CN104988166A

CN104988166A - 耐高温异淀粉酶基因的克隆、表达及应用

Info

Publication number: CN104988166A
Application number: CN201510281727.6A
Authority: CN
Inventors: 陈红歌; 杨森; 程琨; 王明道; 张以恒
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2015-05-28
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2035-05-28
Also published as: CN104988166B

Abstract

本发明属于基因工程和生物能源技术领域，具体涉及一种耐高温异淀粉酶基因克隆、表达及在酶生物燃料电池中的应用。该淀粉酶DNA序列如SEQ ID NO.1所示，全长2151bp。该耐高温异淀粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括716个氨基酸，分子量为83.1KDa，其中编码序列17~108氨基酸为第48家族的碳水化合物结合模序；编码序列204~545氨基酸为淀粉酶催化结构域。该耐高温异淀粉酶可用于酶生物燃料电池。本发明优势在于：异淀粉酶耐高温、酶活力稳定，具有很强工业应用潜力；用于糖燃料电池时，可使淀粉类物质彻底水解为葡萄糖，从而提高能量转化效率，拓展生物燃料电池的应用范围。

Description

耐高温异淀粉酶基因的克隆、表达及应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物能源技术领域，具体涉及一种耐高温异淀粉酶基因克隆、表达及在酶生物燃料电池中的应用。

背景技术

生物燃料电池是以有机物为原料，利用细胞或酶将化学能转化为电能的一类绿色燃料电池。根据催化剂种类可分：微生物燃料电池和酶生物燃料电池，它们具有能量转化效率高、生物相容性好、原料来源广泛、成本低廉且环保等优点，在医疗、电子、环境保护等领域均有重要的使用价值。但目前大部分的生物燃料电池输出功率密度较低，极大限制了在生产中的应用。微生物燃料电池由于对电子屏蔽作用明显和较多副反应导致对燃料使用效率较低，而酶生物燃料由于催化剂浓度较高并且没有传质壁垒，因此有可能产生更高的输出功率，在室温和中性溶液中工作，满足一些微型电子设备或生物传感器的需求。另外，与甲醇燃料电池相比，糖分（淀粉或葡萄糖）驱动的酶燃料电池因原料成本低廉，生物可降解性更强，更绿色环保而获得研究者青睐。最新研究表明：在不消耗ATP前提下，通过人工合成的多酶催化途径，可以实现淀粉水解为葡萄糖和葡萄糖彻底氧化偶联技术，这有力推动了高能量密度的酶燃料电池的发展，为淀粉类原料在酶燃料电池中的应用提供了很大可能性。但针对淀粉类原料中的支链淀粉和麦芽糖糊精，由于存在大量糖苷键分支位点（如图1所示），在α-葡聚糖磷酸化酶作用下，水解为葡萄糖-1-磷酸效率偏低，造成能源浪费和酶燃料电池能量密度的降低。针对支链淀粉和麦芽糖糊精，异淀粉酶或普鲁兰酶可以将支链淀粉和麦芽糖糊精中的α-1，6糖苷键水解，切下整个侧枝，形成直链淀粉，极大提高了α-葡聚糖磷酸化酶水解支链淀粉的能力。但是，目前已发现的普鲁兰酶或异淀粉酶都存在稳定性差，不耐热等问题，限制了此类酶在工业中的应用。所以，耐高温异淀粉酶的发现和应用对提高新型淀粉燃料电池作用至关重要。

发明内容

本发明主要目的是提供一种耐高温异淀粉酶基因序列，同时提供该序列所表达蛋白的制备方法及该蛋白在酶生物燃料电池中的应用。

本发明所采取的技术方案如下。

一种耐高温异淀粉酶基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示，全长2151bp，该基因从KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库中的Sulfolobus tokodaii基因组中筛选获得，其代码为：ORF ST0928。

所述耐高温异淀粉酶基因所编码耐高温异淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括716个氨基酸，分子量为83.1KDa，其中编码序列17~108氨基酸为第48家族的碳水化合物结合模序（CBM）；编码序列204~545氨基酸为淀粉酶催化结构域；编码序列546~716为未知功能多肽；该酶在本发明申请之前被推定为一种糖原脱枝酶，本申请则经过验证证明其为耐高温异淀粉酶。

