CN104977341A - 石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳复合材料固定蛋白修饰电极及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种石墨烯(GR)-类水滑石片(LDH)-石墨相氮化碳(g-C3N4)复合材料固定蛋白修饰电极及其制备方法和应用。先将剥离类水滑石片与带负电的剥离氧化石墨烯纳米片复合，再与三聚氰胺混合焙烧后加水复原，制备GR-LDH-g-C3N4杂化物；采用滴涂法将GR-LDH-g-C3N4与Hb的混合液滴在离子液体修饰碳糊电极上，制备了GR-LDH-g-C3N4复合材料固定蛋白修饰电极。本发明充分发挥了凝胶法与整合合并分层法的优势，增大了杂化材料的比表面积，导电性与生物相容性，抑制了GR片层的重新堆叠；焙烧法将g-C3N4生长在GR片层表面，再次增大了杂化材料的比表面积，提高了电化学反应过程的电子传递速率。构筑的基于CTS/GR-LDH-g-C3N4-Hb复合膜的第三代三氯乙酸传感器，具有检测限低，检测范围宽和米氏常数小等优点。
Description
技术领域：
本发明涉及一种石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳复合材料固定蛋白修饰电极；本发明还涉及所述修饰电极的制备方法及其在电化学传感检测方面的应用。
背景技术：
生物传感器是结合生物或者生物衍生物的敏感元件与理化换能器的一类分析装置，可根据分析物的浓度产生间断或连续的信号，并且信号强弱与浓度成正比[张先恩，生物传感器[M],北京:化学工业出版社,2006,16-40.]。其中，酶电化学传感器在近年来引起了极大的关注。牛血红蛋白酶(Hb)结构简单且具有代表性，易于实现大规模生产，因此被作为直接电化学的理想模型，同时，对于Hb直接电子转移的研究还可以促进人们对生物体电子转移机理的理解。然而，Hb的活性中心埋藏较深，在电极表面很难发生直接电化学，并且直接吸附在裸电极表面的Hb容易发生脱落变性。因此，寻找能保持酶活性并促进直接电子传递的材料，已成为生物电化学传感领域研究的重要课题。
石墨烯纳米片是一种性能卓越的二维纳米材料，具有良好的导电性，较大的比表面积以及优异的机械性能，近年来广泛用于电化学领域的相关工作[K.S.Novoselov,A.K.Geim,S.V.Morozov,D.Jiang,Y.Zhang,S.V.Dubonos,I.V.Grigorieva,A.A.Firsov,Electric field effect in atomically thin carbon films.Science,2004,306:666～669.]。然而，现今广泛采用的化学还原法制备的还原氧化石墨烯(GR)的固有电化学性能却受到了很大限制，这是因为在还原过程中，石墨烯片层间容易发生不可逆堆叠和重新聚集，这不仅增大了各片层间的接触电阻，还极大的限制了石墨烯的电化学在各个领域的潜在应用[X.C.Dong,H.Xu,X.W.Wang.3D graphene-cobalt oxide electrode for high-performance supercapacitor and enzymeless glucose detection.ACS nano,2012,6:3206～3213.]。研究发现，通过将其他纳米材料层层嵌插在GR片层间可以有效解决这种片层堆叠问题。Wimalasiri等人将剥离后的NiAl水滑石整合到GR片层间，制备了一种GR-ELDH二元杂化物并在超级电容器方面显示出卓越的性能[Y.Wimalasiri,R.Fan,X.S.Zhao.Assembly of Ni-Al layered double hydroxide and graphene electrodes for supercapacitors.Electrochimica Acta,2014,134:127～135.]。同时，近年来为了解决 GR片层的不可逆堆叠现象，越来越多的努力也倾向于通过凝胶法制备三维的均相石墨烯分散体系。这种凝胶化的方法可以快速的整合二维的GR片层，形成一种三维立体的结构，这极大的促进了高性能的GR在各个领域内的实际应用[C.Li,G.Q.Shi.Functional gels based on chemically modified graphenes.Adv.Mater.,2014.26(24):3992～4012.]。
