活性成分提取领域。
背景技术
白前苷B(vincetoxicosideB)，又名槲皮素-7-鼠李糖苷，为黄酮醇类化合物，主要药理作用有如下几个方面：(1)抗病毒作用：对乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心抗原(HBeAg)检测试剂实验，结果表明能显著抑制乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心抗原(HBeAg)，具有显著防治乙肝病毒作用。DurHan-Kwon等(Kwon,DurHan；Choi,WhaJeong；Lee,ChoongHwan；Kim,JinHee；Kim,ManBae.Flavonoidcompoundhavinganantiviralactivity.WO2007069823，KR720151.)从中药鱼腥草中采用色谱的方法分离得到该化合物，实验研究显示出抗轮状病毒和鼻病毒活性。(2)保肝作用：研究表明小鼠腹腔注射槲皮素-7-鼠李糖苷具有较好的保肝退黄作用。(3)抗菌作用：BonillaRivera,PabloE.等(BonillaRivera,PabloE.；LockdeUgaz,Olga；JurupeChico,Hilda.Chemical-biologicalstudyofWerneriadactilophylla[J].BoletindelaSociedadQuimicadelPeru，1991，57(3):182-188.)从Werneriadactilophylla中分离得到白前苷B等几种黄酮化合物并证明体外对多种细菌具有抗菌活性。
田基黄为藤黄科金丝桃属植物地耳草(HypercumjaponicumThunb.)的干燥全草，目前，针对田基黄活性成分的分离提取的研究广泛，但得到的提取产物多为总黄酮类化合物。易运红等(正交试验法优选田基黄中总黄酮提取工艺，易云红等，化工技术与开发，2010年12月第39卷第12期)采用正交试验法优选田基黄中总黄酮提取工艺，用乙醇提取田基黄得到总黄酮提取物；傅芃等(田基黄黄酮类化学成分的研究，傅芃等，中国天然药物，2004,2(5))用多种色谱方法对田基黄乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分进行化学成分分离，从田基黄中分离得到7个黄酮类化合物；中国专利文献CN1660253A中公开了一种提取田基黄方法，提取物中含有紫杉叶素-7-鼠李糖苷(Taxifolin-7-rhamnoside)、异槲皮苷(Isoquercitrin)、槲皮苷(Quercitrin)、白前苷(VincetoxicosideB)、槲皮素(Quercetin)五种化合物；上述研究中均未能分离提取单一的白前苷化合物。
现有技术中针对白前苷B的提取研究主要采用多步骤、多种色谱方法相结合的方式，专利文献CN1470518A公开了一种从田基黄中提取白前苷B单体的方法，是将药材粉碎水提取后，进行二次柱分离，得白前苷B单体；非专利文献(JinyongPeng,GuorongFan,andYutianWu.PreparativeSeparationandIsolationofThreeFlavonoidsandThreePhloroglucinolDerivativesfromHypericumjaponicumThumb.usingHigh-SpeedCountercurrentChromatographybyStepwiseIncreasingtheFlowRateoftheMobilePhase.JournalofLiquidChromatography&RelatedTechnologies,29:1619–1632,2006)采用高速逆流色谱法从田基黄醇提物中一次性分得68mg纯度为95.6％的白前苷B。上述提取方法需要将提取与色谱方法结合，分离方法复杂，不适用于大规模提取分离。鉴于此，研究一种方法简单、可以用于产业化生产的提取单一白前苷B的分离方法是本发明亟待解决的问题。
发明内容
因此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中的单一白前苷B分离方法步骤复杂、不适用于大规模分离提取的技术缺陷，从而提出一种提取方法简单、可以用于产业化生产的提取单一白前苷B的分离方法。
本发明提供一种白前苷B的制备方法，包括：
取田基黄药材，加入水加热提取，滤过，收集滤液，浓缩至相当于每体积份相当于含田基黄药材生药量0.5～2重量份；加入生药量0.5-2倍聚乙二醇溶液，混匀，再加入生药量0.5-2倍乙酸乙酯萃取，振荡，静置使分成不相溶的两层；取乙酸乙酯层，浓缩回收乙酸乙酯，得固体，适量水洗，干燥，得粉末状黄色提取物，即得，所述重量份与体积份比例为g/ml。
上述制备白前苷B的方法中，优选聚乙二醇的型号为PEG600-4000，优选聚乙二醇浓度10wt％-20wt％，优选提取次数为1-3次；优选聚乙二醇型号为PEG600，浓度15wt％，萃取2-3次。
