CN105037221B - 一种具有神经保护作用的化合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种具有神经保护作用的化合物，化学命名为4,6‑二羟基‑5‑苯乙氧羰基‑1,3苯二磺酸，分子式为C₁₅H₁₄O₁₀S₂。所述的化合物具有显著的神经保护作用，对神经毒素损伤的PC12神经细胞系具有明显的修复作用，表明其可以用于神经系统疾病如帕金森病和老年性痴呆的治疗药物和保健品的制备。

Description

一种具有神经保护作用的化合物及其制备方法

技术领域

本发明提供一种具有神经保护作用的化合物,同时还提供了该化合物的制备方法及其医用用途，属于医药合成技术领域。

背景技术

帕金森病(PD)是一种慢性中枢神经系统退化性失调。它会损害患者的肢体功能，语言能力等，临床表现为休息性震颤、僵直、运动迟缓和姿势不稳定性与认知和情感障碍。它的病因目前仍不明确，但其主要病理特征为黑质致密部中多巴胺能神经元的损失和被称为路易体的胞浆内包含体的存在。

6-羟基多巴胺(6-OHDA)是一种广泛地用于在实验动物中诱导帕金森综合征的化学物质(Lane&Dunnett,2008)。6-OHDA经由多巴胺和去甲肾上腺素重吸收转运蛋白进入神经元。因此,6-OHDA通常与选择性去甲肾上腺素重吸收抑制剂(比如地昔帕明)一起使用以选择性地仅杀死多巴胺能神经元。在体外,多巴胺的氧化可导致6-OHDA的产生,所以6-OHDA被认为是内源性毒素(Jellingeretal.,1995)。确实的证据表明6-OHDA产生活性氧簇,并降低谷胱甘肽和过氧化物歧化酶的活性(Betarbetetal.,2002)。在脑内注射6-OHDA之后,纹状体神经元在24小时内开始变性,并且在2-3天后纹状体多巴胺耗尽。

盐酸他克林(“Cognex(益智胶囊)”),第一种FDA批准的用于阿尔茨海默病的药物,是一种乙酞胆碱酷酶抑制剂(卡特勒(Cut1er)和斯让麦克(Sramek),新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)328:808810,1993)。然而,这种药物已经示出在阿尔茨海默病患者中产生认知改善,并且最初具有主要的副作用,如肝脏毒性。第二种FDA批准的药物,多奈呱齐(“安理申”),也是一种乙酞胆碱酷酶抑制药,它比他克林更有效,在于在阿尔茨海默病患者中显示轻微的认知改善(巴尔纳(Barner)和格雷(Gray),药物治疗纪事(Ann.Pharmacotherapy)32:70-77,1998；罗杰斯(Rogers)和氟瑞德哈夫(Friedhoff),欧洲神经心理学(Eur.NeuroPsych.)8:67-75,1998),但不被认为是治愈。因此,清楚的是,对于用于阿尔茨海默病患者的更有效的治疗存在需要。

发明内容

本发明目的在于提供了一种具有神经保护作用的化合物，对神经毒素损伤的神经细胞系具有明显的修复作用。

本发明公开了一种具有神经保护作用的化合物的制备方法，可以用于工业化生产。

本发明进一步公开了所述化合物在神经保护作用方面的药物应用。

本发明提供的一种具有神经保护作用的化合物(简称为NNK0019)，具有如下结构式：

化学命名为4,6-二羟基-5-苯乙氧羰基-1,3苯二磺酸，分子式为C₁₅H₁₄O₁₀S₂，相对分子质量为418.473g/mol。

本发明所述的具有神经保护作用的化合物的制备方法，如下所述：

1)以2,6-二甲基苯甲酸和苯乙醇为原料以1：(1.0～1.5)比例混合,以二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中之任意一种为溶剂,在0℃回流温度条件下,搅拌6-12小时；反应完毕后,将全部反应液过滤；滤液浓缩后,通过硅胶柱层析、浓缩、结晶得到2,6-二甲基苯甲酸苯乙醇酯；

2)将所得的2,6-二甲基苯甲酸苯乙醇酯溶解于氯仿或二氯甲烷中,室温搅拌,分批加入1.2当量的AlCl3,室温搅拌,TLC检测,反应完全后,将反应液缓慢倾入水中,萃取分离得到有机层,将有机层浓缩至干,通过硅胶柱层析或直接浓缩、结晶得2-羟基-6-甲氧基苯甲酸苯乙醇酯；