类水滑石(LDH)是一类新颖的二维层状纳米材料，因其片层携带正电荷，近年来被广泛用于固定带负电荷的生物分子制备相应的纳米杂化物[詹天荣，侯万国.层状双金属氢氧化物在绿色材料领域中的应用.化学通报，2010，73(7)：608～615.]。另外，相比于其他无机基体，LDH拥有多功能的物理和化学性能，例如广泛的化学成分，可调的结构特性以及制备变量，这些固有的优异性能使得LDH成为一种有效的主体结构来固定生物分子。大量的基于LDH的电化学生物传感器已经被成功开发并显示出非凡的催化性能，如极高的灵敏度以及低的米氏常数[X.Chen,C.L.Fu,Y.Wang.Direct electrochemistry and electrocatalysis based on a film of horseradish peroxidase intercalated into Ni-Al layered double hydroxide nanosheets.Biosensors and Bioelectronics,2008,24:356～361]。剥离的类水滑石纳米片(ELDH)是指由LDH剥离成单片的胶体，具有更大的比表面积以及超好的分散性能，而且其片层上带有正电荷，这些性质非常有利于带负电荷的GO片层通过静电吸引进行复合，将两种不同的纳米片互相嵌插在各自的层间。
石墨相氮化碳(g-C3N4)具有一种类似石墨的结构，因具有大的面内总氮量，特殊的电子结构等优势，因而在多功能催化以及其他的能量转化过程中得到很好的应用。但是，由于g-C3N4固有的低导电性以及小比表面积等缺陷，严重限制了其在电化学方面的应用。研究发现，将g-C3N4与GR片层结合，可以有效的改善复合材料的电化学性能。Gu等人通过焙烧法在GR片层表面生成g-C3N4并构建了多种电化学生物传感体系，实验结果表明，适宜量的g-C3N4的存在可以极大的提高杂化材料的电化学性能[H.Gu,T.S.Zhou,G.Y.Shi.Synthesis of graphene supported graphene-like C3N4metal-free layered nanosheets for enhanced electrochemical performance and their biosensing for biomolecules,2015,132:871～876]。
为了解决以上三种层状材料单独使用时存在的缺陷，本发明首先通过整合合并分层法以及凝胶法制备石墨烯-剥离类水滑石片(GR-ELDH)杂化物，将其与三聚氰胺混合焙烧后加水复原，得到石墨烯-水滑石-石墨相氮化碳(GR-ELDH-g-C3N4)纳米杂化物并应用于电化学生物传感器的构建。采用整合合并分层法以及凝胶法制备该三元杂化物，可以将GR、LDH和g-C3N4三种层状材料的优势结合起来，弥补它们的缺点，充分发挥三种组分的协同作用。即带正电的ELDH片层与带负电的GO片层相互嵌插，有效的将GO片层隔离开来； 高温下的凝胶化过程使得GO被还原为GR，由于含氧的亲水基团的移去，产生的共轭结构域和疏水面使得GR形成一种三维的多孔渗水结构，从而再次阻止了GR片层的重新堆叠；焙烧过程使得g-C3N4均匀的生长在GR片层表面，这既增大了GR的比表面积，又有效的改善了复合材料的导电性；之后的水分散过程使LDH重新复原，确保了复合材料的生物相容性。本文提出的GR-ELDH-g-C3N4三元复合材料充分发挥了整合合并分层法，凝胶法，焙烧复原法的优势，为复合修饰电极提供了更多的活性位点，更高的导电性，更好的生物相容性和分散性以及对酶的固定能力，从而提高生物分子在修饰电极上的直接电化学电催化性能，对建立新型的高灵敏电化学检测方法具有重要意义。
发明内容：
针对现有技术的不足以及本领域研究和应用的需求，本发明的目的之一是提供一种石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳复合材料固定蛋白修饰电极；即通过整合合并分层以及凝胶化过程将GO纳米片与ELDH纳米片层复合，然后再与三聚氰胺混合焙烧后加水复原制备GR-ELDH-g-C3N4复合物，最后用于蛋白质的固定和相应修饰电极的制备。
本发明提供的一种石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳复合材料固定蛋白修饰电极，其特征在于它包括基底电极层和石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳杂化材料固定蛋白层；所述石墨烯-剥离类水滑石片-石墨相氮化碳复合材料是综合利用凝胶法和整合合并分层法将剥离类水滑石片与剥离氧化石墨烯片复合，与三聚氰胺混合焙烧后加水还原后制得；蛋白质溶液与石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳溶液混合形成复合蛋白层；其中石墨烯记为GR，类水滑石片记为LDH，石墨相氮化碳记为g-C3N4；
所述石墨烯-类水滑石片复合材料固定蛋白修饰电极，其特征在于所述类水滑石片为钴铝型；所述蛋白质为牛血红蛋白，记为Hb；所述基底电极为离子液体修饰碳糊电极，记为CILE；