上述制备白前苷B的方法中，优选加水加热回流提取时加水量为5-15倍，提取0.3-1小时；更优选加水量为10倍，提取0.5小时。
上述制备白前苷B的方法中，所述白前苷B的含量为>80％，优选>90％。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明采用聚乙二醇水溶液和乙酸乙酯构成两相体系，利用聚乙二醇对黄酮的高溶解能力，选择性的使白前苷B保留在乙酸乙酯层，而田基黄中的其他黄酮类成分及其他极性相近成分(比白前苷B极性稍大)截留到聚乙二醇层，从而达到精确萃取的目的。通过聚乙二醇/乙酸乙酯选择性萃取黄酮单体，效果良好。和现有技术中所用多步、多种柱色谱方法相结合的工艺相比本发明的制备方法简单，使用材料简单，适宜放大化工业生产，进行大规模提取分离。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
取3000克田基黄药材，分批多次加水加热回流提取。提取3次，每次加水5倍量，提取0.5小时，滤过，合并所有滤液，浓缩至稠浸膏，减压低温干燥至半固体状。平行分成3份，每份相当于田基黄药材1000克。
配制20wt％的PEG600水溶液适量，加入等量的乙酸乙酯使分层。备用。
每份提取物(相当于田基黄药材1000克)用加入上述液体分散分离，重复一次，每次用量1升。合并上层溶液，减压回收至近干。以少许去离子水搅拌，滤过，所得固体在自然状态下干燥至近干，80℃干燥，即得白前苷B样品。
实施例2
取3000克田基黄药材，分批多次加水加热回流提取。提取2次，每次加水5倍量，提取1小时，滤过，合并所有滤液，浓缩至稠浸膏，减压低温干燥至半固体状。平行分成3份，每份相当于田基黄药材1000克。
配制15wt％的PEG2000水溶液适量，加入等量的乙酸乙酯使分层。备用。
每份提取物(相当于田基黄药材1000克)用加入上述液体分散分离，重复一次，每次用量1升。合并上层溶液，减压回收至近干。以少许去离子水搅拌，滤过，所得固体在自然状态下干燥至近干，80℃干燥，即得白前苷B样品。
实施例3
取3000克田基黄药材，分批多次加水加热回流提取。提取3次，每次加水15倍量，提取0.3小时，滤过，合并所有滤液，浓缩至稠浸膏，减压低温干燥至半固体状。平行分成3份，每份相当于田基黄药材1000克。
配制10wt％的PEG4000水溶液适量，加入等量的乙酸乙酯使分层。备用。
每份提取物(相当于田基黄药材1000克)用加入上述液体分散分离，重复一次，每次用量1升。合并上层溶液，减压回收至近干。以少许去离子水搅拌，滤过，所得固体在自然状态下干燥至近干，80℃干燥，即得白前苷B样品。
实施例4
取3000克田基黄药材，分批多次加水加热回流提取。提取2次，每次加水10倍量，提取0.5小时，滤过，合并所有滤液，浓缩至稠浸膏，减压低温干燥至半固体状。平行分成3份，每份相当于田基黄药材1000克。
配制15wt％的PEG600水溶液适量，加入等量的乙酸乙酯使分层。备用。
每份提取物(相当于田基黄药材1000克)用加入上述液体分散分离，重复一次，每次用量1升。合并上层溶液，减压回收至近干。以少许去离子水搅拌，滤过，所得固体在自然状态下干燥至近干，80℃干燥，即得白前苷B样品。
取500克田基黄药材，加水加热回流提取两次，每次加水10倍量，提取0.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至稠浸膏，减压低温干燥至半固体状。
实验例1白前苷B萃取条件的优化与筛选
分别按表1因素及水平所列的PEG规格配比构成双相体系(另一相为乙酸乙酯)进行试验。加入水提田基黄提取物1g，超声溶解，在2000r/min的转速下离心5min。
分别吸取各双水相体系的上下相，用旋蒸仪分别浓缩至近干，加甲醇定容至25ml容量瓶中，微孔滤膜滤过，将进样瓶放入高效液相色谱仪，确定设备参数和液相色谱条件为：流动相为甲醇：醋酸(PH＝2.7)＝40:60，检测波长255nm，检测时间为50min。
表1因素及水平表
表2试验结果
结果表明：实验结果见表2，液液分离时，水相采用PEG4000以下型号的较好。随着PEG分子量的增大，PEG水溶液的空间阻力相应增大，疏水性增强，根据相似相溶原理，疏水性的田基黄中黄酮更多的分配在PEG相，故PEG分子量不同，所使用的用来分离白前苷B的PEG溶液的浓度也有所不同，发明所用PEG优选为相对分子量较小的PEG600，浓度为15wt％，萃取2-3次效果较好。
实验例2放大萃取分离实验(I)
取3000克田基黄药材，提取两次，每次加水10倍量，提取0.5小时，滤过，合并所有滤液，浓缩至稠浸膏，减压低温干燥至半固体状。平行分成3份，每份相当于田基黄药材1000克。
配制15wt％的PEG600水溶液500ml，加入等量的乙酸乙酯使分层，备用。
每份提取物(相当于田基黄药材1000克)加入到上述液体中，分散分离，重复一次，合并上层溶液，减压回收至近干。以少许去离子水搅拌，滤过，所得固体在自然状态下干燥至近干，80℃干燥，即得白前苷B样品。见表3，三批次白前苷B的纯度均在90％以上。
表3放大萃取分离实验
实验例3放大萃取分离实验(II)
