CN105018528A - 热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子控制的多基因表达和沉默系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子控制的多基因表达和沉默系统，同一质粒系统中热休克基因启动子HSPP与四环素基因启动子TETp互不影响，各自独立控制其下游的目的基因或shRNA的表达，既可人为控制单独一个基因或shRNA的表达，也可人为控制两个基因或shRNA共同表达。本发明为多基因特异性协调控制提供了条件，解决了目前采用多质粒共转染方法实现基因共表达所带来的表达效率低的问题，并且采取慢病毒搭载系统可以在难转染的细胞中实现选择性基因或shRNA的高效表达，满足了各种实验的需要，同时提供多基因靶点控制平台，为基因治疗提供更多的可能性。

Description

热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子控制的多基因表达和沉默系统

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子控制的多基因表达和沉默系统。

背景技术

在研究一些特定基因如与细胞生长、发生、发展密切相关的基因时，由于不能精细调控目的基因的表达程度可能同时会影响正常细胞的生长、增殖，因此可调控，可诱导系统被认为是未来基因治疗的重要发展方向。诱导型表达载体可以通过诱导型启动子来调节基因表达，进而实现目的基因的定时定量诱导表达。目前应用的诱导体系有cre2loxP系统，四环素诱导体系，蜕皮素诱导体系，热休克诱导体系和乳糖诱导体系。其中，四环素调控表达系统(tetracycline expression system)包括Tet-on和Tet-off系统。Tet-off基因表达系统包含有2个调控元件：TRE启动子包含有四环素操纵基因TetO(tet operator，TetO)的42个碱基的7次正向重复序列；杂合的四环素调控的转录活化因子(tetracycline-controlled transcriptionalactivator，tTA)，称四环素调节转录因子(tTA)，该因子可与反应转录的四环素反应元件(Tet-responsive element，TRE)结合，在没有四环素(tetracycline)或其衍生物强力霉素(Doxycycline)存在的情况下，引起插入启动子下游的目的基因或shRNA的高效表达。TRE启动子包含人巨细胞病毒的最低限度启动子(minimal CMV promoter，PminCMV)，其特点是启动子缺少增强子，不能单独启动外源基因表达，由于增强子的缺失，在无转录调控部分与它结合时，因而不会有外源基因的表达。通过改变tTA的氨基酸顺序构建了受四环素正调节的基因表达系统，称为Tet-on基因表达系统。该系统在没有四环素及其衍生物强力霉素(Doxycycline，Dox)的情况下目的基因表达水平为零或者很低，而在加入四环素衍生物强力霉素(Doxycycline，Dox)后目的基因高效表达。在该系统中，通过突变氨基酸残基就得到了四环素调控的反式激活子(reverse tet-controlled transactivator，rtTA)，当无Dox存在时，它不能识别其特异的DNA靶序列(TetO)，故不能进行转录；当有Dox存在时，rtTA构象发生改变，接着与TetO反应元件结合启动转录，由于加入四环素促进基因的表达，因此称之为“Tet-on”；

而热休克蛋白HSP70是热休克蛋白家族中的一员，是从细菌到哺乳动物广泛存在的一类热应急蛋白质。当有机体暴露于高温的时候，就会由热激发合成此种蛋白，来保护有机体自身。许多热休克蛋白具有分子伴侣活性。许多小分子热休克蛋白基因一般并不表达，显著表达小分子热休克蛋白一般是细胞受到外部刺激的时候，比如高温刺激。当将生物的整体、组织、细胞等从其生活的温度范围内急剧地从低温移向高温时，可显著地降低一些蛋白质的合成；与此相反，休克蛋白的合成却反而被促进。经研究发现，热休克蛋白启动子中存在有一种热休克元件(HSE)，能够感受温度范围的变化，在高温环境下，HSE元件被激活，进而激活热休克蛋白启动子，热休克蛋白得以表达。因此含有热休克元件(HSE)的Hsp70启动子，可以实现温度诱导的基因表达。另外，过高热是通过微波无线电频率杀死肿瘤细胞的有效方法，同时，过高热具有准确的定位和无副作用的优点。因此热休克系统可运用到肿瘤的临床治疗中。