所述耐高温异淀粉酶的制备方法，包括以下步骤：

（1）基因克隆，通过设计引物，应用PCR技术扩增或人工合成方法得到包含异淀粉酶基因全长序列；

设计引物序列设计如下：

IF：5’ ACTTT AAGAA GGAGA TATAC ATatg gtttt ttcac acaag gatag accat 3’，

IR：5’ TCAGT GGTGG TGGTG GTGGT Gatat tcaat cctcc tatat accat tgcgg 3’；

VF：5’ ccgca atggt atata ggagg attga atatC ACCAC CACCA CCACC ACTGA 3′，

VR：5’ atggt ctatc cttgt gtgaa aaaac catAT GTATA TCTCC TTCTT AAAGT 3’。

其中其中IF和IR的5’端大写碱基属于pET20b (+)载体上的序列，3’端小写碱基属于插入基因ORF ST0928上序列；VF和VR的5’端小写碱基属于插入基因ORF ST0928上序列，3’端大写碱基属于pET20b (+)载体上序列， IF与VR反向互补，IR与VF反向互补；

（2）载体构建，分别以异淀粉酶基因和市售载体上的序列为模板，采用文献You等（DNA Cloning and Assembly Methods，Humana Press，2014，183-192）提供的简单克隆方法，进行重叠延伸PCR得到重组表达质粒；

（3）异淀粉酶表达与纯化，将重组质粒转入E. coli Rosetta (DE3)中，挑选阳性重组子培养，IPTG诱导表达，收获细胞，超声破碎后，使用镍柱将带有His标签的异淀粉酶纯化出来。

所述耐高温异淀粉酶，最适反应条件为：以500μL反应体系为例，含40 mM乙酸缓冲液（pH 5.5），添加有0.5 mM MgCl₂，85℃催化反应。

所述耐高温异淀粉酶可用于酶生物燃料电池中，所述酶生物燃料电池为单极室无隔膜类型，结构包括：反应容器、离子交换膜和反应物；

所述反应物包括：淀粉、耐高温异淀粉酶、α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、二氢硫辛酸脱氢酶、HEPES缓冲液、NaCl、NAD⁺、 Mg²⁺、Mn²⁺和电子穿梭体(AQDS)；

具体为：淀粉、0.012%耐高温异淀粉酶（质量体积比）、7U α-葡聚糖磷酸化酶（αGP）、3U 磷酸葡萄糖变位酶（PGM）、1.5U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）、5.4 U二氢硫辛酸脱氢酶（DI）、50 mM pH 7.2 的HEPES缓冲液、0.3 M NaCl、4 mM NAD+、5 mM Mg2+、0.25 mM Mn²⁺、1.7 mM 电子穿梭体(AQDS)。

发明人从Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)数据库中，对于最适生长温度在80℃的耐高温古生菌Sulfolobus tokodaii的基因组进行筛选后发现，其开放阅读框ORF ST0928序列，理论推测其具有糖原脱枝酶活性，但目前还没有任何相关文献对其生化性质进行过详细描述。发明人采用基因工程方法，通过将ORF ST0928序列进一步转化整合进入大肠杆菌进行诱导表达后，得到一种新的耐高温异淀粉酶重组蛋白，检测结果表明，该耐高温异淀粉酶热稳定性优良，在90℃条件下半衰期可达200min，用于糖燃料电池时，有望取得优良效果。具体而言，该耐高温异淀粉酶的优势在于：（1）ORF ST0928基因编码的异淀粉酶耐高温、酶活力稳定，具有很强工业应用潜力；（2）该耐高温异淀粉酶用于糖燃料电池时，可使淀粉类物质彻底水解为葡萄糖，从而提高能量转化效率，拓展生物燃料电池的应用范围。