3)将所得到的2-羟基-6-甲氧基苯甲酸苯乙醇酯溶解于二氯甲烷或氯仿中,室温搅拌,分批加入2～3当量的AlCl₃,室温搅拌,TLC检测,反应完全后,将反应液缓慢倾入水中,萃取分离得到有机层,将有机层浓缩至干,通过硅胶柱层析或直接浓缩、结晶得2,6-二羟基苯甲酸苯乙醇酯；

4)过量浓硫酸加入所得2,6-二羟基苯甲酸苯乙酸酯中，不断搅拌使其充分反应，反应完全后将反应液倾入大量水中，萃取分离得到有机层,将有机层浓缩至干,通过硅胶柱层析或直接浓缩、结晶得4,6-二羟基-5-苯乙氧羰基-1,3苯二磺酸。

本发明的积极效果在于：提供一种新的化合物，具有神经保护作用，对神经毒素损伤的神经细胞系具有明显的修复作用，可用于制备治疗该类疾病的药物。本发明化合物由取代的芳香酸和芳香醇混合制备，原料成本低，制备方法简单，神经保护作用明显，对预防和治疗帕金森病及老年痴呆病的效果也十分显著。

附图说明

图1为NNK0019对6-OHDA损伤的DPC12细胞的存活率的影响，细胞由NNK0019(10μM，20μM)预处理3h，而后加入100μM 6-OHDA处理24h。数据均以对照组的百分比呈现，相比对照组###p<0.001，相比模型组(100μM 6-OHDA)***p<0.001。

图2为NNK0019对6-OHDA损伤的DPC12细胞的修复作用，细胞由NNK0019(20μM)预处理3h，而后加入100μM 6-OHDA处理24h，control为空白组，model为模型组。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附后权利要求书限定的范围。

本发明指出一种具有所述化学式的化合物，具有明显神经保护作用，可在治疗或预防老年痴呆和帕金森药物或保健品中应用，所述化合物制备方法如下：

实施例1

称取100mg2,6-二甲氧基苯甲酸,将其置于干燥的圆底烧瓶中,加入10mL无水CH₂Cl₂搅拌；冰水浴使装置中的混合液温度降至0℃,加入150mg二环己基碳二酞亚胺,搅拌50分钟后加入0.06mL苯乙醇、3mg 4-N,N-二甲基-4-胺基吡啶,室温搅拌,TLC检测,反应完全后,直接过滤,母液浓缩后经硅胶柱层析(石油醚:氯仿-2:3)分离得到2,6-二甲基苯甲酸苯乙醇酯,收率89.9％。加入l0mLCH₂Cl₂,搅拌,分批加入3.3当量的AICl₃,室温搅拌,TLC检测,反应完全后,将反应液缓缓倾入20mL水中,萃取分离得到有机层,将有机层,浓缩,结晶得2,6-二羟基苯甲酸苯乙醇酯,收率87.5％，加入60ml浓硫酸，室温搅拌，反应充分后，反应液缓慢倾倒于1000mL水中，温度降到室温后，萃取分离得到有机层，浓缩，结晶得4,6-二羟基-5-苯乙氧羰基-1,3苯二磺酸，收率92.9％。

本发明化合物在神经保护作用中的医用用途如下：

试验例1

上述实例1中4,6-二羟基-5-苯乙氧羰基-1,3苯二磺酸(以下简称为NNK0019)样品对神经毒素6-OHDA损伤的已分化PC12细胞的保护作用：

本发明以细胞存活率为指标，通过MTT法检测的结果，反映NNK0019样品对抗神经毒素6-OHDA的毒性作用大小，以说明其神经保护作用。

取对数生长期的PC12细胞，用完全培养基稀释成3*105个/ml的细胞悬液，每孔100μl接种于96孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。移去培养基，加入100μl的NNK0019溶液(终浓度10μmol/ml，20μmol/ml，由基础培养基作为溶剂配制)，模型组和对照组分别加入100μl基础培养基，每组4个复孔。药物预处理3h后，在给药组与模型组分别加入6-OHDA(终浓度为100μmol/l)，培养24h，加入5mg/ml的MTT10μl，37℃培养箱中培养4h。弃去上清后每孔加入DMSO 150μl，震荡均匀，于540nm波长处测定各孔吸光度值来反映PC12细胞的存活率。