本发明目的之二是提供石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳杂化材料固定蛋白修饰电极的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤：
(a)ELDH的制备
将二价金属盐CoCl2·6H2O、三价金属盐AlCl3·6H2O和尿素按一定摩尔比加入到装有一定体积去离子水的圆底烧瓶中，总金属离子浓度为0.15mol/L，60～98℃搅拌回流10～36小时，反应完毕后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤3～5次，室温下干燥48小时，得到碳酸根插层的LDH；
称取一定量碳酸根插层的LDH，将其分散于浓度分别为1mol/L的NaCl和3.3mmol/L的HCl混合水溶液中，N2气氛下搅拌12小时，抽滤后室温干燥12 小时，得到氯离子插层的LDH；
称取一定量氯离子插层的LDH，将其分散于浓度为0.1mol/L的NaNO3的水溶液中，N2气氛下搅拌12小时，抽滤后室温干燥12小时，得到硝酸根插层的LDH；
称取一定量硝酸根插层的LDH分散于甲酰胺中，使其浓度为1mg/mL，N2气氛下搅拌24小时，将该混合液在2000rpm条件下离心10min，弃去沉淀以除去未剥离的产物，得到的澄清液即为剥离产物ELDH胶体；
(b)GR-ELDH水凝胶的制备
采用hummer法制备氧化石墨烯，记为GO，并将一定量的GO分散于甲酰胺中，使其浓度为1mg/mL，超声分散1小时，3000rpm离心10min除去未剥离的GO，得到剥离的GO分散液；将该GO分散液与(a)中所得等体积的ELDH胶体溶液充分混合，室温密闭条件下搅拌12小时，5000rpm离心10min后，所得棕黑色沉淀重新分散于去离子水中，使其含GO的浓度为6mg/mL。取一定量该混合溶液封入25mL反应釜中，160℃下反应6小时后自然冷却至室温，得到GR-ELDH水凝胶，冻干保存；
(c)GR-LDH-g-C3N4杂化材料的制备
称取50mg(b)中所得GR-ELDH凝胶与一定量三聚氰胺充分混合，氮气气氛下于600℃下焙烧3h，反应完毕后将产物分散到水中，得到GR-LDH-g-C3N4杂化物；
(d)CILE的制备
将石墨粉与离子液体(BPPF6)以2:1的质量比加入研钵中，加热到80℃条件下均匀混合，向该粉末状混合物中滴加1mL液体石蜡作为粘合剂，再将混合物充分研磨好后填入玻璃管中，管内插入铜丝作为导线，将玻璃管中的固体混合物压实，得到CILE，使用前将该电极表面打磨光滑；
(e)GR-LDH-g-C3N4复合材料固定蛋白修饰电极的制备
将步骤(c)中得到的GR-LDH-g-C3N4杂化材料用去离子水配制成浓度为0.5mg/mL的浆状液并与浓度为10mg/mL的Hb充分混合；取16μL该混合溶液滴涂在步骤(d)中所得的CILE表面，自然晾干后再在电极上滴涂6μL浓度为1.0mg/mL的壳聚糖醋酸CTS溶液，自然干燥后得到CTS/GR-LDH-g-C3N4-Hb/CILE生物修饰电极。
其中步骤(a)中所述二价金属盐CoCl2·6H2O、三价金属盐AlCl3·6H2O和尿素的摩尔比为2：1：7；一定体积的去离子水为400mL；称取的碳酸根插层的LDH和氯离子插层的LDH量均为配制浓度为1mg/mL悬浮液所需要的质量；步骤(b)混合溶液的体积为12mL；步骤(b)所得的GR-ELDH杂化材料由单层的GR和单层的ELDH复合而成，其厚度约为0.85-1nm；步骤(c)中三聚氰胺的用量为130mg。
本发明目的之三是提供一种石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳复合材料固定蛋白修饰电极在制备电化学传感器方面的应用。
具体地，所述石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳复合材料固定蛋白修饰电极在三氯乙酸检测方面的应用。
本发明本发明综合利用凝胶法和整合合并分层法，将带正电的剥离类水滑石片(ELDH)与带负电的剥离GO纳米片复合，再与三聚氰胺混合焙烧后加水复原，制备GR-LDH-g-C3N4杂化物；采用滴涂法将GR-LDH-g-C3N4与Hb的混合溶液滴在CILE上，自然干燥后再涂一层壳聚糖，制备石墨烯-类水滑石片-石墨型氮化碳复合材料固定蛋白修饰电极。本发明充分发挥凝胶法与整合合并分层法的优势，增大了杂化材料的比表面积，导电性与生物相容性，抑制了GR片层的重新堆叠；焙烧法将g-C3N4生长在GR片层表面，再次增大了杂化材料的比表面积与导电性，提高了电化学反应过程的电子传递速率；本发明构筑的基于CTS/GR-LDH-g-C3N4-Hb/CILE的第三代三氯乙酸(TCA)传感器，具有检测限低，检测范围宽和米氏常数小等优点。
