CN104974270A - 一种硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖及其在抗凝血医药方面的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药免疫领域，提供了一种硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖及其在抗凝血医药方面的用途，该硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖由从粒毛盘菌YM281中分泌提取的粒毛盘菌多糖LEP-1，经三氧化硫-吡啶复合物硫酸酯化改性获得。经过药理实验，该硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖在低剂量(30mg/kg)、高剂量(90mg/kg)状态下均对小鼠的出血时间(BT)、小鼠凝血时间(CT)有延长作用，说明该硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖有抗凝血作用，为抗凝血研究提供了新的途径。

Description

一种硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖及其在抗凝血医药方面的用途

技术领域

本发明属于医药免疫领域，涉及一种硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖及其在抗凝血医药方面的用途。

背景技术

世界卫生组织报道，心血管疾病近年已经成为世界上主要引起死亡的原因之一。动脉粥样硬化是心血管疾病的重要基本病志，在此基础上的动脉内血栓形成是急性心血管疾病的重要原因，减少血栓的形成可以减少心血管疾病的发生。血栓的形成是血管内壁、凝血、抗凝及纤溶系统等多种因素共同作用的结果。高凝状态与血栓及血栓栓塞等并发症有关。高凝状态(HCS)，即血栓前状态(PTS)，是由多种因素引起的止血系统、凝血系统及抗凝系统失调的一种病理过程，存在容易导致血栓形成的多种血液学变化。因此，研究生物活性物质对高凝状态的改善具有临床意义。

肝素常被用作抗凝血剂，是一种分子量不定的酸性粘多糖，此多糖分子中含有许多硫酸根阴离子，主要是通过协同抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)或封闭有活性的凝血因子的丝氨酸蛋白酶残基，使其灭活，从而拮抗凝血活酶及凝血酶的形成，妨碍纤维蛋白原转变为纤维蛋白，阻止血小板聚集和被破坏等。实际上，肝素在临床应用中存在副作用，如自发性出血和骨质疏松等。因此，研究开发具有天然低毒和使用方便的抗凝血剂具有重要意义。

多糖是一类天然高分子化合物，通常具有重要的生物活性，而且几乎无毒。近年来，学者们陆续发现某些多糖具有明显的抗凝血活性，如红藻多糖、褐藻多糖、马尾藻多糖、海参多糖等。研究发现真菌多糖还具有明显的利肝健胃、降血糖、抗肿瘤等药理功能，在食品加工、医药、日用化工等领域均具有重要的应用。

粒毛盘菌属(Lachnum)是属于柔膜菌目(Helotiales)晶杯菌科(Hyaloscyphaceae)的一类腐生性真菌。本发明通过发酵与提取优化，从不同菌株的粒毛盘菌中获得了具有不同结构的多糖，包括同多糖和杂多糖。同时，通过评价这些多糖的生物活性，发现粒毛盘菌多糖具有抗氧化、抗肿瘤、促进创面愈合、降血糖和降脂利肝等功效。这为本发明从粒毛盘菌多糖中寻找抗凝血药物提供途径。

发明内容

本发明提供一种硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖及其在抗凝血医药方面的用途，确立了一种全新的多糖—硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖SLEP-1及其抗凝血的药理作用。

本发明的目的通过以下技术方案实现

本发明硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖，其特点在于：该硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖由三氧化硫-吡啶复合物对粒毛盘菌多糖LEP-1进行硫酸酯化改性获得，命名为SLEP-1；所述粒毛盘菌多糖LEP-1由粒毛盘菌YM281分泌提取获得。

所述粒毛盘菌多糖LEP-1可由以下方法制备获得，但不限于此，步骤包括：将粒毛盘菌YM281种子液于26℃、发酵培养基中发酵8d，获得粒毛盘菌多糖LEP-1的发酵液，将发酵液旋转蒸发浓缩，3倍体积的95％乙醇醇沉24h，4500r·min^-1离心8min，蒸馏水复溶；将得到的粗多糖脱蛋白、脱色、13000Da透析，获得初级纯化的粒毛盘菌多糖LEP-1；

其中，发酵培养基为：无水葡萄糖30g·L^-1，酵母膏5g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 1g·L^-1，KH₂PO₄1g·L^-1，V_B1 50mg·L^-1，自然pH，即不用调整pH。

