CN105025909B

CN105025909B - 应激减轻剂

Info

Publication number: CN105025909B
Application number: CN201480010243.1A
Authority: CN
Inventors: 指原纪宏; 长田昌士; 森毅
Original assignee: Meiji Co Ltd
Current assignee: Meiji Co Ltd
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2014-02-26
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2034-02-26
Also published as: HK1215854A1; SG11201506640TA; JP6329125B2; JPWO2014132982A1; WO2014132982A1; CN105025909A

Abstract

通过摄取以格氏乳杆菌、或格氏乳杆菌及αLA为有效成分的组合物，带来免疫应答的增强及身体疲劳的降低。

Description

应激减轻剂

技术领域

本发明涉及以格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)为有效成分的应激减轻剂。另外，本发明涉及进一步包含α-乳白蛋白(αLA)作为有效成分的应激减轻剂。

背景技术

近年来，因没有对长期的轻度应激负荷或短期性应激进行充分的消除而导致的慢性(蓄积)应激成为问题。这些慢性应激即使是低强度也通过蓄积而以高强度对身心造成比短期性应激更大的影响，视慢性应激为原因的过劳死等成为社会问题。

应激被定义为对损害生物体的体内稳态的刺激的生物学反应。应激的原因被称为应激原，根据该外部刺激的种类分成物理性应激原(寒冷、噪音、放射线等)、化学性应激原(氧、药物等)、生物性应激原(炎症、感染)、心理性应激原(愤怒、不安等)。

为了应对应激原从脑向身体传达指令的系统主要存在2种。一种是下丘脑-交感神经-肾上腺髓质系统(sympathetic-adrenal-medullary axis，SAM轴)，作为应对应激的紧急反应而已知。另一种是下丘脑-脑垂体-肾上腺皮质系统(Hypothalmo-Pituitary-Adrenal axis，HPA轴)，作为应对来自外界的所有要求的非特异性应激反应而已知。

作为非特异性应激反应的HPA轴首先从下丘脑分泌促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotoropin-releasing hormone，CRH)。CRH从脑垂体分泌促肾上腺皮质激素(Adrenocortico tropic hormone，ACTH)。ACTH促进从肾上腺皮质分泌皮质醇等糖皮质激素(在大鼠中主要为皮质酮)。该糖皮质激素通常被称为应激激素。

糖皮质激素的作用很多是参与应对应激的身体反应(能量代谢的活化、心脏功能的促进)，对体内稳态的维持发挥重要的作用。但是，其另一方面，还已知糖皮质激素会使免疫细胞的增殖能力、功能降低等而对生物体产生不良影响。例如，因慢性化应激而产生的糖皮质激素的持续分泌成为感染防御能力降低(免疫功能降低)、郁闷或不安等情绪障碍、失眠等睡眠障碍等2次症状的主要原因。

近年来，“脑肠轴”受到注目。脑肠轴是指在肠内产生的各种信号经由神经系统、激素或细胞因子等共同的信息传递物质或受体被传递至中枢神经系统，并对其信息处理过程产生影响(非专利文献1)。即，认为在由肠内细菌或益生菌等产生的来自肠的刺激下，应激敏感性减弱、应激应答减轻。

肠通过植物神经受脑支配，若脑识别到应激则该信息通过植物神经或内分泌激素或细胞因子等信息传递物质被传递给肠，引起蠕动运动的异常等。另一方面，若在肠中引起便秘或腹泻等症状，则其作为应激被传递给脑。该脑与肠的双向信息传递机制被称为“脑肠轴”(非专利文献1)。近年来，在该脑肠轴中，肠内细菌对从肠对脑的信号传递产生影响逐步被人知晓。因此，认为通过由乳酸菌等益生菌产生的来自肠的刺激，可减弱应激敏感性、减轻应激应答。

例如，非专利文献2公开了当向大鼠给予约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)La1时，支配胃和消化道功能的副交感神经的活动增强。另外，专利文献1公开了类干酪乳杆菌类干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)乳酸菌FERM-19169会抑制TNF-α、IFN-γ、IL-6等细胞因子的过量产生，有效地防御病原感染，同时抑制过度的炎症反应，将因疾病等导致的损耗抑制到最小限度，由此来抑制应激。此外，专利文献2还公开了通过以瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)ATCC8205为代表的乳杆菌属的乳酸菌使牲畜乳发酵而得到的酸奶具有预防和减轻因应激而产生的精神/身体症状的效果。

然而，非专利文献2是以胃肠疾病或炎症反应等的急性应激为对象的搭配，关于专利文献1，虽然研究了精神/身体症状，但是只不过仅进行了对一时的应激的效果确认，对于现代社会中成为问题的慢性应激是否足够有效并不清楚。

发明者们迄今为止发现：作为益生菌乳酸菌的格氏乳杆菌OLL2809具有强的从小鼠脾细胞诱导IL-12等、刺激生物体的免疫应答的作用。清楚了该乳酸菌作用于宿主的免疫应答机制对于即发型过敏疾病(专利文献3)、迟发型过敏反应(专利文献4)、子宫内膜异位的减轻(专利文献5)也是有效的。IL-12在诱导I型的辅助T细胞(Th1)的同时还具有增强NK细胞的细胞杀伤活性的作用(专利文献3)。NK细胞是在对病毒感染的防御和肿瘤细胞的排除等自然免疫机制中发挥重要作用的细胞。