本发明与现有技术相比，主要优点在于：综合利用整合合并分层法与凝胶法的优势制备GR-ELDH杂化物，再与三聚氰胺混合焙烧并加水复原得到GR-LDH-g-C3N4纳米杂化物；采用滴涂法将GR-LDH-g-C3N4、血红蛋白和壳聚糖固定在CILE上，制备石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳复合材料固定蛋白修饰电极；本发明所构建的复合修饰电极在提高血红蛋白直接电化学和电催化性能方面发挥了整合合并分层法与凝胶法的协同效应：通过静电吸引将ELDH与GO片层整合合并，增加了复合材料导电性，抑制了ELDH的聚集与石墨烯片层的重新堆叠；凝胶化过程使GO被还原为GR，产物呈现三维的多孔渗水结构，再次阻止了石墨烯片层间的重新堆叠，极大的减弱了片层间的接触电阻同时又增大了复合材料的比表面积；g-C3N4引入GR-ELDH后，再次增大了复合材料的比表面积与导电性，有效提高了复合材料的电子转移速率；具体的，对血红蛋白直接电传递的作用产生了意料不到的技术效果，本发明所得复合修饰电极对血红蛋白直接电子传递作用明显高于作为对比的二元修饰电极。本发明方法操作简单、条件温和、制备成本低。
附图说明：
图1为Hb(a)和实施例1所得负载有Hb的复合材料GR-LDH-g-C3N4(b)的IR光谱图。
图2为实施例4所得GR-ELDH凝胶(a)以及GR-LDH-g-C3N4(b)杂化物的扫描电子显微镜照片。
图3为实施例4(e)与对比例4(a)、对比例1(b)、对比例3(c)以及对比例2(d)所得修饰电极在pH＝4的B-R缓冲溶液中、扫速为0.1V/s时的循环伏安图。
图4为实施例4(e)、对比例4(a)、对比例1(b)、对比例3(c)以及对比例2(d)所得修饰电极在含有10.0mmol/L[Fe(CN)6]-3/-4和0.1mol/L KCl溶液中的电化学阻抗图。
图5为由实施例5所得的CTS/GR-LDH-g-C3N4-Hb/CILE在氮气保护下，在pH＝4的B-R缓冲溶液中加入不同体积的三氯乙酸的循环伏安曲线，扫速为100mV/s，插图为还原峰电流与三氯乙酸浓度的线性关系。
图6为由实施例5中对比例1所获得的CTS/GR-LDH-Hb/CILE在氮气保护下，在pH＝4的B-R缓冲溶液中加入不同体积的三氯乙酸的循环伏安曲线，扫速为100mV/s，插图为还原峰电流与三氯乙酸浓度的线性关系。
图7为由实施例5中对比例2所获得的CTS/GR-g-C3N4-Hb/CILE在氮气保护下，在pH＝4的B-R缓冲溶液中加入不同体积的三氯乙酸的循环伏安曲线，扫速为100mV/s，插图为还原峰电流与三氯乙酸浓度的线性关系。
图8为由实施例5中对比例3所获得的CTS/LDH-g-C3N4-Hb/CILE在氮气保护下，在pH＝4的B-R缓冲溶液中加入不同体积的三氯乙酸的循环伏安曲线，扫速为100mV/s，插图为还原峰电流与三氯乙酸浓度的线性关系。
具体实施方式：
为进一步理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但并不以任何方式限制本发明。
实施例1：
(a)ELDH的制备
将二价金属盐CoCl2·6H2O、三价金属盐AlCl3·6H2O和尿素按摩尔比2：1：7的比例加入到装有一定体积去离子水的圆底烧瓶中，总金属离子浓度为0.15mol/L，85℃搅拌回流18小时，反应完毕后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤3～5次，室温下干燥48小时，得到碳酸根插层的LDH；称取100mg碳酸根插层的LDH，将其分散于浓度分别为1mol/L的NaCl和3.3mmol/L的HCl混合水溶液中，N2气氛下搅拌12小时，抽滤后室温干燥12小时，得到氯离子插层的LDH；称取60mg氯离子插层的LDH，将其分散于60mL浓度为0.1mol/L的NaNO3的水溶液中，N2气氛下搅拌12小时，抽滤后室温干燥12小时，得到硝酸根插层的LDH；称取50mg硝酸根插层的LDH分散于甲酰胺中，使其浓度为1mg/mL，N2气氛下搅拌24小时，将该混合液在2000rpm条件下离心10min，弃去沉淀以除去未剥离的产物，得到的澄清液即为剥离产物ELDH胶体。
(b)GR-ELDH水凝胶的制备
采用hummer法制备氧化石墨烯，记为GO，并将50mg GO分散于甲酰胺中，使其浓度为1mg/mL，超声分散1小时，3000rpm离心10min除去未剥离的GO，得到剥离的GO分散液；将该GO分散液与(a)中所得等体积的ELDH胶体溶液充分混合，室温密闭条件下搅拌12小时，5000rpm离心10min后，所得棕黑色沉淀重新分散于去离子水中，使其含GO的浓度为6mg/mL。取一定量该混合溶液封入25mL反应釜中，160℃下反应6小时后自然冷却至室温，得到GR-ELDH水凝胶，冻干保存；
(c)GR-LDH-g-C3N4杂化材料的制备