目前诱导型表达载体已应用到肿瘤基因治疗相关研究中，如结肠癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等癌症的细胞体外研究和实验动物的体内研究已经卓有成效，为肿瘤的基因治疗提供了新的思路。但是当前可调控系统存在以下主要缺陷：(1)漏表达(leaky expression)，即在调控抑制状态下存在不同程度目的基因的表达，形成背景噪音，由于哺乳动物的基因系统是复杂的多级、多途径环路，基础表达不可避免；(2)在肿瘤治疗的基因中，往往单个治疗起不到很好的治疗效果，而多靶点的基因治疗能获得更好的疗效，传统的控制系统都是单个诱导控制系统，无法实现多基因靶点的可调控控制，传统多基因的表达往往采用质粒共转染的方法，而共转染导致基因表达效率低，无法很好的满足实验要求；(3)传统的单个诱导控制系统在遇到两个基因都需要同时协调控制的情况时，无法满足实验的需要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子控制的多基因表达和沉默系统，在同一个质粒系统中热休克蛋白基因启动子与四环素基因启动子之间既可以互不干扰，独立工作，也可以实现基因共表达。

本发明采取的技术方案如下：

1、一种基因表达系统，所述系统包括热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子，以及它们各自控制的下游基因或shRNA。

优选的，所述系统为慢病毒基因表达系统，经过转染包装后所述慢病毒基因表达系统含有热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子，以及它们各自控制的下游基因或shRNA的慢病毒颗粒。

优选的，所述热休克蛋白基因启动子为HSP70基因启动子。

2、一种重组载体，所述载体包括HSP70基因启动子、四环素基因启动子、由HSP70基因启动子启动表达的绿色荧光蛋白基因和由四环素基因启动子启动表达的Turbo RFP基因。

优选的，所述重组载体为pTripZ重组质粒。

5、重组载体的制备方法，包括如下步骤：用ClaI和XhoI酶37℃水浴酶切SEQ ID NO.3所示HSP70基因启动子序列和PtripZ载体各5min，回收酶切后的HSP70基因启动子片段以及载体骨架片段，并将回收后的HSP70基因启动子片段连接至酶切后的PTirpZ质粒骨架片段，16℃连接1h，4℃孵育12h后将连接产物转化至Stbl3感受态细胞，AMP⁺抗性平板涂板，倒置培养14h，菌落PCR鉴定，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对阳性菌落扩大培养14h，进行质粒提取，经测序鉴定得到PTRIPZ-HSP70P载体；

用XhoI和MluI37℃水浴酶切SEQ ID NO.6所示绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列和PTRIPZ-HSP70P载体各10min，回收酶切后的EGFP片段以及载体骨架片段，将回收后的EGFP基因片段连接至酶切后的PTRIPZ-HSP70P质粒骨架片段，16℃连接1h，4℃孵育12h，然后将连接产物转化至Stbl3感受态细胞，AMP⁺抗性平板涂板，倒置培养14h，对单菌落进行菌落PCR鉴定，并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对阳性菌落扩大培14h，提取质粒，经测序鉴定得到PTRIPZ-HSP70P-EGFP载体。

6、基因表达系统或重组载体在调控下游基因或shRNA表达中的应用。

本发明中，同一质粒系统中热休克基因启动子HSPP与四环素基因启动子TETp互不影响，各自独立控制其下游的目的基因，如图1所示。因此，该质粒系统为特异性多基因控制系统，具有多基因的开关机制。既可实现人为定时、选择性地控制单个基因或shRNA的表达情况，也可人为控制两个基因或两个shRNA的共表达，以此来提高基因共表达的效率。