另外，发明者们迄今为止也清楚了αLA具有抑制环氧化酶-2的活性、抑制由花生四烯酸生成前列腺素进而还抑制IL-6的产生的作用。清楚了由于这样的作用，αLA减轻炎症引起的月经时的疼痛、有助于处于生育年龄的健康女性的QOL提高(专利文献6)。前列腺素是炎性介质之一，引起疼痛等各种炎症的症状。

但是，关于上述的格氏乳杆菌OLL2809、αLA对由应激的慢性化(慢性应激)引起的在糖皮质激素的影响下发生的免疫功能的降低、不安-疲劳之类的心理应激等的效果、在遭受慢性应激的状况下的效果完全没有记载。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2010-96751号公报

专利文献2：日本特开平10-045610号公报

专利文献3：国际公开公报WO2006/093022号小册子

专利文献4：国际公开公报WO2012/086150号小册子

专利文献5：国际公开公报WO2012/073924号小册子

专利文献6：国际公开公报WO2008/140041号小册子

非专利文献

非专利文献1：Aziz Q,Thompson DG.,Gastroenterol,114:559-578(1998).

非专利文献2：Tanida M,Yamano T,Maeda K,Okumura N,Fukushima Y,Nagai K.,Neurosci Lett,389:109-114(2005).

发明内容

发明所要解决的问题

这样，关于迄今为止已知的应激抑制剂会改善免疫系统的刺激、胃肠疾病是已知的，但是对于应激、特别是对于伴随着慢性应激的各种症状发挥怎样的作用是完全未知的。因此，本发明的目的是提供通过抑制因慢性应激引起的HPA轴的过度应答、免疫功能的降低，进而减轻以疲劳感或不安-紧张为代表的心理应激，调整身心以及身体状况的作为药物没有副作用、可经常使用且可作为饮食品等简便地摄取的应激减轻剂。

用于解决问题的方法

本发明发现对于格氏乳杆菌而言以往未知的可抑制由慢性应激引起的HPA轴的过度应答、免疫功能的降低、同时减轻不安-紧张之类的心理应激的作用，发现作为应激减轻剂是有用的。此外发现，通过进一步在格氏乳杆菌中并用αLA，可减轻作为慢性应激症状之一而感觉到的每天的疲劳感，发现作为应激减轻剂是有用的。

以下，列举出本发明的各基本特征及各种方式。

〔1〕一种应激减轻剂，其包含格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)作为有效成分。

〔2〕根据〔1〕所述的应激减轻剂，其中，应激为慢性应激。

〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的应激减轻剂，其进一步包含α-乳白蛋白(αLA)作为有效成分。

〔4〕一种格氏乳杆菌，其具有应激减轻作用。

〔5〕根据〔4〕所述的格氏乳杆菌，其具有抑制血中应激激素上升的作用。

〔6〕根据〔4〕或〔5〕所述的格氏乳杆菌，其具有抑制血中肾上腺皮质激素和/或血中糖皮质激素上升的作用。

〔7〕一种组合物，其含有1×10⁷个以上的格氏乳杆菌及40重量％以上的αLA。

〔8〕根据〔1〕～〔3〕中任一项所述的应激减轻剂，其中，格氏乳杆菌为以保藏号NITEBP-72保藏的格氏乳杆菌OLL2809菌株。

〔9〕根据〔4〕～〔6〕中任一项所述的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，其以保藏号NITE BP-72保藏。

〔10〕根据〔7〕所述的组合物，其中，格氏乳杆菌为以保藏号NITE BP-72保藏的格氏乳杆菌OLL2809菌株(Lactobacillus gasseri OLL2809)。

〔11〕一种应激减轻方法，其使用格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)。

〔12〕根据〔11〕所述的方法，其中，应激为慢性应激。

〔13〕根据〔11〕或〔12〕所述的方法，其进一步使用αLA。

〔14〕根据〔11〕～〔13〕中任一项所述的方法，其中，格氏乳杆菌为以保藏号NITEBP-72保藏的格氏乳杆菌OLL2809菌株(Lactobacillus gasseri OLL2809)。

发明效果

迄今为止，本发明者们对格氏乳杆菌或αLA带来的效果反复进行了研究。其结果是，本发明者们以给予了格氏乳杆菌OLL2809的大鼠进行了浸水应激负荷试验，结果发现，通过格氏乳杆菌OLL2809的给予，血中皮质酮等应激激素的增加变得缓慢，可抑制因应激负荷而导致的NK活性的降低。另外，通过以日常进行剧烈运动的运动竞技者为受试者的试验，发现了格氏乳杆菌OLL2809可抑制因剧烈运动而导致的NK活性降低，减轻不安和紧张之类的心理应激。

此外，本发明人通过以日常进行剧烈运动的运动竞技者为受试者的试验，发现了通过OLL2809及αLA的并用摄取可缓和每天的疲劳感。该效果通过血清活性氧代谢产物的衍生物(derivatives of reactive oxygen metabolites，dROMs)及转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1水平的显著降低得到客观性验证。清楚了上述效果对于例如运动竞技者为了发挥优异的竞技能力而调整身体状况是有用的。