称取50mg该凝胶与130mg三聚氰胺充分混合，氮气气氛下于600℃下焙烧3h，反应完毕后将产物分散到水中，得到GR-LDH-g-C3N4杂化物
(d)CILE的制备
将石墨粉与离子液体(BPPF6)以2:1的质量比加入研钵中，加热到80℃条件下均匀混合，向该粉末状混合物中滴加1mL液体石蜡作为粘合剂，再将混合物充分研磨好后填入玻璃管中，管内插入铜丝作为导线，将玻璃管中的固体混合物压实，得到CILE，使用前将该电极表面打磨光滑；
(e)GR-LDH-g-C3N4复合材料固定蛋白修饰电极的制备
将步骤(b)中得到的GR-ELDH杂化材料用去离子水配制成浓度为1mg/mL的浆状液，取8μL该浆状液滴涂在步骤(c)中所得的CILE表面，自然晾干后再在电极上滴涂8μL浓度为10mg/mL的Hb水溶液，自然晾干后，继续滴涂6μL浓度为1.0mg/mL的CTS醋酸溶液，自然干燥后得到CTS/GR-ELDH-Hb/CILE三元生物修饰电极。
实施例2：
(a)ELDH的制备
将二价金属盐CoCl2·6H2O、三价金属盐AlCl3·6H2O和尿素按摩尔比2：1：7的比例加入到装有一定体积去离子水的圆底烧瓶中，总金属离子浓度为0.15mol/L，90℃搅拌回流24小时，反应完毕后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤3～5次，室温下干燥48小时，得到碳酸根插层的LDH；称取100mg碳酸根插层的LDH，将其分散于浓度分别为1mol/L的NaCl和3.3mmol/L的HCl混合水溶液中，N2气氛下搅拌12小时，抽滤后室温干燥12小时，得到氯离子插层的LDH；称取60mg氯离子插层的LDH，将其分散于60mL浓度为0.1mol/L的NaNO3的水溶液中，N2气氛下搅拌12小时，抽滤后室温干燥12小时，得到硝酸根插层的LDH；称取50mg硝酸根插层的LDH分散于甲酰胺中，使其浓度为1mg/mL，N2气氛下搅拌24小时，将该混合液在2000rpm条件下离心10min，弃去沉淀以除去未剥离的产物，得到的澄清液即为剥离产物ELDH胶体。
(b)GR-ELDH水凝胶的制备
按照实施例1中步骤(b)中的方法和条件制备
(c)GR-LDH-g-C3N4纳米杂化材料的制备
按时实施例1中步骤(c)中的方法和条件制备
(d)CILE的制备
按时实施例1中步骤(d)中的方法和条件制备
(e)GR-LDH-g-C3N4复合材料固定蛋白修饰电极的制备
按照实施例中步骤(e)中的方法和条件制备得到了CTS/GR-ELDH-Hb/CILE三元生物修饰电极。
实施例3：
(a)ELDH的制备
将二价金属盐CoCl2·6H2O、三价金属盐AlCl3·6H2O和尿素按摩尔比2：1：7的比例加入到装有一定体积去离子水的圆底烧瓶中，总金属离子浓度为0.15mol/L，95℃搅拌回流32小时，反应完毕后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤3～5次，室温下干燥48小时，得到碳酸根插层的LDH；称取100mg碳酸根插层的LDH，将其分散于浓度分别为1mol/L的NaCl和3.3mmol/L的HCl混合水溶液中，N2气氛下搅拌12小时，抽滤后室温干燥12小时，得到氯离子插层的LDH；称取60mg氯离子插层的LDH，将其分散于60mL浓度为0.1mol/L的NaNO3的水溶液中，N2气氛下搅拌12小时，抽滤后室温干燥12小时，得到硝酸根插层的LDH；称取50mg硝酸根插层的LDH分散于甲酰胺中，使其浓度为1mg/mL，N2气氛下搅拌24小时，将该混合液在2000rpm条件下离心10min，弃去沉淀以除去未剥离的产物，得到的澄清液即为剥离产物ELDH胶体。
(b)GR-ELDH水凝胶的制备
按照实施例1中步骤(b)中的方法和条件制备
(c)GR-LDH-g-C3N4纳米杂化材料的制备
按时实施例1中步骤(c)中的方法和条件制备
(d)CILE的制备
按时实施例1中步骤(d)中的方法和条件制备
(e)GR-LDH-g-C3N4复合材料固定蛋白修饰电极的制备
按照实施例中步骤(e)中的方法和条件制备得到了CTS/GR-ELDH-Hb/CILE三元生物修饰电极。
实施例4：
(a)ELDH的制备
将二价金属盐CoCl2·6H2O、三价金属盐AlCl3·6H2O和尿素按摩尔比2：1： 7的比例加入到装有一定体积去离子水的圆底烧瓶中，总金属离子浓度为0.15mol/L，97℃搅拌回流48小时，反应完毕后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤3～5次，室温下干燥48小时，得到碳酸根插层的LDH；称取100mg碳酸根插层的LDH，将其分散于浓度分别为1mol/L的NaCl和3.3mmol/L的HCl混合水溶液中，N2气氛下搅拌12小时，抽滤后室温干燥12小时，得到氯离子插层的LDH；称取60mg氯离子插层的LDH，将其分散于60mL浓度为0.1mol/L的NaNO3的水溶液中，N2气氛下搅拌12小时，抽滤后室温干燥12小时，得到硝酸根插层的LDH；称取50mg硝酸根插层的LDH分散于甲酰胺中，使其浓度为1mg/mL，N2气氛下搅拌24小时，将该混合液在2000rpm条件下离心10min，弃去沉淀以除去未剥离的产物，得到的澄清液即为剥离产物ELDH胶体。