所述硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖可由以下方法制备获得，但不限于此，步骤包括：将7.5g三氧化硫-吡啶复合物缓慢溶于90mL吡啶中，在三颈瓶中加热搅拌；当加热至90℃时加入1.5g的粒毛盘菌多糖LEP-1粉末，恒温搅拌1h后，停止加热，冷却至室温；用3mol·L^-1NaOH溶液将反应液调至中性后，加入5倍体积95％乙醇，静置24h，离心，将沉淀复溶于水，分别用自来水和蒸馏水透析2d和1d，浓缩后冷冻干燥，制得硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖，命名为SLEP-1。其中，温度由冷凝管和温度计进行操作。

本发明还提供了上述硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖在制备抗凝血药物中的应用，所制备的抗凝血药物为按药剂学的常规制备方法，以硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖为活性物质制备的口服片剂或胶囊。

本发明还提供了一种抗凝血药物，该药物的主要成分为上述硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖，该硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖的含量占药物总质量的60％以上。抗凝血药物可以为片剂、胶囊、颗粒剂、混悬剂、糖浆剂，根据不同的剂型，按照常规方法制备即可。

本发明的有益效果是：

本发明创造性地在粒毛盘菌多糖LEP-1的基础上进行硫酸酯化获得硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖SLEP-1，经过药理实验，粒毛盘菌多糖LEP-1、硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖SLEP-1在低剂量(30mg/kg)、高剂量(90mg/kg)状态下均对小鼠的出血时间(BT)、小鼠凝血时间(CT)有延长作用，说明粒毛盘菌多糖LEP-1、硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖SLEP-1均有抗凝血作用，这为抗凝血研究提供了新的途径。

尤其是经过硫酸酯化的硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖SLEP-1即使再低剂量(30mg/kg)状态下，也能够明显延长高凝模型小鼠的出血时间(BT)、小鼠全凝血时间(CT)、凝血酶时间(TT)和活化的部分凝血酶时间(APTT)，并显著降低高凝模型小鼠血浆中纤维蛋白原(FIB)含量，使高凝模型小鼠血浆中抗凝血酶Ⅲ(ATIII)的活性大于70％，且显著降低了凝血因子Xa(FXa)的浓度，说明，硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖SLEP-1是一种有效的全新抗凝血多糖。

本发明多糖通过粒毛盘菌获得，不仅可以通过大规模发酵培养，简单易得，适应工业化生产；而且天然无毒，稳定较强，可以制成多种剂型抗凝血药物。

附图说明

图1为粒毛盘菌多糖LEP-1和硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖SLEP-1对模型小鼠血浆的BT和CT的影响；其中，图1-A是对模型小鼠血浆BT的影响；图1-B是对模型小鼠血浆CT的影响；

图2为LEP-1和SLEP-1对模型小鼠血浆的APTT(A)、PT(B)和TT(C)的作用其中，图2-A是对模型小鼠血浆APTT(A)的作用；图2-B是对模型小鼠血浆PT(B)的作用；图2-C是对对模型小鼠血浆TT(C)的作用；

图3为LEP-1和SLEP-1对模型小鼠的血浆中FIB浓度的影响；

图4为LEP-1和SLEP-1对模型小鼠的血浆中AT-III活性和FXa浓度的影响；其中，图4-A是对模型小鼠的血浆中AT-III活性的影响；图4-B是对模型小鼠的血浆中FXa浓度的影响。

以上各图中，^aP＜0.05和空白组比显著；^bP＜0.001和空白组比极显著；^cP＜0.05和模型组比显著；^dP＜0.001和模型组比极显著；肝素作为阳性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件。

实施例1

(一)粒毛盘菌YM281胞外多糖的制备

将粒毛盘菌YM281(该菌株来源于文献“Purification,structure,lipid lowering and liverprotecting effects of polysaccharide from Lachnum YM281”，期刊：Carbohydrate Polymers，ISSN:0144-8617，发表日期：2013.10，页码：922–930)种子液接种到100L的发酵罐中发酵，搅拌速度160r·min^-1，发酵温度26℃，发酵时间8d。发酵培养基：无水葡萄糖30g·L^-1，酵母膏5g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 1g·L^-1，KH₂PO₄ 1g·L^-1，V_B1 50mg·L^-1，自然pH。将发酵液旋转蒸发浓缩，3倍体积的95％乙醇醇沉24h，4500r·min^-1离心8min，蒸馏水复溶。将得到的粗多糖脱蛋白、脱色、透析(透析袋13000Da)和冻干，获得初级纯化的多糖LEP-1。