附图说明

图1是表示大鼠浸水应激负荷试验后的血中的应激激素(ACTH、皮质酮)浓度的图。结果以平均值+标准偏差表示。白色、灰色及黑色的柱分别表示通常组、应激组及格氏乳杆菌OLL2809组。评价在试验第14天进行。a、b表示不同符号间具有显著性差异(单因素方差分析、Fisher's PLSD检验、P<0.05)。

图2是表示大鼠浸水应激负荷试验后的血中的氧化应激标记物(8-OHdG)浓度的图。结果以平均值+标准偏差表示。白色、灰色及黑色的柱分别表示通常组、应激组及格氏乳杆菌OLL2809组。评价在试验第14天进行。a、b表示不同符号间具有显著性差异(单因素方差分析(One-way ANOVA)、Fisher's PLSD检验、P<0.05)。

图3是表示大鼠浸水应激负荷试验后的脾脏NK活性的图。结果以平均值+标准偏差表示。白色、灰色及黑色的柱分别表示通常组、应激组及格氏乳杆菌OLL2809组。评价在试验第14天进行。a、b表示不同符号间具有显著性差异(单因素方差分析、Fisher's PLSD检验、P<0.05)。

图4是表示用于评价心情或感情的状态的心境状态量表(Profiles of MoodStates，POMS)中的格氏乳杆菌OLL2809及αLA的效果的图。图内的黑点表示各受试者的结果，图内的柱表示平均值。评价在受试物质摄取前和4周的摄取后实施。#、*：P<0.1、0.05。在受试物质摄取前和4周的摄取后进行比较时具有显著性差异(重复测定双因素方差分析(Two-way rm ANOVA)、Student’s配对t检验(Bonferroni校正))。

图5是表示格氏乳杆菌OLL2809及αLA对使用了视觉模拟评分(Visual analoguescale，VAS)法的运动负荷前后的疲劳感的效果的图。结果以平均值±标准偏差表示。白色、灰色及黑色的柱分别表示安慰剂、仅OLL2809及OLL2809+αLA。评价在受试物质摄取前的运动前后及4周的摄取后的运动前后进行(Student’s配对t检验)。

图6是表示格氏乳杆菌OLL2809及αLA对1小时的自行车测力计运动引起的NK细胞杀伤活性降低的效果的图。结果以平均值±标准偏差表示。白色及黑色的柱分别表示运动前和后。*：P<0.05、在运动前后进行比较时具有显著性差异(双因素重复测量方差分析、Student’s配对t检验(Bonferroni校正))。n.s.：没有显著性差异。

具体实施方式

本发明中，应激是指由应激原、例如物理性应激原(寒冷、噪音、放射线等)、化学性应激原(氧、药物等)、生物性应激原(炎症、感染)、心理性应激原(愤怒、不安等)等引起的生物学紧张状态的现象。

本发明的应激减轻剂可以用于缓和应激。本发明的应激减轻剂作为药物没有副作用、可经常使用并且也可作为饮食品等简便地摄取。

本发明的应激减轻剂可以抑制例如应激导致的免疫功能等降低。特别是本发明的应激减轻剂对于因上述应激原引起的急性应激及慢性应激具有减轻作用，但在应激持续的慢性应激的情况下可以优选使用。当本发明的应激减轻剂用于慢性应激时，能够抑制例如对慢性应激进行应答而持续分泌的皮质醇、皮质酮、可的松等糖皮质激素等引起的NK活性的降低，进而心理性疲劳感也得到减轻。

本发明的应激减轻剂可以改善或预防慢性应激时的二次症状即例如免疫功能的降低、心理应激的增大、创伤治愈的延迟或代谢障碍等。

本发明的应激减轻剂可以缓和因应激而引起的身体状况不良。本发明的应激减轻剂可以减轻例如不安、紧张、疲劳感之类的精神应激(心理性应激)、日常的疲劳感(慢性疲劳)或慢性疲劳症候群。此外，本发明的应激减轻剂是抑制因剧烈运动等应激刺激而引起的应激激素的增加、减轻氧化应激标记物的增加或抑制因应激负荷而导致的免疫功能的降低，从而调整身体状况的制剂。因而，本发明的应激减轻剂也可以以生物体体内稳态的维持(体内平衡)、健身训练或身体状况调整为目的而使用。作为一个例子，本发明的应激减轻剂可以用作为了运动竞技者发挥优异的竞技能力、或预防和减轻过度训练而带来免疫应答的增强及身体疲劳的降低的运动训练剂。

本发明的应激减轻剂以格氏乳杆菌、或格氏乳杆菌及αLA为有效成分。本发明的应激减轻剂含有格氏乳杆菌作为乳酸菌。只要具有应激减轻效果及慢性疲劳的减轻效果，则只要是格氏乳杆菌可以使用任意的格氏乳杆菌。

本发明中，可以特别优选使用的格氏乳杆菌是本发明者们从人成人粪便中独自分离的格氏乳杆菌OLL2809。该菌株在2005年2月1日(原保藏日)在独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(日本国〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)以NITE P-72进行保藏，然后在2006年1月18日由原保藏转移至基于布达佩斯条约的保藏，以保藏号NITE BP-72保藏。