本发明的有益效果在于：本发明通过热休克启动子和四环素Turn-on系统分别控制一种基因或shRNA的表达，在37℃条件下，热休克蛋白启动子控制的基因或shRNA处于静默状态，在温度升高的条件下，热休克启动子下游基因或shRNA处于高表达状态；在没有四环素类药物Deoxycycline(DOX)的存在下，四环素启动子控制的基因或shRNA处于静默状态，添加适量浓度的DOX后，四环素启动子下游基因或shRNA处于高表达状态；四种衍生模型如图3所示。采取本发明所述的技术方案，既可以人为选择性严谨控制基因或shRNA的表达，又能够在同一个质粒中高效率实现基因或shRNA的共表达，解决目前采用多质粒共转染的方法来实现基因共表达带来的表达效率低的问题，另外，采取慢病毒搭载系统，可以实现在难转染的细胞中选择性进行基因或shRNA的高效表达，以满足各种实验的需要，同时提供多基因靶点控制平台，为基因治疗提供更多的可能性。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1携带EGFP基因的热诱导表达框和携带有Turbo RFP基因的四环素系统表达框；

图2四环素基因启动子作用元件rtTA3的表达框；

图3本发明衍生的四种模型表达框图；

图4pTripZ-HSP70P-EGFP质粒图谱；

图5转染pTripZ-HSP70P-EGFP质粒后293T细胞的荧光表达图；分别设置：37℃不加入DOX诱导的正常生长293T细胞为对照组，37℃加入DOX诱导实验组，43℃诱导不加入DOX诱导实验组，43℃诱导加入DOX诱导实验组；

图6western blot检测不同实验组之间的EGFP和Turbo RFP的蛋白水平表达(图中a图)以及灰度值计算统计结果(图中b图)。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

一、人类HSP70启动子的扩增

乳腺癌细胞株MCF-7(由重庆大学生物工程学院杨力教授提供)在含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃、5％的CO2培养箱中培养36小时，然后用质量分数0.25％胰酶在25℃条件下消化3-5分钟，再在转速为3500rpm条件下，离心3min，收集细胞，用细胞基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取基因组总DNA，作为模板。

根据NCBI中报道的HSP70基因启动子的序列设计HSP70基因启动子的引物序列如下：

上游引物：5’-ccatcgat agatctcactctggcctctgattggt-3’，(SEQ ID NO.1)，

第一处下划线部分为ClaⅠ识别位点，第二处下划线部分为BglⅡ识别位点；

下游引物:5’-ccgctcgagc tggaaacgga acactggat-3’，(SEQ ID NO.2)，

下划线部分为XhoⅠ识别位点。

然后以提取的基因组总DNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃预变性90s；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，总共35个循环；最后72℃延10min(PCR中采用TIANGEN Pfu 50ul体系)。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(110V；20min)，然后采用OMEGA切胶回收试剂盒回收目的片段，经测序获得如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

二、EGFP基因的扩增

为了使获得的重组载体中，启动子下游报告基因表达量具有可肉眼观测的特点，同原始PTrripZ质粒中采用Turbo RFP作为四环素启动子下游报告基因类似，选用具有荧光标记功能的EGFP基因作为HSP70启动子下游的报告基因。以质粒pEGFP-C1(购自上海英骏生物技术有限公司)为模板，根据增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列设计引物如下：

上游引物：5’-ccgctcgagt cagatccgct agcgctaccg gtcg-3’，(SEQ ID NO.4)，

下划线部分为XhoI酶识别位点；

下游引物：5’-cgacgcgt ggtaccttactt gtacagctcg tccatgccg-3’，(SEQ ID NO.5)，

第一个下划线为MluⅠ内切酶识别位点，第二个下划线为KpnI酶识别位点；

进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性90s；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，总共35个循环；最后72℃延伸10min(PCR中采用TIANGEN Pfu 50ul体系)，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(110V；20min)，然后采用OMEGA切胶回收试剂盒回收目的片段，经测序获得如SEQ ID NO.6所示序列。