(b)GR-ELDH水凝胶的制备
按照实施例1中步骤(b)中的方法和条件制备
(c)GR-LDH-g-C3N4纳米杂化材料的制备
按时实施例1中步骤(c)中的方法和条件制备
(d)CILE的制备
按时实施例1中步骤(d)中的方法和条件制备
(e)GR-LDH-g-C3N4复合材料固定蛋白修饰电极的制备
按照实施例中步骤(e)中的方法和条件制备得到了CTS/GR-ELDH-Hb/CILE三元生物修饰电极。
对比例1：
参考上述制备修饰电极的方法，直接配制成Hb含量为10μg/μL的修饰液，取8μL滴涂在打磨好的CILE表面，然后再在Hb膜上滴涂浓度为1mg/ml的CTS醋酸溶液6μL，自然干燥后得到CTS/Hb/CILE修饰电极。
对比例2：
参考上述制备修饰电极的方法，制备GR-LDH杂化材料；直接配制GR-LDH含量为0.5mg/mL悬浮液并与浓度为10μg/μL的Hb水溶液充分混合；取16μL该混合溶液滴涂在打磨好的CILE表面，自然晾干后再滴涂浓度为1mg/ml的CTS醋酸溶液6μL，自然干燥后得到CTS/GR-LDH-Hb/CILE二元修饰电极。
对比例3：
参考上述修饰电极的方法，制备GR-g-C3N4杂化材料；配制含GR-g-C3N4浓度为0.5mg/mL的悬浮液并与浓度为10μg/μL的Hb水溶液充分混合；取16μL该混合溶液滴涂在打磨好的CILE表面，自然晾干后再滴涂浓度为1mg/ml的CTS醋酸溶液6μL，自然干燥后得到CTS/GR-g-C3N4-Hb/CILE二元修饰电极。
对比例4：
参考上述修饰电极的方法，制备LDH-g-C3N4杂化材料；配制含LDH-g-C3N4浓度为0.5mg/mL的悬浮液并与浓度为10μg/μL的Hb水溶液充分混合；取16μL该混合溶液滴涂在打磨好的CILE表面，自然晾干后再滴涂浓度为1mg/ml的CTS醋酸溶液6μL，自然干燥后得到CTS/LDH-g-C3N4-Hb/CILE二元修饰电极。
图1是对比例1所得Hb(a)和实施例4所得GR-LDH-g-C3N4-Hb复合材料(b)的IR光谱图。红外光谱法可用于检测蛋白质的二级结构，蛋白质的酰胺I吸收带位于(1700-1600cm-1)区域，这是由蛋白质肽链骨架中肽段连接处的C＝O的伸缩振动引起的；酰胺II吸收带位于(1620-1500cm-1)区域，这是由N-H弯曲以及C-N伸缩振动引起的。如果蛋白质变性，酰胺I和酰胺II两个吸收带会发生显著位移甚至消失。从图中可以看出，GR-LDH-g-C3N4-Hb杂化物的酰胺I和酰胺II吸收带分别位于1648cm-1与1530cm-1处，与游离Hb(1644和1536cm-1)的谱图十分相似，表明Hb在复合膜内基本保持了其天然构象，而酰胺I与酰胺II的轻微位移可以认为是Hb与纳米材料之间存在相互作用，这种作用力可能是氢键或静电相互作用，所以才能很好地形成GR-LDH-g-C3N4-Hb-Hb生物复合材料。
图2为实施例4所得GR-ELDH(a)凝胶以及GR-LDH-g-C3N4(b)杂化物的扫描电子显微镜照片，结果显示GR-ELDH凝胶呈现出典型的3D多孔渗水结构，ELDH片层无序的分布在GR片层表面，这既阻止了GR片层的重新堆叠，又增大了复合材料的导电性与生物相容性；GR-LDH-g-C3N4杂化物呈现明显的分层现象，表明焙烧过程并没有造成GR片层的重新堆叠；LDH变为颗粒状的纳米晶，直径约为10-100nm，这提供了大量的接触位点有利于蛋白质的后续固定；g-C3N4均匀的生长在GR片层表面，有效的增大了复合材料的比表面积与导电性；该GR-LDH-g-C3N4三元复合物充分发挥了各组分的优势，呈现出导电性更高、比表面积更大的优异电化学性能。
图3为实施例4(e)与对比例4(a)、对比例1(b)、对比例3(c)以及对比例2(d)所得修饰电极在pH＝4的B-R缓冲溶液中、扫速为0.1V/s时的循环伏安图。由图可以看出，纯Hb修饰电极(曲线b)有一对峰形较小的氧化还原峰，这是由于CILE中的离子液体促进了Hb的直接电子转移。LDH-g-C3N4加入后(曲线a)，生物电极的氧化还原峰电流均有不同程度降低，峰形变为不对称，这可能是因为LDH与C3N4的不导电的特性阻碍了Hb与电极之间的电子传递。与之相反,GR-g-C3N4(曲线c),GR-LDH(曲线d)以及GR-LDH-g-C3N4(曲线e)加入后,CV曲线的氧化还原峰电流逐渐加强，表明Hb的直接电子转移得到加强。从图中可以看出,GR-LDH-g-C3N4-Hb修饰电极的有一对明显高于其他修饰电极的氧化还原峰，表明GR-LDH-g-C3N4杂化材料能够更加有效的促进Hb与CILE间的电子转移速率，这不仅是因为GR-LDH-g-C3N4具有良好的导电性与较大的比表面积， 同时也是因为其具有良好的生物相容性。