作为用于培养作为本发明的应激减轻剂的有效成分的格氏乳杆菌的培养基，使用在乳酸菌的培养基中通常使用的培养基。即，只要是除了主碳源之外还适当地含有氮源、无机物、其他营养素的培养基，则可以使用任意培养基。作为碳源，可根据所用菌的同化性使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉水解物、糖蜜等。作为氮源，可以使用酪蛋白的水解物、乳清蛋白水解物、大豆蛋白水解物等有机含氮物。另外，作为增殖促进剂，使用肉膏、鱼肉膏、酵母膏等。

作为本发明的应激减轻剂的有效成分的格氏乳杆菌的培养优选在厌氧条件下进行，但也可以在利用通常使用的液体静置培养等的微需氧条件下。厌氧培养可以适用在氮气层下进行培养的方法等公知手法，但也可以是其他方法。培养温度通常优选为30～40℃，但只要是格氏乳杆菌能够生长的温度则可以是其他的温度条件。培养中的培养基的pH优选维持在4.0～7.0，但只要是格氏乳杆菌能够生长的pH，则也可以是其他的pH条件。另外，还可以在分批培养条件下进行培养。培养时间通常优选为10～24小时，但只要是格氏乳杆菌能够生长的时间，则也可以是其他的培养时间。

作为本发明的应激减轻剂的有效成分的格氏乳杆菌可以是活菌体，也可以是死菌体，也可以是湿润菌或干燥菌。另外，本说明书中的“格氏乳杆菌”是指格氏乳杆菌的菌株和菌体中的任一者。

作为本发明的应激减轻剂的有效成分的格氏乳杆菌也可以是“处理物”形式。本发明中，作为格氏乳杆菌的“处理物”，没有限定，但可列举出例如培养结束后的格氏乳杆菌悬浮物(悬浮液)、用培养液直接制成的培养物(包含菌体、培养上清液及培养基成分)、发酵物(使鲜奶、脱脂奶粉或豆浆等发酵而得到的物质)、加热处理物、通过加热、放射线等进行了杀菌或灭菌的杀菌处理物或灭菌处理物、利用超声波等得到的破碎物、浓缩物、糊化物、干燥物(喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、滚筒干燥物等)、液态物、稀释物等。作为本发明的应激减轻剂的有效成分的格氏乳杆菌的菌体浓度没有特别限定，但优选以浓缩液计为1×10⁶个/g以上，以干燥物计为1×10⁷个/g以上。

本发明的应激减轻剂中除了格氏乳杆菌以外，还以αLA为有效成分。本发明的αLA不特别关心来源，但优选为人和/或非人哺乳动物(牛、绵羊、山羊、马等)来源，更优选为人或牛的αLA。这些αLA的氨基酸序列或碱基序列已经是公知的，登记于EMBL、DDBJ、NCBI等数据库中。例如牛αLA在DDBJ中以ACCESSION No.J05147登记。

αLA可以由人、牛、绵羊、山羊等哺乳类的乳等通过硫酸铵沉淀法(「最新改稿乳業技術便覧」酪农技术普及学会、122-125页、1975)、超滤法(日本特开平5-268879号公报)、离子交换法(日本专利第2916047号公报)等公知技术进行制造。牛奶中的αLA的含量根据产地、饲料等的不同有一些差异，但在日本国产牛奶中通常为1.2g/kg，若使用牛奶作为制造原料，则可以制备大量的αLA。另外，也可以基于氨基酸序列及碱基序列进行化学合成，或者通过本领域技术人员已知的基因工程学的手法进行制造。更简便地，可以使用市售的αLA(例如Davisco公司制等)。

本发明的应激减轻剂可以是人或动物用的药品、食品，或者，也可以是被配合到该药品或食品中使用的原材料或制剂。其中，该食品中包含以慢性应激的缓和、从身体疲劳感/心理疲劳感的恢复或生物体体内稳态的维持(体内平衡)、健身训练或身体状况调整为概念并根据需要表示其主旨的功能性食品、病人用食品、特定保健用食品。

作为将本发明的应激减轻剂制成药品时的给予形态，可以根据其目的、给予途径等来选择剂型，可列举出例如片剂、包衣片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、注射剂、栓剂、浸剂、煎剂、酊剂等，但优选制成经口用剂或利用经管营养法的营养剂等种类的非经口剂使用。

这些各种制剂可根据常规方法针对主药、根据需要使用填充剂、增量剂、赋形剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、矫味除臭剂、增溶剂、悬浮剂、包衣剂等药物的制剂技术领域中可通常使用的已知辅助剂进行制剂化。另外，在该药物制剂中还可以含有着色剂、防腐剂、香料、风味剂、甜味剂等或其他的药品。

本发明的应激减轻剂通过单独使用、或与药品或食品中通常可以使用的其他成分混合后经口给予、或与其他具有免疫应答增强效果及身体疲劳的降低效果的化合物或微生物等并用，对于人及动物的免疫应答增强及身体疲劳的降低是有效的。可列举出例如与抗不安药(例如利眠宁、奥沙唑仑或地西泮等)、催眠药(例如硝西泮、艾司唑仑或卤沙唑仑等)或维生素剂(例如维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、泛酸、维生素B12、维生素E、生物素或维生素C等)等组合进行给予等。