三、构建由HSP70基因启动子和四环素启动子控制的重组载体

1、pTRIPZ-HSP70P的构建

如SEQ ID NO.3所示序列的人类HSP70基因启动子与载体pTripZ进行ClaI和XhoI双酶切，回收酶切后人类HSP70基因启动子片段和pTripZ载体骨架片段，然后将人类HSP70基因启动子片段和pTripZ载体骨架片段连接，构成pTripZ-HSP70P重组载体。在HSP70基因启动子的5’端和3’端分别用ClaI和XhoI位点用于将启动子连接到pTripZ慢病毒质粒载体上，构建质粒PTRIPZ-HSP70P重组载体。在ClaI位点下游还添加了一段BglII的酶切位点，供后续实验中使用。

构建PTRIPZ-HSP70P重组质粒具体步骤如下：

将所得SEQ ID NO.3所示序列用ClaI和XhoI双酶切，同时用ClaI和XhoI双酶切PtripZ载体(两种酶均为Takara QuickCut酶，37℃水浴酶切5min)，采用OMEGA液相回收试剂盒回收酶切后的HSP70基因启动子片段以及回收载体骨架片段，回收后的HSP70基因启动子片段连接至酶切后的PTirpZ质粒骨架片段(Takara T4连接酶，16℃连接1h，4℃过夜)，然后对连接产物转化至Stbl3感受态细胞，将转化后的产物在AMP⁺的抗性平板上进行涂板，倒置培养14h，对单菌落进行菌落PCR鉴定(菌落PCR采用的是TIANGEN Pfu高保真酶)，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(110V，20min)，对阳性菌落扩大培养14h，采用TIANGEN小提中量质粒提取试剂盒进行质粒提取，经生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定得到PTRIPZ-HSP70P载体。

2、pTRIPZ-HSP70P-EGFP的构建

如SEQ ID NO.6所示序列的EGFP基因序列与载体pTripZ-HSP70P进行XhoI和MluI双酶切，5’端和3’端分别采用XhoI和MluI酶切位点用于将EGFP连接到PTRIPZ-HSP70P慢病毒质粒载体上，回收酶切后的EGFP基因片段和pTripZ-HSP70P载体骨架片段，然后将EGFP基因片段和pTripZ-HSP70P载体骨架片段连接，构成pTripZ-HSP70P-EGFP重组载体。在MluI位点上游还添加了一段KpnI的酶切位点，供后续实验中使用。

构建PTRIPZ-HSP70P-EGFP重组质粒具体步骤如下：

将所得SEQ ID NO.6所示序列用XhoI和MluI双酶切，同时用XhoI和MluI双酶切PTRIPZ-HSP70P载体(两种酶均为Takara QuickCut酶，37℃水浴酶切10min)，采用OMEGA液相回收试剂盒回收酶切后的EGFP片段以及回收载体骨架片段，回收后的EGFP基因片段连接至酶切后的PTRIPZ-HSP70P质粒骨架片段(Takara T4连接酶，16℃连接1h，4℃过夜)，然后对连接产物转化至Stbl3感受态细胞，将转化后的产物在AMP⁺的抗性平板上进行涂板，倒置培养14h，对单菌落进行菌落PCR鉴定(菌落PCR采用的是TIANGEN Pfu高保真酶)，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(110V，20min)，对阳性菌落扩大培14h，采用TIANGEN小提中量质粒提取试剂盒进行质粒提取，经生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定得到PTRIPZ-HSP70P-EGFP载体，载体图谱如图4所示。

四、载体验证

1、热诱导以及DOX诱导细胞表达EGFP和Turbo RFP

Turbo RFP基因为四环素启动子下游的靶基因，EGFP基因被选作热休克启动子下游的靶基因，表达框如图1所示，其中四环素启动子作用因子rtTA3表达框如图2所示。用EffectenceTransfection Reagent(QIAGEN)转染重组质粒到293T细胞中，转染24小时后，观察细胞生长情况，采用43℃热刺激诱导细胞表达EGFP或加入适量浓度的DOX诱导细胞表达Turbo RFP。