取3000克田基黄药材，提取两次，每次加水10倍量，提取0.5小时，滤过，合并所有滤液，浓缩至稠浸膏，减压低温干燥至半固体状。平行分成3份，每份相当于田基黄药材1000克。
配制10wt％的PEG600水溶液500ml，加入等量的乙酸乙酯使分层。每份提取物(相当于田基黄药材1000克)加入上述液体分散，分离，重复一次，合并上层溶液，减压回收至近干。以少许去离子水搅拌，滤过，所得固体在自然状态下干燥至近干，80℃干燥，即得白前苷B样品。结果见表4，三批次白前苷B的纯度均在90％以上。
表4放大萃取分离实验
实验例4放大萃取分离实验(III)
取3000克田基黄药材，分批多次加水加热回流提取。提取两次，每次加水10倍量，提取0.5小时，滤过，合并所有滤液，浓缩至稠浸膏，减压低温干燥至半固体状。平行分成3份，每份相当于田基黄药材1000克。
配制20wt％的PEG600水溶液适量，加入等量的乙酸乙酯使分层。备用。
每份提取物(相当于田基黄药材1000克)用加入上述液体分散分离，重复一次，每次用量1升。合并上层溶液，减压回收至近干。以少许去离子水搅拌，滤过，所得固体在自然状态下干燥至近干，80℃干燥，即得白前苷B样品。结果见表5，三批次白前苷B的纯度均在90％以上。
表5放大萃取分离实验
实验例5白前苷B的结构确证
对实施例2、3、4得到的样品进一步采用柱层析纯后，测定其1HNMR与13CNMR，证实所得成分为白前苷B。采用HPLC法检测，色谱柱，MerckLichrospher100ARP-18e(5μm)；检测器，PDA-100；流动相为乙腈-pH2.5磷酸二氢盐缓冲液，0～100min乙睛为3-25％梯度洗脱；流速，1.0ml/min；检测波长300nm；进样量20μl。表明实施例2、3、4得到的样品纯度均在90％以上。
1HNMR与13CNMR数据及分析如下：
1HNMR(400MHz，DMSO-d6):δ12.48(s,1H,5-OH),9.60(s,1H,4′-OH),9.47(s,1H,3-OH),9.28(s,1H,3′-OH),7.73(1H,d,J＝2.2Hz,H-2'),7.60(dd,1H,J＝2.2,8.5Hz,H-6′),6.90(d,1H,J＝8.5Hz,H-5′),6.78(d,1H,J＝2.1Hz,H-8),6.42(d,1H,J＝2.1Hz,H-6),5.56(d,1H,J＝1.6Hz,H-1"),1.15(3H,d,J＝6.2Hz,Rha-Me)。
13CNMR(100MHz，DMSO-d6):δ17.7(q,C-6")，69.9(d,C-5")，70.0(d,C-2")，70.2(d,C-3")，71.6(d,C-4")，94.1(d,C-8)，98.4(d,C-6)，98.8(d,C-1")，104.6(S,C-10)，115.2(d,C-6')，115.5(d,C-5')，120.1(d,C-2')，121.8(s,C-1')，136.0(s,C-3)，145.0(s,C-3')，147.4(s,C-4')，147.8(s,C-2)，155.6(s,C-9)，160.4(s,C-7)，161.4(s,C-5)，175.8(s,C-4)。
显然，上述实施例中采用的有机酸的具体种类仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (8)
1.一种从田基黄中提取分离白前苷B的方法，其特征在于，步骤包括：
取田基黄药材，加入水加热提取，滤过，收集滤液，浓缩至相当于每体积份含田基黄药材生药量0.5-2重量份；
向其中加入生药量0.5-2倍聚乙二醇溶液，混匀，再加入生药量0.5-2倍乙酸乙酯萃取，振荡，静置至分层；取乙酸乙酯层，浓缩回收乙酸乙酯，得固体，适量水洗，干燥，得粉末状黄色提取物，即得，当重量份单位为g时，体积份单位为mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇为PEG600-4000，聚乙二醇浓度为10-20wt％。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇为PEG600，浓度15wt％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取次数为1-3次，优选2-3次。
5.根据权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，加水加热回流提取时加水量为5-15倍，提取0.3-1小时，提取2-3次。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，加水量为10倍，提取0.5小时，提取2次。
7.根据权利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，所述白前苷B的含量为>80％。
8.根据权利要求1-6之一所述的方法，其特征在于，所述白前苷B的含量为>90％。
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