本发明所述的应激减轻剂由于没有副作用，即使经常使用也没有问题，所以不仅可以作为药物使用，也可以作为饮食品使用。具体而言，作为饮食品，可以是牛奶、清凉饮料、乳饮料、发酵乳、酸奶、奶酪、冰淇淋、面包、饼干、脆饼、糖果(点心)、压片糖果、比萨饼、调制奶粉、流质食物、营养增补剂、美容食品、健康食品、病人用食品、幼儿用奶粉等食品、哺乳妇女用奶粉等食品、营养食品、运动用食品等任意的形态，关于其性状，以通常使用的饮食品的状态、例如固体状(粉末、颗粒状等)、糊状、凝胶状、果冻状、液状或悬浮状的任意状态均可以提供本发明所述的应激减轻剂。

所述食品可以直接使用本发明的格氏乳杆菌、αLA，或者可以与其他的食品或食品成分混合等按照通常的饮食品组合物的常规方法来制造。

作为其他的食品成分，没有特别限定，可列举出例如水、蛋白、糖质、脂质、维生素类、矿物质类、有机酸、有机碱、果汁、调味剂类等。

其中，作为蛋白，可列举出例如全脂奶粉、脱脂奶粉、部分脱脂奶粉、酪蛋白、乳清粉、乳清蛋白、乳清蛋白浓缩物、乳清蛋白分离物、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白、大豆蛋白、鸡蛋蛋白、肉蛋白等动植物性蛋白、它们的水解物等。

作为糖质，可列举出糖类、加工淀粉(除了糊精以外，有可溶性淀粉、英国淀粉(british starch)、氧化淀粉、淀粉酯、淀粉醚等)、食物纤维等。

作为脂质，可列举出例如猪油、鱼油等、它们的分离油、氢化油、酯交换油等动物性油脂、棕榈油、红花油、玉米油、菜籽油、椰子油、它们的分离油、氢化油、酯交换油等植物性油脂等。

作为维生素类，可列举出例如维生素A、胡萝卜素类、维生素B族、维生素C、维生素D族、维生素E、维生素K族、维生素P、维生素Q、烟酸、尼克酸、泛酸、生物素、肌醇、胆碱、叶酸等。

作为矿物质类，可列举出例如钙、钾、镁、钠、铜、铁、锰、锌、硒、乳清矿物质等。

作为有机酸，可列举出例如苹果酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸等。

这些成分可以将2种以上组合使用，也可以使用合成品和/或大量含有上述物质的食品。

本发明的应激减轻剂的摄取量由于根据摄取的人的性别、年龄、健康状态等的不同而不同，所以不能一概而论，但在经口剂的情况下，可列举出例如以作为有效成分的格氏乳杆菌OLL2809的菌体计，每1天1×10⁷个以上、优选1×10⁸个以上、更优选1×10⁹个以上、特别优选1×10¹⁰个以上、进一步优选1×10¹¹个以上。另外，作为有效成分的αLA，可列举出每1天100mg以上、优选250mg以上、更优选500mg以上、特别优选1000mg以上。关于这些应激减轻剂的摄取量的上限值，由于作为其有效成分的格氏乳杆菌、αLA作为通常的食材存在，所以没有特别的上限值，若硬要列举的话，则可列举出例如以格氏乳杆菌OLL2809的菌体计，每1天1×10¹⁵个，可列举出以αLA计，每1天2000mg/kg。另外，摄取次数可以为1天1次，或也可以为多次。另外，本说明书中，“摄取”这一用语也包含在“给予”中。

本发明的应激减轻剂可以一次或分次对需要利用本发明的组合物的处置的患者在饭前、饭后、饭间和/或睡前进行给予。给予量也可以分别根据给予的患者的年龄、体重及给予目的来决定。

另外，还提供调整身体状况的方法、减轻或缓和慢性应激的方法、以及抑制因慢性应激引起的血中应激激素上升的方法、缓和或减轻因慢性应激引起的心理应激的方法，其特征在于，对哺乳动物给予或使其摄食、或饮食本发明的格氏乳杆菌、或格氏乳杆菌及αLA的有效量。

上述格氏乳杆菌、或格氏乳杆菌及αLA的有效量是指与上述应激减轻剂的格氏乳杆菌、或格氏乳杆菌及αLA的摄取量相同的量。

作为本发明的方法可适用的应激，包含一切因生理学上对动物有害的应激原所引起的生物学紧张状态的现象。本发明的应激减轻剂特别是对介由HPA轴的应激反应是有用的。

另外，作为因应激而引起的症状，除了感染防御能力的降低、创伤治愈的延迟、免疫功能的降低、代谢障碍以外，可列举出循环器官系统障碍(例如苦闷、心悸、心律失常等)、消化器官系统障碍(例如食欲不振、胃痛、恶心、胃溃疡、便秘、腹泻)、肩膀酸痛、头痛、眩晕、彷徨不安、眼疲劳、全身倦怠感、疲劳感、紧张或不安等心理应激、抑郁病等。本发明的应激减轻剂特别是对免疫功能的降低、感染防御能力的降低、全身倦怠感、疲劳感、紧张或不安等心理应激是有用的。

本发明的缓和或减轻方法由于缓解上述应激，抑制糖皮质激素的上升，抑制伴随应激而产生的免疫功能的降低，缓和不安或紧张之类的心理应激、疲劳感，所以可以维持生物体内的体内稳态，调整每天的身体状况。

另外，本说明书中引用的全部现有技术文献作为参照纳入本说明书中。

实施例

以下，基于实施例对本发明进一步进行具体说明，但本发明并不限定于以下的实施例。

[实施例1]