附图说明

图1为异淀粉酶作用原理图；

图2为表达载体pET20b-StIA构建图；

图3为目的蛋白即耐高温异淀粉酶电泳检测结果；

图4为糖燃料电池构造原理图，其中#1为异淀粉酶；#2为α-葡聚糖磷酸化酶；#3为磷酸葡萄糖变位酶；#4为6-磷酸葡萄糖脱氢酶；#5为二氢硫辛酸脱氢酶；AQDS为电子穿梭体；

图5为糖燃料电池实物图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。

实施例1

本发明所提供的耐高温异淀粉酶基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示，全长2151bp，该基因从KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库中的Sulfolobus tokodaii基因组中筛选获得，其代码为：ORF ST0928。

所述耐高温异淀粉酶的制备方法，包括以下步骤：

（1）基因克隆，通过设计引物，应用PCR技术扩增或人工合成方法得到包含异淀粉酶基因全长序列；具体步骤如下：

A．设计引物，以KEGG数据库公布的Sulfolobus tokodaii基因组中的序列片段ORF ST0928和市售pET20b (+)载体为模板，使用Primer Premier 5.0软件设计引物如下：

IF：5’ ACTTT AAGAA GGAGA TATAC ATatg gtttt ttcac acaag gatag accat 3’，

IR：5’ TCAGT GGTGG TGGTG GTGGT Gatat tcaat cctcc tatat accat tgcgg 3’；

VF：5’ ccgca atggt atata ggagg attga atatC ACCAC CACCA CCACC ACTGA 3′，

VR：5’ atggt ctatc cttgt gtgaa aaaac catAT GTATA TCTCC TTCTT AAAGT 3’。

其中其中IF和IR的5’端大写碱基属于pET20b (+)载体上的序列，3’端小写碱基属于插入基因ORF ST0928上序列；VF和VR的5’端小写碱基属于插入基因ORF ST0928上序列，3’端大写碱基属于pET20b (+)载体上序列， IF与VR反向互补，IR与VF反向互补。

B．以Sulfolobus tokodaii基因组为模板，步骤A所设计IR、IF序列为引物进行PCR扩增，

反应体系为：高保真DNA聚合酶（按说明书用量，0.02U/μL）；dNTP各 200μM；引物各0.5μM；模板0.05ng/μL。

扩增条件为：98℃预变性30s，25个循环 (98℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸)，最后一步72℃延伸10 min。

取3μL扩增产物使用0.8%的琼脂糖凝胶纯化，纯化产物送华大基因进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物所得基因序列与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列相同，即ORF ST0928序列。

用PCR产物回收试剂盒回收PCR扩增产物，对回收产物用紫外分光光度计进行含量测定，备用。

（2）载体构建，构建过程参考图2所示，分别以异淀粉酶基因和市售pET20b (+)载体上的序列为模板，采用文献You等（DNA Cloning and Assembly Methods，Humana Press，2014，183-192）提供的简单克隆方法，进行重叠延伸PCR得到重组表达质粒；具体步骤如下：

C．以市售pET20b (+)载体为模板，步骤A所设计VR、VF序列为引物进行PCR扩增，

反应体系：高保真DNA聚合酶（按说明书用量，0.02U/μL）；dNTP各 200μM；引物各0.5μM；模板0.05ng/μL；1×GC buffer。

扩增条件为：98℃预变性30s，30个循环 (98℃变性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸3kb/min)，最后一步72℃延伸5 min。

扩增产物纯化、测序，得到如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，即ORF ST0928序列，使用PCR产物回收试剂盒进行回收，最后使用紫外分光光度计进行含量测定，备用。

D．重叠延伸PCR得到重组表达质粒，

具体为，按照文献You et al. 2014提供的方法，将步骤（1）中PCR扩增回收得到的ORF ST0928序列产物与步骤C中PCR扩增回收产物混合，进行重叠延伸PCR。

混合反应体系设置如下：5倍的GC缓冲液，10μL；dNTP（各 10μM），1μL；DNA载体片段（步骤C所回收产物），4 ng/μL（16μL）；插入片段（步骤1所回收产物），4 ng/μL（5μL）；水添加到49.5μL，高保真DNA聚合酶，0.5μL（1.0单位/50μL）。