图4为实施例4(e)、对比例4(a)、对比例1(b)、对比例3(c)以及对比例2(d)所得修饰电极在含有10.0mmol/L[Fe(CN)6]-3/-4和0.1mol/L KCl溶液中的电化学阻抗图。从图中可以看出，谱图分为两部分，其中高频条件下的半圆对应其有效电子转移过程，而低频段的线性部分是由于电子的扩散过程。电化学阻抗结果显示，不同修饰电极的电化学阻抗大小顺序依次为LDH-g-C3N4-Hb(曲线a)＞Hb(曲线b)＞GR-g-C3N4-Hb(曲线c)＞GR-LDH-Hb(曲线d)＞GR-LDH-g-C3N4-Hb(曲线e)，这与图3中的直接电化学响应结果相一致，表明GR-g-C3N4和GR-LDH加入后均可不同程度的促进生物酶与电极间的电子传递，而本发明提出的GR-LDH-g-C3N4三元杂化物相比于同类的二元对比电极表现出更小的电阻值，这是因为整合合并分层法与凝胶法的综合使用增大了复合材料的比表面积与导电性，而g-C3N4的引入再次增强了复合材料的高导电性。该三元杂化物所显示出的优异电化学性能，有利于电化学生物传感器的构建。
实施例5：
将实施例4所制得的CTS/GR-LDH-g-C3N4-Hb/CILE修饰电极作为工作电极，铂丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，采用三电极系统进行三氯乙酸的测定。向pH＝4的B-R缓冲溶液中加入不同体积的三氯乙酸，绘制不同三氯乙酸浓度时的循环伏曲线，记录随着三氯乙酸浓度的增大时还原峰电流的变化，并以还原峰电流对加入电解池中三氯乙酸浓度作图，求解相关参数。测试之前用高纯氮气向溶液中鼓泡30分钟除氧气，测试时用氮气保护排除氧气的干扰。
对比例1：
按照上述方法，将实施例1中对比例4所获得的CTS/GR-LDH-Hb/CILE修饰电极作为工作电极进行三氯乙酸的电化学测试。
对比例2：
按照上述方法，将实施例1中对比例4所获得的CTS/GR-g-C3N4-Hb/CILE修饰电极作为工作电极进行三氯乙酸的电化学测试。
对比例3：
按照上述方法，将实施例1中对比例4所获得的CTS/LDH-g-C3N4-Hb/CILE修饰电极作为工作电极进行三氯乙酸的电化学测试。
图5显示，CTS/GR-LDH-g-C3N4-Hb/CILE在pH 4.0的B-R缓冲溶液中加入TCA后，可观察到在-0.32V左右出现一个明显的TCA还原峰，随着TCA加入量的增大，还原峰电流也显著增大同时氧化峰逐渐消失，这是典型的TCA电还原过程。随着TCA浓度的进一步增大，在-0.6V处出现一个新的还原峰。这个还原峰的出现可能是因为高还原态HbFeI的形成使TCA再次脱氯。当TCA浓度为 0.7-22mmol/L时催化电流与其浓度呈线性关系，如图5中的插图所示，其线性回归方程为Ip(μA)＝0.19C(mmol/L)+1.61(n＝25，γ＝0.990)，检测限为0.2mmol/L(3σ)，米氏常数为3.5mmol/L。而图6中CTS/GR-LDH-Hb/CILE检测三氯乙酸的线性浓度范围4-19mmol/L，最低检测浓度为1.3mmol/L，米氏常数为4.4mmol/L，图7中CTS/GR-g-C3N4-Hb/CILE检测三氯乙酸的线性浓度范围0.8-18mmol/L，最低检测浓度为0.3mmol/L，米氏常数为5mmol/L，图8中CTS/LDH-g-C3N4-Hb/CILE检测三氯乙酸的线性浓度范围0.9-15mmol/L，最低检测浓度为0.3mmol/L，米氏常数为3.65mmol/L。可以看出，CTS/GR-LDH-g-C3N4-Hb/CILE修饰电极对三氯乙酸的电化学催化性能明显优于对比例中的三种二元修饰电极，说明整合合并分层法与凝胶法的综合使用以及三种组分的协同作用使得该三元杂化物呈现非常优异的电化学电催化性能。以上实验结果表明所制备的基于CTS/GR-LDH-g-C3N4-Hb/CILE修饰电极的三氯乙酸传感器检测限更低，线性范围更宽，米氏常数更小。
Claims (4)
1.一种石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳复合材料固定蛋白修饰电极，其特征在于它包括基底电极层和石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳杂化材料固定蛋白层；所述石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳复合材料是综合利用凝胶法和整合合并分层法将剥离类水滑石片与剥离氧化石墨烯片复合，与三聚氰胺混合焙烧后加水还原后制得；蛋白质溶液与石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳溶液混合形成复合蛋白层；其中石墨烯记为GR，类水滑石片记为LDH，石墨相氮化碳记为g-C3N4；