格氏乳杆菌OLL2809的应激减轻及免疫抑制改善效果的研究

[实验方法]

将6周龄的雄性Sprague Dawlye大鼠(SPF)单个饲养驯化后，分成不给予应激负荷的“通常组”、给予应激负荷的“应激组”、给予格氏乳杆菌OLL2809并给予应激负荷的“OLL2809组”这3组(第1天)。全部组均在驯化期间同样地进行通常饲养后，从第9天起对应激组及OLL2809组在从底面至1.5cm的高度装满水的笼子中饲养5天(第9天～第13天)。从第1天至第14天为止，对OLL2809组使用胃管强制胃内给予40mg/kg体重/day的OLL2809株。对通常组及应激组仅同样地给予溶剂的水。第14天将大鼠解剖，实施脾细胞的NK活性和血中应激激素的测定。

脾细胞的NK活性采用以YAC-1细胞为靶细胞、并使用流式细胞计的方法。将1×10⁶个细胞的大鼠脾脏效应细胞和2.5×10⁴个细胞的Dio(3,3'-双十八烷基氧杂碳菁高氯酸盐(Dio；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))标记YAC-1标的细胞在96孔圆底板中混合，在37℃的CO₂培养箱中培养4小时。在培养结束的15分钟前添加20μL的0.5mg/mL的碘化丙啶(Sigma-Aldrich)将死细胞染色。YAC-1标的细胞的死亡使用FACSCalibur流式细胞计及CellQuest软件(BD Biosciences，Flanklin Lakes，NJ)进行分析，将其死亡率作为NK活性。

血中的应激激素测定ACTH(促肾上腺皮质激素)、皮质酮、8-OHdG这3个项目。它们使用试剂盒进行测定。ACTH；ACTH(Rat)EIA KIT(Phoenix Pharmaceuticals，Burlingame，CA)、Corticosterone；Corticosterone EIA Kit(Enzo Life Science，Farmingdale，NY)、8-OHdG；高感度8-OHdG Check，(Nikken Seil，静冈)。

[实验结果]

测定作为HPA轴的应激应答传递物质的ACTH、皮质酮，结果与通常组相比在应激组中可见显著的增加(图1)。另一方面，在OLL2809组中由于应激负荷这些值与通常组相比也增加，但并不显著。另外，作为氧化应激标记物的8-OhdG也显示同样的推移(图2)。

测定脾脏的NK活性，结果与通常组相比在应激组中可见显著的降低(图3)。另一方面，与应激组相比在OLL2809组中NK活性显著增强，恢复至与通常组相同的水平。该变动为与皮质酮相反的变动。由该结果表明，OLL2809株的摄取具有较高地维持因应激而降低的NK活性的作用。

因此，由本结果表明，OLL2809株的给予会减轻介由HPA轴的应激应答。

[实施例2]

格氏乳杆菌OLL2809及αLA的运动选手的状态改善效果的研究

(1)受试者

以满足以下基准的健康大学生作为受试者(n＝44)，在临床试验中进行登记：(i)征得同意时的年龄为30岁以下的健康日本人男性、(ii)日常(每周5日以上)进行需要持久力的运动。

此外，以不违反以下的除外基准者作为受试者。除外(中止/脱离)基准：(i)以自由意志拒绝试验继续的受试者；(ii)在试验期间花粉症等过敏疾病发病者；(iii)因某种疾病的发病而变得难以继续试验者；(iv)判明不遵从试验责任医师、实施运营责任者的指示而不具有依从性者；(v)受试物摄取期间的未摄取次数达到预定次数的10％者。

在本案的实施时，从经负责临床试验的医师说明试验内容后的受试者组全员征得书面同意。另外，受试者不满20岁时，取得本人和其监护人的同意。本试验遵守赫尔辛基宣言而实施，第一考虑受试者的安全性而实施。本试验取得株式会社明治研究本部的伦理审查委员会的认可而实施。

(2)试验方法

进行随机安慰剂对照双盲法(三组间的并行比较试验)。在1周的前观察期间之后，分配成安慰剂组和仅摄取格氏乳杆菌OLL2809的组(以下称为OLL2809组)及除了格氏乳杆菌OLL2809以外还摄取αLA的组(以下称为OLL2809+αLA组)这3组。使各受试者摄取4周含有安慰剂或受试物的片剂。在受试物的摄取前后进行检查，如下述那样进行运动负荷、问卷调查、血液检查。另外，运动后的血液检查在1小时的运动结束后、约1小时后实施。

[运动负荷]

使用电磁刹车式自行车测力计，让受试者在运动整个过程中维持预测最大心率储备的70％的强度(70％HRreserve)进行1小时的自行车测力计运动。另外，70％Hrreserve通过以下的Karvonen的公式算出：

70％HRreserve＝[(220－年龄)－安静时心率数]×0.7+安静时心率数。

心率数在运动试验整个过程中每隔5分钟进行监测。

[评价项目]

[i]POMS

在前观察期间及摄取4周后的运动前实施共2次的POMS提问纸的记录。将各得分合计，对以下的6个下位尺度进行计分：T-A(紧张-不安)、D(抑郁-沮丧)、A-H(愤怒-敌意)、V(活力)、F(疲劳)及C(混乱)。按照POMS手册，为了进行参数统计分析，将这些合计原始得分转换成T得分(Yokoyama K，Araki S.POMS Japanese manual.Kaneko Syobo，Tokyo，1994(In Japanese).)。