反应条件为：98℃预变性30 s；30个循环（98℃变性15 s，55℃退火10 s，72℃延伸）最后一步72℃延伸10min。

取3μL的PCR产物，使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果与预期相符。

E．转化大肠杆菌E. coli DH5α，得重组质粒pET20b-StIA，具体为：将步骤D中PCR扩增产物回收纯化，转化大肠杆菌E. coli DH5α，得重组质粒pET20b-StIA。

具体为：取2~5μL的步骤D的重叠延伸PCR产物，和100μL E. coli细胞添加到一个1.5mL的离心管中，冰上放置5min，42℃热激90s，再冰上放置5min。添加1mL的SOC培养基，37℃下孵育30min，5000rpm离心5min，弃去1mL上清，将余下的液体充分悬浮，并涂布到LB固体培养基平板上，37℃培养12~16h，挑出白色的阳性重组子。

对所挑取阳性重组子采用质粒提取试剂盒进行提取，备用。

对所提取质粒用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检验，并采用紫外分光光度计进行含量测定。

（3）异淀粉酶表达与纯化，将（2）中所得重组质粒pET20b-StIA转入E. coli Rosetta (DE3)中，挑选阳性重组子培养，IPTG诱导表达，收获细胞，超声破碎后，使用镍柱将带有His标签的异淀粉酶纯化出来，具体步骤如下：

F．将重组质粒pET20b-StIA转入E. coli Rosetta (DE3)细胞中，取2~5μL的步骤（2）所制备的质粒纯化产物，和100μL E. coli细胞添加到一个1.5mL的离心管中，冰上放置5min，42℃热激90s，再冰上放置5min。添加1mL的SOC培养基，37℃下孵育30min，5000rpm离心5min，弃去1mL上清，将余下的液体充分悬浮，并涂布到LB固体培养基平板上，37℃培养12~16h，挑出白色的阳性重组子。

G．IPTG诱导表达，将步骤F所挑选阳性重组子37℃于LB培养基中培养，待吸光值A₆₀₀达到0.6时，使用0.05 M IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）16℃诱导16 h。

H．细胞破碎，纯化，

将诱导表达结束后细胞培养液4℃离心收集细胞，并用结合缓冲溶液(10 mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O，10mmol/L NaH₂PO₄·2H₂O，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑2)，在冰上进行超声破碎，离心，上清液用0.22μm的滤膜过滤。

用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡l mL的His Trap FF crude柱子，取60 mL的样品上样，用20倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白质，分别用100、300、500 mmol/L咪唑的缓冲液来洗脱蛋白质。每个浓度梯度用10倍的柱体积洗脱，收集洗脱峰后，SDS-PAGE鉴定纯化结果。

结果表明，目的蛋白即耐高温异淀粉酶在大肠杆菌中能够进行较好的可溶性表达，并且具有耐高温特性。对洗脱收集蛋白电泳检测结果如图3所示，从图3中可以看出，纯化后所得的目的蛋白即耐高温异淀粉酶分子量约83kDa。测序结果表明，其氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示序列相同。

对于所制备的耐高温异淀粉酶进行酶活检测，检测方法参照（Zhang and Lynd，Biomacromolecules，2005，6，1510-1515）文献公布的方法进行测定。

对于耐高温异淀粉酶反应条件优化：

反应最适pH： 350μL 0.5%的支链淀粉溶液，100μL乙酸盐（pH3.5-6.0）或磷酸盐（pH5.0-8.0）缓冲液，50μL的75μg/mL的酶液，80℃反应30分钟；

反应最适温度：选用40 mM 乙酸缓冲液 (pH 5.5)，其他成分不变，分别在40~90℃条件下反应30min，测酶活；

同样在40 mM 乙酸缓冲液 (pH 5.5) 反应条件下，添加最适金属离子浓度分别为0.5 mM的CuCl₂、 FeCl₃、ZnCl₂、 CaCl₂、MgCl₂、CoCl₂、NiCl₂、MnCl₂和EDTA，80℃反应30 min，测定酶活。