阴性对照组设置：以转染后在37℃、5％CO₂条件下培养不加入DOX诱导的293T细胞为对照组，记为37℃Control。

实验组分别设置：1、在37℃、5％CO₂条件下培养并加入10ug/ml DOX诱导实验组，记为37℃Group DOX+；2、在43℃、5％CO₂条件下诱导不加入DOX诱导实验组，记为43℃Group DOX-；3、在43℃、5％CO₂条件下诱导培养并加入10ug/ml DOX诱导实验组，记为43℃Group DOX+。

热诱导以及DOX诱导细胞表达具体实验步骤：

将PTRIPZ-HSP70P-EGFP质粒(1μg)用转染试剂(QIANGEN)转染至293T细胞，转染4h后更换DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)，转染16h后开始热诱导和DOX诱导，热诱导方法为：将相应实验组放置于43℃、5％CO₂条件下热激时间70min，热激结束后，将实验组放回37℃、5％CO₂条件下恢复生长4h，重复三次热激过程；DOX诱导方法为：在相应的实验组中添加终浓度为10μg/ml的DOX进行诱导，诱导时间与37℃Control培养时间相同。

诱导过程结束后，荧光显微镜下观察对照组和3个实验组的细胞状态以及报告基因表达情况，如图5所示。由图5可知，在37℃、5％CO₂条件下，HSP70启动子的启动能力很低，EGFP表达量很低，在43℃、5％CO₂条件下诱导导致EGFP大量表达，说明HSP70启动子在热诱导状态下具有极高的启动效率。另外，在无DOX诱导的情况下四环素启动子不具有启动能力，Turbo RFP不表达，而在加入适量浓度DOX诱导情况下，四环素启动子效率极高，Turbo RFP大量表达。

2、Western blot检测报告基因蛋白水平表达情况

以上3组实验组和阴性对照组细胞，经相应的热激处理和DOX诱导后，用质量分数0.25％的胰酶消化后，在转速为3500rpm条件下离心3min，收集细胞。将收集的细胞用哺乳动物蛋白抽提试剂盒(康为世纪)抽提全蛋白，根据BCA的结果，选择70μg的蛋白上样量，然后用10％SDS-PAGE胶电泳分离，然后转移到0.45μm PVDF(Magna)膜上，以GAPDH作为对照。EGFP和Turbo RFP转膜时间为45min，GAPDH转膜时间为60min，膜在室温下蛋白封闭1h，一抗4℃孵育过夜，EGFP一抗为鼠源单克隆抗体(稀释比例1：2000，Proteintech公司)，GAPDH一抗为兔源多克隆抗体(稀释比例为1：5000Proteintech公司)，Turbo RFP一抗为鼠源单克隆抗体(稀释比例1：2000；Origene公司)，辣根根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG(Proteintech公司)作为二抗(稀释比例1:5000)，二抗室温孵育1h。弃去二抗后，用1×TBST清洗PVDF膜3次，每次10min，然后进行ECL显影，结果如图6中a图所示。western blot结果进行灰度值计算(Quantity One、ImageJ软件)后对结果进行统计分析(GraphPad Prim5软件)，统计结果如图6中b图所示。

由图6可知，与图5结果一致，在37℃下，EGFP表达量很低，在43℃下EGFP大量表达，说明HSP70启动子在热诱导状态下具有极高的启动效率。另外，在无DOX诱导的情况下Turbo RFP不表达，而在加入适量浓度DOX诱导情况下，Turbo RFP大量表达。此外，由图6中b图可知，实验温度变化对四环素启动子没有造成影响，并且在有无DOX药物诱导的情况下，同一温度下的HSP70启动子的表达效率无变化，故DOX的加入也没有对HSP70启动子的启动效率造成影响，即HSP70启动子不受DOX影响，四环素启动子也不受温度影响。综上，TRE启动子和HSP70启动子能互不影响工作，并能分别可控、高效的启动基因的表达。