(二)硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖的制备

将三氧化硫-吡啶复合物7.5g缓慢溶于90mL吡啶中，在附有冷凝管和温度计的三颈瓶中用电磁加热搅拌器搅拌。当加热至90℃时加入1.5g LEP-1粉末，恒温搅拌1h后，停止加热，冷却至室温。用3mol·L^-1NaOH溶液将反应液调至中性后，加入5倍体积95％乙醇，静置24h，离心，将沉淀复溶于水，分别用自来水和蒸馏水透析2d和1d，浓缩后冷冻干燥，制得硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖，命名为SLEP-1。

(三)粒毛盘菌YM281胞外多糖与其硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖生理盐水溶液的制备

粒毛盘菌多糖LEP-1与其硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖SLEP-1粉末用0.9％生理盐水配置成20mg/mL的水溶液，给药体积分别为30mg·kg^-1、90mg·kg^-1。

(四)粒毛盘菌多糖LEP-1与其硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖SLEP-1的抗凝血作用的药理实验

(1)动物：昆明雌性小鼠35只，体重20±2g，随机分组。

(2)试剂盒：部分凝血酶时间(APTT)(液体白陶土)试剂盒、凝血酶原时间(PT)试剂盒、凝血酶时间(TT)试剂盒，南京建成生物工程研究所。

(3)阳性药物：肝素，江苏万邦生化医药股份有限公司。

(4)方法：将35只小鼠随机平均分为7组，即空白组、病理模型组、肝素组、LEP-1低剂量组、LEP-1高剂量组，SLEP-1低剂量组、SLEP-1高剂量组，分别给除空白组外的每组的每只小鼠每天皮下注射0.08mg·kg^-1的肾上腺素一次，注射两周。肾上腺素能够激活凝血因子，启动凝血系统，从而导致机体处于高凝状态。当小鼠血浆的APTT、PT明显缩短、AT-III活性≤70％时，或APTT和TT缩短、AT-III活性≤70％时诊断为小鼠处于高凝状态，即建模成功。

给空白组和病理模型组都注射生理盐水，肝素组、LEP-1低剂量组、LEP-1高剂量组、SLEP-1低剂量组及SLEP-1高剂量组分别腹腔注射10mg·kg^-11％肝素(150U·mg^-1)、30mg·kg^-1LEP-1、90mg·kg^-1LEP-1、30mg·kg^-1SLEP-1、90mg·kg^-1SLEP-1。每天一次，共2周。最后一次腹腔注射60min后，小鼠用65mg·kg^-1戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。

(5)相关指标测定：

出血时间(BT)的测定(用剪尾法测定)：小鼠尾尖3mm处用剪刀剪断，血液溢出时开始计时，每间隔30s用滤纸吸去剪断处的血滴一次，血停止溢出时停止，即滤纸吸取时无血迹停止，记录时间，即为出血时间BT。

小鼠全凝血时间(CT)的测定(用毛细血管法测定)：用毛细血管(内径为1mm)插入每组小鼠的内眦球，静脉取血，从血液流进毛细血管开始计时。当毛细血管被血液注满后，平放于桌面，每隔5s折断一次毛细血管，同时缓缓拉开，观察是否有纤维蛋白丝出现。多次重复，当纤维蛋白丝出现时，停止计时，记录时间，即为小鼠全凝血时间CT。

活化的部分凝血酶时间(APTT)的测定(使用活化的部分凝血酶时间试剂盒测定)：摘眼球取静脉血，0.109M枸橼酸钠抗凝(1:9)，混匀后以3000rpm离心30min，收集上层液体，分离贫血小板血浆(PPP)。取平衡至室温的APTT试剂(液体白陶土)50μL，加入待测样本50μL，混合均匀后，37℃孵育3min，然后加入预热的50μL CaCl₂溶液，立即混匀，立刻启动秒表，记录血浆凝固时间，即为APTT。平行三次测定。

凝血酶原时间(PT)的测定(使用凝血酶原时间试剂盒测定)：摘眼球取静脉血，0.109M枸橼酸钠抗凝(1:9)，混匀后以3000rpm离心30min，收集上层液体，分离贫血小板血浆(PPP)。取待测样本50μL，37℃孵育3min，加入预热的凝血酶原试剂100μL，立即混匀，立刻启动秒表，记录血浆凝固时间，平行三次测定。