结果表明：最优反应条件为：40 mM 乙酸缓冲液 (pH 5.5)，85℃，添加0.5 mM MgCl₂。

在最优反应条件下，一个国际酶活单位（IU）定义为1分钟转化1微摩尔还原端数量的酶量。

本发明所提供耐高温异淀粉酶活的测定在500μL反应体系中完成，该体系包括：350μL 0.5% (质量/体积) 支链淀粉溶液，包含5 mM的MgCl₂的100μL 0.2 M 醋酸盐缓冲液(pH 5.5)，和50μL 酶液(75g/mL)。

反应液80℃反应30min，由异淀粉酶催化所产生的还原端按照（Zhang and Lynd，Biomacromolecules，2005，6，1510-1515）文献公布的方法进行测定。

结果表明：本发明所提供耐高温异淀粉酶在80℃条件下国际酶活单位为6.4 IU/mg。

实施例2

由于本发明主要目的在于将所制备的耐高温异淀粉酶用于生物燃料电池中，因而本实施例对于耐高温异淀粉酶的具体应用简要介绍如下。

本实施例中所采用的生物燃料电池在已发表文献方法(Zhu et al. Nat. Commun.，2014，5，3026)基础上改进，结构原理如图4所示。

本实施例所设计的酶生物燃料电池为单极室无隔膜类型，结构包括：反应容器、离子交换膜和反应物；

所述反应物包括：淀粉、耐高温异淀粉酶、α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、二氢硫辛酸脱氢酶、HEPES缓冲液、NaCl、NAD⁺、 Mg²⁺、Mn²⁺和电子穿梭体(AQDS)。

具体实物结构如图5所示，包括：玻璃容器 (1×1×4.5 cm)一侧设有0.5×1.5 cm的小窗口，窗口上使用胶将全氟离子膜封严作为酶生物燃料电池的负极 (1.8×2 cm; from Fuel Cell Earth Woburn, MA, USA)；另外将1×1 cm 宽带碳纸 (购自美国Fuel Cell Earth Woburn公司) 插入容器的反应液内作为正极。

反应物配方参考实施例1中的耐高温异淀粉酶最优反应条件设置，具体配方为：

0.012%异淀粉酶（质量体积比）、7U α-葡聚糖磷酸化酶（αGP）、3U 磷酸葡萄糖变位酶（PGM）、1.5U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）、5.4 U二氢硫辛酸脱氢酶（DI）、50 mM pH 7.2 的HEPES缓冲液、0.3 M NaCl、4 mM NAD⁺、5 mM Mg²⁺、0.25 mM Mn²⁺、1.7 mM 电子穿梭体(AQDS)。

对本实施例中的酶生物燃料电池（糖燃料电池）的功率测定采用如下方法：测定在室温下进行，测试设备为1000B Multi-Potentiostat 设备(CH Instruments Inc., Austin, TX, USA)，为保障数据稳定性，每个数据测试两次。

测试中，线性扫描伏安法测试中，待测量到糖电池的开路电位10min后，按照5 mVs^-1的速率进行扫描；循环伏安法测试中，测试前将阳极溶液充入氮气20 min，确保消除其中的溶解氧，扫描率为2 mVs^-1。

实验测定结果表明：普通淀粉燃料电池在不添加异淀粉酶时，在0.14V的电压下，能量密度可以达到2.2 μW/cm²，使用耐高温异淀粉酶处理后淀粉能量密度最高达4.1 μW/cm²，几乎是普通淀粉的2倍；同时，短接电流增加到0.042 mA，开路电压增加到0.31 V，因而具有较好的推广应用潜力。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 耐高温异淀粉酶基因的克隆、表达及应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2151