[ii]疲劳的VAS

为了测定受试者的疲劳，使用疲劳的VAS。在摄取开始前的运动负荷的前后及摄取4周后的运动负荷的前后进行共4次的评价。VAS是使右侧为“完全没有疲劳感”、左侧为“迄今为止经历的最强的疲劳感”，在100mm的直线上评价其程度。让受试者在该直线上最能表达现在自己的状态的自己本人的认识的位置处作上记号。接着，通过测定从该直线的左端至记号为止的距离(mm)，确定VAS疲劳得分。

[iii]NK活性

在摄取前后的2次的观察期间分别进行运动负荷前后的2次、共4次的采血，通过BML公司测定NK活性。

[iv]血液/血液生化检查

在摄取前及摄取4周后的运动前进行血液检查(红细胞数、白细胞数、血小板数、血红蛋白)及血液生化检查(血糖值、总蛋白、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬酰胺转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素、γ-转肽酶、碱性磷酸酶(ALP)、血液尿素氮(BUN)、肌酸酐、尿酸、总胆固醇、三甘油酯、高密度脂蛋白(HDL))。它们主要作为安全性指标进行评价。

另外，TGF-β1、dROMs在摄取前后的2次的观察期间分别进行运动负荷前后的2次、共4次采血来进行评价。

(3)受试物的制造

受试物由株式会社明治制造。

格氏乳杆菌OLL2809冷冻干燥粉末是在以乳清和乳糖为主要成分的培养基(乳清分解培养基)中接种1％的格氏乳杆菌OLL2809的前培养液，在37℃、下限pH为4.5(利用6mol/L NaOH自动调节)、氮上面通气下培养18小时。之后，将培养液浓缩20倍，在85℃下进行60分钟加热处理。冷却后，冷冻干燥，将干燥物粉碎，制成格氏乳杆菌OLL2809冷冻干燥粉末。

OLL2809组所摄取的OLL2809片是将格氏乳杆菌OLL2809冷冻干燥粉末16.7mg与赋形剂等配合而制造的每1片500mg的片剂。OLL2809+αLA组所摄取的OLL2809+αLA片是将格氏乳杆菌OLL2809冷冻干燥粉末16.7mg和αLA 150mg以及赋形剂等配合而制造的每1片500mg的片剂。安慰剂组所摄取的安慰剂片是代替格氏乳杆菌OLL2809冷冻干燥粉末及αLA而配合糊精并添加赋形剂而制造的每1片500mg的片剂。这些所有片剂均在外表、颜色、味道上无法分辨。

(4)受试物的摄取量

所有组均1次2片、1天3次(早、中、晩)、整个4周连续摄取各自所摄取的片剂。即，OLL2809组的1天的摄取量是L.gasseri OLL2809冷冻干燥粉末100mg(5×10¹⁰个细胞)，OLL2809+αLA组的摄取量是格氏乳杆菌OLL2809冷冻干燥粉100mg(5×10¹⁰个细胞)和αLA900mg。

(5)统计分析

盲检结果的评论在解盲前实施，脱离症例的处理基于盲检数据进行判断。该评价对结束试验的全部受试者实施。

结果以平均值±标准偏差表示。受试者背景因素进行单因素方差分析(One-wayANOVA)。POMS、利用VAS法的疲劳感调查、NK活性以受试物因素和摄取前后的观察期因素这2个因素进行双因素重复测量方差分析(Two-way repeated-measures(rm)ANOVA)(疲劳感调查、NK活性采用各观察期间的运动前后的差)。在确认显著的情况下实施post hoc分析，组内的摄取前后的比较以Student的配对t检验(Bonferroni校正)实施。P<0.05时判断为显著。

(6)结果

[受试者的背景因素]

试验中44人(安慰剂组14人、OLL2809组15人、OLL2809+αLA组15人)参加，全员结束试验期间。没有因违反依从性或有害现象等而导致的中止/脱离症例。最终以全部受试者为分析对象。将摄取前记录的受试者的背景因素示于表1中。在全部项目中3组间未见显著性差异。

表1

受试者背景因素

结果以平均值±标准偏差表示。

n.s.：没有显著差异(单因素方差分析)。

[POMS]

将POMS的结果示于表2及图4中。各组内将摄取前与4周后进行比较，就“紧张‐不安”而言，安慰剂组在摄取前为44.9±9.9、4周后为43.0±6.0，未见显著性差异，但在OLL2809组中，摄取前为43.6±8.2、4周后为40.6±6.9，可见显著性降低(P＝0.006)。此外，在OLL2809+αLA组中，摄取前为42.6±6.1、4周后为39.7±6.3，可见降低的倾向(P＝0.095)。

就“疲劳”而言，安慰剂组、OLL2809组均在摄取前后未见显著性差异，但仅在OLL2809+αLA组中，摄取前为43.8±6.1、4周后为40.3±5.2，可见降低的倾向。