凝血酶时间(TT)的测定(使用凝血酶时间(TT)试剂盒测定)：摘眼球取静脉血，0.109M枸橼酸钠抗凝(1:9)，混匀后以3000rpm离心30min，收集上层液体，分离贫血小板血浆(PPP)。取待测样本100μL，37℃孵育3min，加入预热的TT试剂(3-5U·mL^-1凝血酶)100μL，立刻启动秒表，记录血浆凝固时间。平行三次测定。

纤维蛋白原(FIB)含量的测定(使用纤维蛋白原(FIB)测定试剂盒测定)：摘眼球取静脉血，0.109M枸橼酸钠抗凝(1:9)，混匀后以3000rpm离心30min，收集上层液体，分离贫血小板血浆(PPP)。

将复溶后的纤维蛋白原标准品(200-400mg·dL^-1)用缓冲溶液分别作1:5(100μL血浆+400μL缓冲液)，1:10、1:15、1:20、1:30稀释，取此不同浓度的标准血浆各200μL，37℃孵育3min，然后分别加入凝血酶(大于100U·mL^-1的凝血酶)试剂100μL，测定凝固时间。以不同浓度的纤维蛋白原标准品含量(mg·dL^-1)为横坐标，以相应的凝固时间为纵坐标，作出标准曲线。

待测样品用缓冲液作1:10稀释后取200μL，37℃孵育3min，加入凝血酶试剂100μL，测定凝固时间，计算出FIB的含量。

抗凝血酶Ⅲ(ATIII)活性的测定(使用小鼠抗凝血酶III活性测定试剂盒进行测定)：摘眼球取静脉血，0.109M枸橼酸钠抗凝(1:9)，混匀后以3000rpm离心30min，收集上层液体，分离贫血小板血浆(PPP)。ATⅢ活性检测原理是样品中的抗凝血酶III被肝素转化成抑制剂，加入过量凝血酶，使ATⅢ与凝血酶形成1:1复合物使存在的凝血酶失活，剩余的凝血酶作用于发色底物，释放显色基团，在405nm出测定吸光度的增加，吸光度的变化与ATⅢ呈负相关，根据标准曲线计算出ATⅢ活性。

凝血因子Xa(FXa)的测定：

采用小鼠凝血因子Xa(FXa)ELISA检测试剂盒(双抗体一步夹心法)。摘眼球取静脉血，0.109M枸橼酸钠抗凝(1:9)，混匀后以3000rpm离心30min，收集上层液体，分离贫血小板血浆(PPP)。往预先被凝血因子Xa(FXa)抗体包被微孔中依次加入标本、标准品及HRP标记的检测抗体，经过温育后，彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化酶的催化下转换为蓝色，并在酸的作用下转化成黄色。颜色的深浅和样品中的凝血因子Xa(FXa)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度后，计算出样品中FXa的浓度大小。

(6)粒毛盘菌多糖LEP-1与其硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖SLEP-1的抗凝血作用的药理实验结果

出血时间BT与多种因素有关，包括毛细管功能、组织因子、组织收缩能力、血小板数量与功能、纤溶等。全凝血时间CT主要与各种凝血因子和抗凝血因子的活性有关。和空白组相比，病理模型组小鼠BT和CT分别从8.223min缩短到3.5333min，从2.5133min缩短到0.7133min，两组间都存在显著差异(P<0.01，图1)。和病理模型组相比，LEP-1和SLEP-1能够显著延长小鼠的BT和CT(P<0.01或P<0.05，图1)，并且存在剂量效应关系。相同剂量下，SLEP-1延长小鼠BT和CT的能力较LEP-1的强。SLEP-1高剂量组的小鼠的BT和CT(7.9367min和2.1167min)和肝素组的(7.4300min和2.4100min)接近，都无显著差异(P＞0.05)。