<212> DNA

<213> Sulfolobus tokodaii

<400> 1

atggtttttt cacacaagga tagaccatta agaccaggag agccatatcc tcttggagct 60

aattgggaag aagaagatga tggtgtgaac ttctctatct tttcggaaaa tgcgactaag 120

gttgaacttt taatttactc ccctactaat cagaaatatc ctaaagaagt tatcgaggtt 180

aagcagagat ctggtgatat ttggcacgtc tttgtcccag gtttgggacc gggtacactt 240

tacgcatata gaatttatgg tccttataag ccagatcaag gtttaagatt taatcctaat 300

aaggttctaa ttgatcctta tgctaaggct ataaatggga cattaaactg gaatgatgct 360

gtttttggtt ataagatagg cgattctaac caggatttgt cctttgatga taggccagat 420

gatgaattta ttcctaaggg tgttgttatt aatccttatt ttgagtggga tgatgatcac 480

ttttttagga gaaagaagat accattaaag gatactatta tttatgaagt tcatgttaaa 540

ggttttacta aattaagacc tgatttacca gaaaatatta gaggtactta taaaggattt 600

gcctctagac agatgatcga atatttgaaa gatttggggg taactacagt cgagataatg 660

ccagtacagc agtttgttga tgataggttt ctagtagaga agggattaag gaattactgg 720

ggatataatc ccataaatta tttttcacct gaatgtagat attcctcttc tggctgtatg 780

ggtgaacaag ttaacgagtt taaggagatg gttaatgagc tgcacaacgc tggcttcgag 840

gtaattattg atgttgttta taaccatact gcggaaggga atcatttagg tcctactctt 900

tcattcagag gtatagataa tttggcttat tacatgttag ttccagataa taagagatat 960

tatttagact ttactggaac tggaaacacc ttaaatctga gtcatccgag ggtattgcaa 1020

atggttctgg atagtcttag atattgggtt ttagagatgc atgttgacgg ttttaggttt 1080

gatttagctg ctgccctagc tagacaatta tacagtgtaa atatgctttc aactttcttt 1140

gttgcaattc agcaagatcc cgttctttct caagttaagt taatagcgga accttgggat 1200

gttggtccag ggggatatca ggttggtaat tttccatatt tgtgggccga atggaacggt 1260

aagtatagag atactataag gagattttgg agaggtgagg cgatccccta tgaggagttg 1320

gctaataggc ttatgggttc tccagattta tatgctggaa ataataagac tcctttcgct 1380

agtataaatt atataacttc tcatgatggt tttactttag aggatttagt tagttataat 1440

caaaagcata atgaagctaa cggttttaat aatcaagatg gcatgaacga gaattatagt 1500

tggaattgtg gagttgaggg agagactaat gatgctaatg ttattcaatg tagagagaaa 1560

caaaaaagga attttatcat aacacttttt gtaagtcaag gggttccaat gattttaggt 1620

ggcgatgagc taagtagaac acaaagagga aataacaatg ctttttgcca agataacgaa 1680

ataagttggt ttaattggaa tcttgatgag aggaaacaga ggtttcatga ttttgttagg 1740

agtatgattt atttctatag agctcatcca atatttagaa gagaaagata ctttcaaggt 1800

aagaaattac atggtatgcc attaaaggat gtcacttttc taaaaccaga tggaaatgaa 1860

gctgacgaac aaacatggaa gtcaccaact aattttattg catatatttt agagggtagt 1920

gttattgatg aagtaaatga taggggtgag agaatagctg acgattcttt cttaatcatc 1980

cttaatggtt caccaaataa tattaagttc aaattcccgc aaggtaaatg gagtttagtt 2040

gtttcttcat atttgagaga acttagagat gacgagagag ttgttgatgg tggcaaggaa 2100

ctggaaattg agggaaggac cgcaatggta tataggagga ttgaatatta g 2151

<210> 2

<211> 716

<212> PRT

<213> Sulfolobus tokodaii

<400> 2

Met Val Phe Ser His Lys Asp Arg Pro Leu Arg Pro Gly Glu Pro Tyr

1 5 10 15

Pro Leu Gly Ala Asn Trp Glu Glu Glu Asp Asp Gly Val Asn Phe Ser

20 25 30

Ile Phe Ser Glu Asn Ala Thr Lys Val Glu Leu Leu Ile Tyr Ser Pro

35 40 45

Thr Asn Gln Lys Tyr Pro Lys Glu Val Ile Glu Val Lys Gln Arg Ser

50 55 60

Gly Asp Ile Trp His Val Phe Val Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Ala Tyr Arg Ile Tyr Gly Pro Tyr Lys Pro Asp Gln Gly Leu Arg