上述MTT测定结果显示(图1)，在只加入6-OHDA时，细胞存活率较对照组明显下降，说明6-OHDA对PC12细胞具有明显的损伤作用；NNK0019与6-OHDA共孵育时，可以明显抑制细胞存活率的下降，并随浓度的增加而增强，说明NNK0019具有显著的神经保护作用。

6-OHDA损伤PC12细胞模型是研究帕金森病常用的神经细胞模型，结合以上化学分析，可见，NNK0019具有神经保护作用，并有一定的浓度依赖性。

试验例2

上述实施例1NNK0019样品对神经毒素6-OHDA造成的PC12细胞线粒体的功能异常的修复作用

分子探针JC-1可以用来测定线粒体膜电位。JC-1是一种亲脂性的阳离子染料，能选择性地进入线粒体。当膜电位升高时能从绿色到红色可逆性地改变(Cossarizza etal.1993)。健康细胞中线粒体膜电位较高，JC-1能自发形成被称为J-aggregates具有强烈的红色荧光的络合物。另一方面，凋亡或不健康的细胞具有较低的线粒体膜电位，JC-1仍然处于单分子构造，它仅能显示出了绿色荧光(Cossarizza et al.1993)。

取对数生长期的PC12细胞，用完全培养基稀释成3*105个/ml的细胞悬液，每孔1ml接种于6孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。移去培养基，加入1ml的XX(20μmol/ml)，模型组和对照组分别加入1ml基础培养基。药物预处理3h后，在给药组与模型组分别加入6-OHDA(终浓度为100μmol/l)，培养12h。用2μM的JC-1在37℃下处理10分钟((Sigma-Aldrich,USA)。洗涤三次后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次后，使用荧光显微镜(Carl Ziess)观察线粒体中的荧光颜色变化。

上述线粒体膜电位变化实验结果(图2)显示，只加入6-OHDA的模型组的绿色荧光量与红色荧光比例与对照组相比明显升高，说明6-OHDA导致了PC12细胞线粒体的损伤，致其功能异常。而在6-OHDA与NNK0019同时作用时，绿红荧光比显著降低，说明XX具有修复6-OHDA对PC12细胞线粒体损伤的功能，可知XX对有可能是通过在凋亡过程阻止其进一步发展，从而对神经细胞起到保护作用。

Claims (3)

1.一种具有神经保护作用的化合物，具有如下结构式：

化学命名为4,6-二羟基-5-苯乙氧羰基-1,3苯二磺酸，分子式为C₁₅H₁₄O₁₀S₂，相对分子质量为418.473g/mol。

2.权利要求1所述的具有神经保护作用的化合物的制备方法，包括以下步骤：

称取100mg2，6-二甲氧基苯甲酸,将其置于干燥的圆底烧瓶中，加入10mL无水CH₂Cl₂搅拌；冰水浴使装置中的混合液温度降至0℃，加入150mg二环己基碳二酞亚胺，搅拌50分钟后加入0.06mL苯乙醇、3mg 4-N，N-二甲基-4-胺基吡啶，室温搅拌，TLC检测，反应完全后，直接过滤，母液浓缩后经硅胶柱层析，流动相为石油醚:氯仿-2:3，分离得到2，6-二甲基苯甲酸苯乙醇酯，收率89.9％；加入l0mLCH₂Cl₂，搅拌，分批加入3.3当量的AlCl₃，室温搅拌，TLC检测，反应完全后，将反应液缓缓倾入20mL水中，萃取分离得到有机层，将有机层，浓缩，结晶得2，6-二羟基苯甲酸苯乙醇酯，收率87.5％，加入60ml浓硫酸，室温搅拌，反应充分后，反应液缓慢倾倒于1000mL水中，温度降到室温后，萃取分离得到有机层，浓缩，结晶得4，6-二羟基-5-苯乙氧羰基-1，3苯二磺酸，收率92.9％；化学命名为4，6-二羟基-5-苯乙氧羰基-1，3苯二磺酸，分子式为C₁₅H₁₄O₁₀S₂，相对分子质量为418.473g/mol。

3.权利要求1所述的具有神经保护作用的化合物在制备治疗或预防帕金森病和老年痴呆药物或保健品中的用途。