和空白组相比，病理模型组小鼠血浆APTT、PT和TT显著缩短，这从一方面表明建模成功，小鼠处于高凝状态。和模型组相比，LEP-1组和SLEP-1组的APTT(图2-A)和TT(图2-C)都在不同程度上延长，且存在剂量效应关系。和模型组相比，SLEP-1低剂量组和SLEP-1高剂量组的APTT分别延长了12.097s和13.77s，都大于10s，视为有效延长；LEP-1低剂量组、LEP-1高剂量组、SLEP-1低剂量组和SLEP-1高剂量组的TT都显著延长(P＜0.01，图2-C)，且延长都超过3s，视为有效延长；LEP-1低剂量组、LEP-1高剂量组、SLEP-1低剂量组和SLEP-1高剂量组PT虽延长，但延长都小于3s，视为未有效延长(图2-B)。另外，SLEP-1高剂量组APTT和TT和肝素组的相近(图2-A与图2-C)，且接近空白对照组；SLEP-1组较LEP-1组的APTT和TT长。

APTT和TT的延长表明LEP-1和SLEP-1能够抑制内源性凝血途径和凝血酶调节蛋白的形成。SLEP-1组较LEP-1组的APTT和TT长，可能是由于SLEP-1中带负电荷的硫酸基团和一些带正电的肽类序列之间的强相互作用。

纤维蛋白原(FIB)，即凝血因子Ⅰ，直接参与凝血过程(凝血共同途径)，是血浆中含量最高的凝血因子；除抗凝系统外，纤溶系统也存在由纤溶酶作用的纤维蛋白原和纤维蛋白的水解。和空白组相比，模型组小鼠FIB显著升高(P＜0.001)。和模型组相比，LEP-1低剂量组、LEP-1高剂量组、SLEP-1低剂量组和SLEP-1高剂量组小鼠血浆FIB浓度显著降低(P＜0.05或P＜0.001，图3)，且存在剂量效应关系；相同剂量下，SLEP-1降低小鼠血浆FIB浓度的能力大于LEP-1。SLEP-1高剂量组小鼠血浆中FIB(211.1533mg·dL^-1)接近肝素组(245.66mg·dL^-1)，两者无显著性差异(P＞0.05)。结果表明，LEP-1和SLEP-1对小鼠的抗凝系统和纤溶系统都有一定的影响。

模型组小鼠血浆AT-III活性小于70％(图4)，可以从一方面说明小鼠处于高凝状态。同时，模型组小鼠血浆APTT、PT和TT较空白组显著缩短(图2)。因此，和空白组相比，模型组小鼠血浆APTT、PT、TT和FIB的这些变化可以表明肾上腺素处理后小鼠处于高凝状态，建模成功。

AT-Ⅲ是由肝脏和内皮细胞合成的人体最重要的抗凝血因子之一，占整个抗凝作用的70％。和病理模型组相比，LEP-1低剂量组、LEP-1高剂量组、SLEP-1低剂量组和SLEP-1高剂量组小鼠血浆AT-Ⅲ活性显著提高(P<0.05或P<0.01，图4-A)，后三组的都大于70％，存在剂量效应关系；在相同剂量下，SLEP-1提高小鼠血浆中AT-III活性的能力较LEP-1高；SLEP-1高剂量组小鼠血浆中AT-III的活性(84.23％)接近肝素组(86.23％)，两者无显著性差异(P＞0.05)。

AT-Ⅲ是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，而凝血因子Ⅱa、Ⅶa、Ⅹa和Ⅻa的活性中心都含有丝氨酸残基(即都属于丝氨酸蛋白酶)。因此，AT-Ⅲ分子上的精氨酸残基与这些酶活性中心的丝氨酸残基结合，进而封闭这些酶的活性中心，使之失活，从而起到抗凝血的作用。因此，LEP-1和SLEP-1可能是与AT-Ⅲ结合，催化灭活这些凝血因子。另外，由于电荷效应，SLEP-1可能通过硫酸基团的负电荷效应与AT-Ⅲ的赖氨酸结合部位结合，从而改变精氨酸反应中心的构象，激活AT-Ⅲ，使AT-Ⅲ从慢速凝血酶抑制剂变为快速抑制剂，AT-Ⅲ与凝血酶的丝氨酸活化中心通过共价键结合，灭活凝血酶。因此，在相同剂量下，SLEP-1较LEP-1的AT-Ⅲ活性高。

FXa处于内源性外源性凝血系统的交汇点。活化的FXa能够将凝血酶原FII激活成为凝血酶FIIa，促使纤维蛋白的形成，由此形成血栓，因此，FXa已经成为开发新一代抗凝血药物的主要靶点。和模型组比较，LEP-1组和SLEP-1组小鼠血浆中FXa的浓度都在一定程度上降低(图4-B)，且存在剂量效应关系。相同剂量下，SLEP-1抑制FXa的能力较LEP-1组；SLEP-1高剂量组FXa的浓度(4328.6111ρg·mL^-1)和肝素组的(3825.8333ρg·mL^-1)相近。因此，SLEP-1较LEP-1能够更有效抑制FXa，抑制凝血系统的的启动。