85 90 95

Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Ile Asp Pro Tyr Ala Lys Ala Ile Asn

100 105 110

Gly Thr Leu Asn Trp Asn Asp Ala Val Phe Gly Tyr Lys Ile Gly Asp

115 120 125

Ser Asn Gln Asp Leu Ser Phe Asp Asp Arg Pro Asp Asp Glu Phe Ile

130 135 140

Pro Lys Gly Val Val Ile Asn Pro Tyr Phe Glu Trp Asp Asp Asp His

145 150 155 160

Phe Phe Arg Arg Lys Lys Ile Pro Leu Lys Asp Thr Ile Ile Tyr Glu

165 170 175

Val His Val Lys Gly Phe Thr Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Glu Asn

180 185 190

Ile Arg Gly Thr Tyr Lys Gly Phe Ala Ser Arg Gln Met Ile Glu Tyr

195 200 205

Leu Lys Asp Leu Gly Val Thr Thr Val Glu Ile Met Pro Val Gln Gln

210 215 220

Phe Val Asp Asp Arg Phe Leu Val Glu Lys Gly Leu Arg Asn Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Tyr Asn Pro Ile Asn Tyr Phe Ser Pro Glu Cys Arg Tyr Ser Ser

245 250 255

Ser Gly Cys Met Gly Glu Gln Val Asn Glu Phe Lys Glu Met Val Asn

260 265 270

Glu Leu His Asn Ala Gly Phe Glu Val Ile Ile Asp Val Val Tyr Asn

275 280 285

His Thr Ala Glu Gly Asn His Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe Arg Gly

290 295 300

Ile Asp Asn Leu Ala Tyr Tyr Met Leu Val Pro Asp Asn Lys Arg Tyr

305 310 315 320

Tyr Leu Asp Phe Thr Gly Thr Gly Asn Thr Leu Asn Leu Ser His Pro

325 330 335

Arg Val Leu Gln Met Val Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val Leu Glu

340 345 350

Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ala Ala Leu Ala Arg

355 360 365

Gln Leu Tyr Ser Val Asn Met Leu Ser Thr Phe Phe Val Ala Ile Gln

370 375 380

Gln Asp Pro Val Leu Ser Gln Val Lys Leu Ile Ala Glu Pro Trp Asp

385 390 395 400

Val Gly Pro Gly Gly Tyr Gln Val Gly Asn Phe Pro Tyr Leu Trp Ala

405 410 415

Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Thr Ile Arg Arg Phe Trp Arg Gly

420 425 430

Glu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Leu Ala Asn Arg Leu Met Gly Ser Pro

435 440 445

Asp Leu Tyr Ala Gly Asn Asn Lys Thr Pro Phe Ala Ser Ile Asn Tyr

450 455 460

Ile Thr Ser His Asp Gly Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Ser Tyr Asn