五、载体模型衍生

本发明的目的在于同一个质粒系统中提供一种可调控启动子控制的多基因表达和沉默系统，实验过程中证明了同一质粒系统中热休克基因启动子HSPp与四环素基因启动子TETp互不影响，各自独立控制其下游的目的基因，表达框如图1所示，因此图3中所示的第三种模型得到证实。

在载体中进行shRNA的表达，大量文献表明，HSP70启动子和四环素启动子在单独情况下都可启动下游shRNA的表达，因此，在该系统中两种polII型启动子启动shRNA表达的能力与启动报告基因一样。即图3所示的其他几种模型都可以像图中第三种模型一样正常工作。在37℃条件下，热休克蛋白启动子控制的基因或shRNA处于静默状态，在热诱导条件下，热休克启动子下游基因或shRNA处于高表达状态；在没有四环素类药物Deoxycycline(DOX)的存在下，四环素启动子控制的基因或shRNA处于静默状态，添加适量浓度的DOX后，四环素启动子下游基因或shRNA处于高表达状态，二者之间互不影响、互不干扰。所以，该质粒系统为特异性多基因或shRNA控制系统，具有良好的多开关机制，既可实现定时、选择性地控制单个基因或shRNA的表达情况，也可人为控制两个基因或两个shRNA的共表达，以此来提高基因共表达的效率。

本发明中热休克蛋白基因HSP70启动子可以用其他的热休克蛋白基因启动子替换，例如：HSP70家族中的HSPA2、HSPA1L、HSPA8基因启动子，HSP72基因启动子，HSP90家族中的HSP90a、HSP90β基因启动子等，由于此类启动子同样受温度调控，因此能够同样实现发明目的。同理，本发明中采用的四环素启动子也可以由其他可调控启动子替换能够同样实现本发明的目的。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种基因表达系统，其特征在于，所述系统包括热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子，以及它们各自控制的下游基因或shRNA。

2.根据权利要求1所述的基因表达系统，其特征在于，所述系统为慢病毒基因表达系统，经过转染包装后所述慢病毒基因表达系统含有热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子，以及它们各自控制的下游基因或shRNA的慢病毒颗粒。

3.如权利要求1或2所述的基因表达系统，其特征在于，所述热休克蛋白基因启动子为HSP70基因启动子。

4.一种重组载体，其特征在于，所述载体包括HSP70基因启动子、四环素基因启动子、由HSP70基因启动子启动表达的绿色荧光蛋白基因和由四环素基因启动子启动表达的TurboRFP基因。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pTripZ重组质粒。

6.权利要求4或5所述重组载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：用ClaI和XhoI酶37℃水浴酶切SEQ ID NO.3所示HSP70基因启动子序列和PtripZ载体各5min，回收酶切后的HSP70基因启动子片段以及载体骨架片段，并将回收后的HSP70基因启动子片段连接至酶切后的PTirpZ质粒骨架片段，16℃连接1h，4℃孵育12h后将连接产物转化至Stbl3感受态细胞，AMP⁺抗性平板涂板，倒置培养14h，菌落PCR鉴定，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对阳性菌落扩大培养14h，进行质粒提取，经测序鉴定得到PTRIPZ-HSP70P载体；

用XhoI和MluI37℃水浴酶切SEQ ID NO.6所示绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列和PTRIPZ-HSP70P载体各10min，回收酶切后的EGFP片段以及载体骨架片段，将回收后的EGFP基因片段连接至酶切后的PTRIPZ-HSP70P质粒骨架片段，16℃连接1h，4℃孵育12h，然后将连接产物转化至Stbl3感受态细胞，AMP⁺抗性平板涂板，倒置培养14h，对单菌落进行菌落PCR鉴定，并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对阳性菌落扩大培14h，提取质粒，经测序鉴定得到PTRIPZ-HSP70P-EGFP载体。

7.权利要求1～3任一项所述的基因表达系统，或权利要求4或5所述的重组载体在调控下游基因或shRNA表达中的应用。