综上所述，和模型组相比，LEP-1低剂量组、LEP-1高剂量组、SLEP-1低剂量组和SLEP-1高剂量组小鼠的BT和CT都明显延长；SLEP-1低剂量组和SLEP-1高剂量组的APTT都显著延长(P＜0.01)，且大于10s；LEP-1高剂量组、SLEP-1低剂量组和SLEP-1高剂量组的TT都显著延长(P＜0.01)，且大于3s；LEP-1低剂量组、LEP-1高剂量组、SLEP-1低剂量组和SLEP-1高剂量组的FIB含量都显著降低(P＜0.05或P＜0.01)；LEP-1高剂量组、SLEP-1低剂量组和SLEP-1高剂量组小鼠血浆中AT-III的活性都大于70％，FXa浓度显著降低。因此，推测低剂量SLEP-1和高剂量SLEP-1都能有效抗凝。SLEP-1高剂量组抗凝效果好，和肝素组效果相近。这可能是由于硫酸酯化修饰改变了原多糖的分子量、溶解性和链构象等多种因素引起的。因此，低剂量和高剂量SLEP-1对内源性凝血途径有很强的抑制作用，并能增强纤溶系统的活性。

(五)结论

从以上结果可以看出，低剂量SLEP-1和高剂量SLEP-1能够明显延长高凝模型小鼠的BT、CT、TT和APTT，并显著降低高凝模型小鼠血浆中FIB含量。此外，低剂量SLEP-1和高剂量SLEP-1使高凝模型小鼠血浆中AT-III的活性大于70％，且显著降低了FXa的浓度。因此，SLEP-1主要是通过抑制内源性凝血途径和增强纤溶系统的活性在高凝模型小鼠体内起到抗凝作用。

实施例2

硫酸酯化粒毛盘菌YM281胞外多糖的加工

1、片剂加工：

将300-600g粒毛盘菌YM281硫酸酯化胞外多糖与药用辅料稀释剂200-250g、助流剂30-60g混匀后250-600mL乙醇混合均匀制得软材，软材过筛得到湿颗粒，干燥后整粒最后加入润滑剂3-10g混匀后压片，制成1000片片剂。药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；润滑剂采用硬脂酸镁或硬脂酸锌。

本发明推荐的片剂加工的优选例为：取过80～100目筛的粒毛盘菌YM281硫酸酯化胞外多糖500g、稀释剂糊精250g、助流剂滑石粉40g混合均匀后加300-500mL乙醇混合均匀制得软材，软材过筛得到湿颗粒，干燥后整粒，最后加入润滑剂硬脂酸镁10g混匀后压片，制成1000片，片重0.8g，硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖含量0.5g/片。

2、胶囊剂加工：

将药用辅料稀释剂200-270g、助流剂40-70g、润湿剂3-6g混匀后分别与300-600g的粒毛盘菌YM281硫酸酯化胞外多糖混合均匀后装空心胶囊，制得胶囊剂1000粒。药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；润湿剂采用十二烷基硫酸钠或者磺基丁二酸二辛酯。

本发明推荐的胶囊剂加工优选例为：取稀释剂干淀粉250g，助流剂滑石粉45g，润湿剂十二烷基硫酸钠5g混合均匀再分别与500g粒毛盘菌YM281胞外多糖及其硫酸酯化衍生物混合均匀后装空心胶囊1000粒，多糖含量0.5g/粒。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖，其特征在于：所述硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖是利用三氧化硫-吡啶复合物对粒毛盘菌多糖LEP-1进行硫酸酯化改性获得的，所述粒毛盘菌多糖LEP-1由粒毛盘菌YM281分泌提取获得。

2.一种如权利要求1所述硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖在制备抗凝血药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所制备的抗凝血药物为按药剂学的常规制备方法，以硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖为活性物质制备的口服片剂或胶囊。

4.一种抗凝血药物，其特征在于：所述抗凝血药物的主要成分为如权利要求1所述的硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖，所述硫酸酯化粒毛盘菌胞外多糖的含量占所述抗凝血药物总质量的60％以上。