根据以上的结果可见，OLL2809可减轻紧张或不安之类的心理应激，进而OLL2809和αLA可减轻因慢性应激而感觉到的日常的疲劳感的效果。

表2

OLL2809及αLA对心境状态量表检查(POMS)得分的效果

受试物摄取前后的POMS

结果以平均值±标准偏差表示。

#、*：p＜0.1，0.05(通过Student的配对t检验与摄取前的组内比较)。

[使用VAS法的因运动负荷而产生的疲劳感的评价]

将使用VAS法的因运动负荷而产生的疲劳感的结果示于图5中。各组内将运动前时的疲劳感在摄取前后进行比较，在OLL2809+αLA组中，4周后可见VAS得分的显著性降低(P＝0.026)。该结果与POMS的结果也一致。因此，对运动前的检查值进行相关分析，在POMS与VAS法中的疲劳感中可见显著性的正相关(r＝0.293、n＝88、P＝0.0053)。由这些结果启示，在OLL2809+αLA组中通过4周的受试物的摄取，慢性的疲劳感减轻。

[NK细胞杀伤活性]

将在受试物质的摄取前实施的运动前后的末梢血NK细胞障碍活性和在摄取4周后实施的运动前后的末梢血NK活性的结果示于图6中。

在摄取前，在1小时的运动后NK活性在安慰剂组中为－12.4±11.0％，在OLL2809组中为－12.2±12.3％，在OLL2809+αLA组中降低至－14.5±11.4％。另一方面，4周后的运动前后的差异在安慰剂组中为－8.8±12.0％，在OLL2809组中为－2.7±14.2％，在OLL2809+αLA组中为－4.3±10.2％。

在各组内在运动负荷的前后进行比较，在受试物的摄取前在全组中因运动负荷而可见显著的NK活性的降低。另一方面，在4周后在安慰剂组(P＝0.016)中与摄取前同样地可见因运动负荷而产生的显著的降低，与此相对，在OLL2809组(P＝0.476)及OLL2809+αLA组(P＝0.125)中未可见NK活性的显著性降低。即表明，通过OLL2809株的摄取，因运动负荷之类的慢性应激而导致的NK活性的降低得到减轻。

[血中dROMs、TGF-β1]

将末梢血中的dROMs、TGF-β1的结果示于表3中。

dROMs是表示由活性氧/自由基导致的氧化的伤害程度、即氧化应激度的指标。dROMs仅比较运动前的值，在安慰剂组中在摄取前为303±56U.CARR、在4周后为298±80U.CARR，未见显著性差异，但在OLL2809组中摄取前为298±50U.CARR、4周后为283±27U.CARR，显示降低的倾向(P＝0.089)。此外，在OLL2809+αLA组中摄取前为317±58U.CARR、4周后为284±53U.CARR，显著降低(P＝0.033)。这些值中未见到因运动负荷而产生的影响。

TGF-β1是被认为是中枢性疲劳的原因物质的细胞因子。TGF-β1仅比较运动前，摄取前在安慰剂组、OLL2809组、OLL2809+αLA组中分别为1.29±0.35、1.33±0.27、1.35±0.32ng/ml，摄取4周后分别为1.23±0.18、1.20±0.15、1.19±0.19ng/ml，均未见显著的组间差异。在各组内与摄取前进行比较，在安慰剂组中未见显著的变化，与此相对，在OLL2809组中可见降低的倾向(P＝0.075)。此外，在OLL2809+αLA组中可见显著的降低(P＝0.035)。

表3

受试物摄取对末梢血TGF-β1、dROMs产生的影响

结果以平均值±标准偏差表示。

^#，^*：P＜0.1，0.05(通过Student的配对t检验与摄取前的组内比较)。

^s，^&：P＜0.1，0.05(通过Student的配对t检验与运动前的比较)。

根据格氏乳杆菌OLL2809及αLA的运动选手的状态改善效果的研究，确认格氏乳杆菌OLL2809的摄取对于精神应激的减轻及剧烈运动后降低的免疫力的维持是有效的。另外，通过除了格氏乳杆菌OLL2809以外还摄取αLA，可见缓和每天的疲劳感的效果。由以上的结果表明，仅摄取格氏乳杆菌OLL2809、或除了格氏乳杆菌OLL2809以外还摄取αLA，对于运动选手的每天的训练之类的慢性的应激通过发挥减轻免疫功能的降低、同时缓和疲劳感之类的心理面(心理应激)的效果，对于调整运动选手的身体状况(改善状态)是有用的。

产业上的可利用性

基于本发明提供的以格氏乳杆菌、或格氏乳杆菌及αLA为有效成分的应激减轻剂通过经口摄取，能够缓和因慢性应激引起的身体状况不良。

Claims

1.一种组合物，其含有以保藏号NITE BP-72保藏的格氏乳杆菌OLL2809菌株(Lactobacillus gasseri OLL2809)及α-乳白蛋白即αLA作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，含有1×10⁷个以上的格氏乳杆菌OLL2809菌株。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，含有40重量％以上的αLA。

4.以保藏号NITE BP-72保藏的格氏乳杆菌OLL2809菌株(Lactobacillus gasseriOLL2809)与α-乳白蛋白即αLA的组合在制造应激减轻用组合物中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其中，应激为慢性应激。

6.一种组合物的制造方法，其中，所述组合物含有以保藏号NITE BP-72保藏的格氏乳杆菌OLL2809菌株(Lactobacillus gasseri OLL2809)及α-乳白蛋白即αLA作为有效成分。