所述石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳复合材料固定蛋白修饰电极，其特征在于所述类水滑石片为钴铝型；所述蛋白质为牛血红蛋白，记为Hb；所述基底电极为离子液体修饰碳糊电极，记为CILE；
所述石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳杂化材料固定蛋白修饰电极的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤：
(a)ELDH的制备
将二价金属盐CoCl2·6H2O、三价金属盐AlCl3·6H2O和尿素按一定摩尔比加入到装有一定体积去离子水的圆底烧瓶中，总金属离子浓度为0.15mol/L，60～98℃搅拌回流10～36小时，反应完毕后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤3～5次，室温下干燥48小时，得到碳酸根插层的LDH；
称取一定量碳酸根插层的LDH，将其分散于浓度分别为1mol/L的NaCl和3.3mmol/L的HCl混合水溶液中，N2气氛下搅拌12小时，抽滤后室温干燥12小时，得到氯离子插层的LDH；
称取一定量氯离子插层的LDH，将其分散于浓度为0.1mol/L的NaNO3的水溶液中，N2气氛下搅拌12小时，抽滤后室温干燥12小时，得到硝酸根插层的LDH；
称取一定量硝酸根插层的LDH分散于甲酰胺中，使其浓度为1mg/mL，N2气氛下搅拌24小时，将该混合液在2000rpm条件下离心10min，弃去沉淀以除去未剥离的产物，得到的澄清液即为剥离产物ELDH胶体；
(b)GR-ELDH水凝胶的制备
采用hummer法制备氧化石墨烯，记为GO，并将一定量的GO分散于甲酰胺中，使其浓度为1mg/mL，超声分散1小时，3000rpm离心10min除去未剥离的GO，得到剥离的GO分散液；将该GO分散液与(a)中所得等体积的ELDH胶体溶液充分混合，室温密闭条件下搅拌12小时，5000rpm离心10min后，所得棕黑色沉淀重新分散于去离子水中，使其含GO的浓度为6mg/mL；取一定量该混合溶液封入25mL反应釜中，160℃下反应6小时后自然冷却至室温，得到GR-ELDH水凝胶，冻干保存；
(c)GR-LDH-g-C3N4杂化材料的制备
称取50mg(b)中所得GR-ELDH凝胶与一定量三聚氰胺充分混合，氮气气氛下于600℃下焙烧3h，反应完毕后将产物分散到水中，得到GR-LDH-g-C3N4杂化物；
(d)CILE的制备
将石墨粉与离子液体(BPPF6)以2:1的质量比加入研钵中，加热到80℃条件下均匀混合，向该粉末状混合物中滴加1mL液体石蜡作为粘合剂，再将混合物充分研磨好后填入玻璃管中，管内插入铜丝作为导线，将玻璃管中的固体混合物压实，得到CILE，使用前将该电极表面打磨光滑；
(e)GR-ELDH复合材料固定蛋白修饰电极的制备
将步骤(c)中得到的GR-LDH-g-C3N4杂化材料用去离子水配制成浓度为0.5mg/mL的浆状液并与浓度为10mg/mL的Hb充分混合；取16μL该混合溶液滴涂在步骤(d)中所得的CILE表面，自然晾干后再在电极上滴涂6μL浓度为1.0mg/mL的壳聚糖醋酸CTS溶液，自然干燥后得到CTS/GR-LDH-g-C3N4-Hb/CILE生物修饰电极。
2.根据权利要求1所述的一种石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳复合材料固定蛋白修饰电极的制备方法，其特征在于步骤(a)中所述二价金属盐CoCl2·6H2O、三价金属盐AlCl3·6H2O和尿素的摩尔比为2：1：7；一定体积的去离子水为400mL；称取的碳酸根插层的LDH和氯离子插层的LDH量均为配制浓度为1mg/mL悬浮液所需要的质量；步骤(b)混合溶液的体积为12mL；步骤(b)所得的GR-ELDH杂化材料由单层的GR和单层的ELDH复合而成，其厚度约为0.85-1nm；步骤(c)中三聚氰胺的用量为130mg。
3.权利要求1或2所述一种石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳复合材料固定蛋白修饰电极在制备电化学传感器方面的应用。
4.根据权利要求3所述的一种石墨烯-类水滑石片-石墨相氮化碳复合材料固定蛋白修饰电极的应用，其特征在于该修饰电极可用于三氯乙酸的检测。
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