465 470 475 480

Gln Lys His Asn Glu Ala Asn Gly Phe Asn Asn Gln Asp Gly Met Asn

485 490 495

Glu Asn Tyr Ser Trp Asn Cys Gly Val Glu Gly Glu Thr Asn Asp Ala

500 505 510

Asn Val Ile Gln Cys Arg Glu Lys Gln Lys Arg Asn Phe Ile Ile Thr

515 520 525

Leu Phe Val Ser Gln Gly Val Pro Met Ile Leu Gly Gly Asp Glu Leu

530 535 540

Ser Arg Thr Gln Arg Gly Asn Asn Asn Ala Phe Cys Gln Asp Asn Glu

545 550 555 560

Ile Ser Trp Phe Asn Trp Asn Leu Asp Glu Arg Lys Gln Arg Phe His

565 570 575

Asp Phe Val Arg Ser Met Ile Tyr Phe Tyr Arg Ala His Pro Ile Phe

580 585 590

Arg Arg Glu Arg Tyr Phe Gln Gly Lys Lys Leu His Gly Met Pro Leu

595 600 605

Lys Asp Val Thr Phe Leu Lys Pro Asp Gly Asn Glu Ala Asp Glu Gln

610 615 620

Thr Trp Lys Ser Pro Thr Asn Phe Ile Ala Tyr Ile Leu Glu Gly Ser

625 630 635 640

Val Ile Asp Glu Val Asn Asp Arg Gly Glu Arg Ile Ala Asp Asp Ser

645 650 655

Phe Leu Ile Ile Leu Asn Gly Ser Pro Asn Asn Ile Lys Phe Lys Phe

660 665 670

Pro Gln Gly Lys Trp Ser Leu Val Val Ser Ser Tyr Leu Arg Glu Leu

675 680 685

Arg Asp Asp Glu Arg Val Val Asp Gly Gly Lys Glu Leu Glu Ile Glu

690 695 700

Gly Arg Thr Ala Met Val Tyr Arg Arg Ile Glu Tyr

705 710 715

Claims

1.一种耐高温异淀粉酶基因，其特征在于，该淀粉酶DNA序列如SEQ ID NO.1所示，全长2151bp。

2.权利要求1所述耐高温异淀粉酶基因所编码的耐高温异淀粉酶，其特征在于，该耐高温异淀粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括716个氨基酸，分子量为83.1KDa，其中编码序列17~108氨基酸为第48家族的碳水化合物结合模序；编码序列204~545氨基酸为淀粉酶催化结构域；编码序列546~716为未知功能多肽。

3.如权利要求2所述的耐高温异淀粉酶，其特征在于，以500μL反应体系为例，该酶最适反应条件为：40 mM pH 5.的5乙酸缓冲液，0.5 mM MgCl₂，85℃催化反应。

4.权利要求2所述耐高温异淀粉酶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

引物序列设计如下：

IF：5’ ACTTT AAGAA GGAGA TATAC ATatg gtttt ttcac acaag gatag accat 3’，

IR：5’ TCAGT GGTGG TGGTG GTGGT Gatat tcaat cctcc tatat accat tgcgg 3’；

VF：5’ ccgca atggt atata ggagg attga atatC ACCAC CACCA CCACC ACTGA 3′，

VR：5’ atggt ctatc cttgt gtgaa aaaac catAT GTATA TCTCC TTCTT AAAGT 3’；

其中IF和IR的5’端大写碱基属于pET20b (+)载体上的序列，3’端小写碱基属于插入基因ORF ST0928上的序列；VF和VR的5’端小写碱基属于插入基因ORF ST0928上的序列，3’端大写碱基属于pET20b (+)载体上的序列， IF与VR反向互补，IR与VF反向互补；

（2）载体构建，分别以异淀粉酶基因和pET20b (+)载体上的序列为模板，采用现有文献提供的简单克隆方法，进行重叠延伸PCR得到重组表达质粒；

（3）异淀粉酶表达与纯化，将重组表达质粒转入E. coli Rosetta中，挑选阳性重组子培养，IPTG诱导表达，收获细胞，超声破碎后，使用镍柱将带有His标签的异淀粉酶纯化出来。

5.权利要求2所述耐高温异淀粉酶在酶生物燃料电池中的应用，其特征在于，所述酶生物燃料电池为单极室无隔膜类型，结构包括：反应容器、离子交换膜和反应物。

6.如权利要求5所述耐高温异淀粉酶在酶生物燃料电池中的应用，其特征在于，所述反应物包括：淀粉、耐高温异淀粉酶、α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、二氢硫辛酸脱氢酶、HEPES缓冲液、NaCl、NAD⁺、 Mg²⁺、Mn²⁺和电子穿梭体。

7.如权利要求6所述耐高温异淀粉酶在酶生物燃料电池中的应用，其特征在于，各物料具体配比为：质量体积比为0.012%耐高温异淀粉酶、7U α-葡聚糖磷酸化酶、3U 磷酸葡萄糖变位酶、1.5U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、5.4 U二氢硫辛酸脱氢酶、50 mM pH 7.2 的HEPES缓冲液、0.3 M NaCl、4 mM NAD⁺、5 mM Mg²⁺、0.25 mM Mn²⁺、1.7 mM 电子穿梭体。