CN104971069A - 一种大白栓菌中提取的3-氢化松苓酸b在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及大白栓菌中提取的3-氢化松苓酸B的新功能及用途。该物质具有抗消化性溃疡、增加胃动力进而抗非溃疡性消化不良的作用；大大白栓菌中提取的3-氢化松苓酸B在对胃癌细胞的增殖、食管癌Eca-109细胞的增殖以及大肠癌LOVO细胞的增殖具有一定的抑制作用，在消化系统及抗胃癌等用药方面其具有广泛的科研及大批生产食用价值。

Description

一种大白栓菌中提取的3-氢化松苓酸B在制药中的应用

技术领域

本申请涉及大白栓菌中提取的3-氢化松苓酸B的用途，尤其涉及其在制药及保健食品中的用途。

背景技术

大白栓菌Trametes lactinea(Berk.)Pat.是一种多孔菌目多孔菌科栓菌属的大型真菌^[1]，实验用大白栓菌从土里土家族常用食品鲊辣椒分离，经王绍柏老师鉴定为大白栓菌。国内外对大白栓菌的研究极少。近年来，对大白栓菌研究表明大白栓菌提取物具有良好的免疫增强作用和抗肿瘤作用。

发明内容

使用电子电离质谱分析仪(VG Analytical 70-250 S，70eV)对大白栓菌的提取物进行分子量测定，得到提取的化合物的核磁共振数据为

表1 大白栓菌提取物3-氢化松苓酸B的核磁共振数据

从化合物的EIMS图谱上可以看到分子离子[M]⁺454，由此确定它的分子量为454，其它的碎片峰(439[M±CH₃]⁺(100),421[M±CH₃±H₂O]⁺(33),393(43),297(48),95(38),69(43))，与Francesca Cateni[1]等报道的数据吻合。

将获得的质谱及核磁共振图谱数据与文献数据作比较，鉴定主要化合物，3-氢化松苓酸B(3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-酸)，3-氢化松苓酸B的结构式如图1所示。

该化合物由大白栓菌提取制得，已知可作用于糖尿病的的活性成分。

本发明的目的在于制备大白栓菌丝或大白栓菌提取物、3-氢化松苓酸B，并用于预防和治疗消化性溃疡的药中的应用。

本发明的另一目的在于制备大白栓菌丝或大白栓菌提取物、3-氢化松苓酸B，并应用于预防和治疗非溃疡性消化不良的药中的应用。

本发明的另一目的在于制备大白栓菌丝或大白栓菌提取物、3-氢化松苓酸B，并应用于预防和治疗胃癌的药中的应用。

本发明的再一目的在于制备大白栓菌丝或大白栓菌提取物、3-氢化松苓酸B，并应用于预防和治疗食管癌的药中的应用。

本发明的再一目的在于制备大白栓菌丝或大白栓菌提取物、3-氢化松苓酸B，并应用于预防和治疗大肠癌的药中的应用。

本发明的再一目的在于制备大白栓菌丝或大白栓菌提取物、3-氢化松苓酸B，并应用于保健食品、药品中的应用。

本发明的大白栓菌丝或大白栓菌提取物、3-氢化松苓酸B具有抑制H⁺，K⁺-ATPase活性及抗胃溃疡作用。

附图说明

图1为3-氢化松苓酸B的结构式。

图2为3-氢化松苓酸B和H⁺，K⁺-ATPase分子对接结果。

具体实施例

大白栓菌菌丝、大白栓提取物3-氢化松苓酸B、大白栓水提物、95％乙醇提取物的制备方法见专利申请大白栓菌的人工培养方法及用途，公开号为：200810046969.7。

1.抗消化性溃疡试验

(1)抑制H⁺，K⁺-ATPase活性作用：取正常昆明小鼠，体重20-25g，不禁食，颈椎脱臼处死，于75％酒精中消毒5min，无菌条件下解剖，将胃袋取出，置于冷的PBS缓冲盐溶液中。取胃时尽量将外膜上的包被蛋白质和脂肪等刮掉。用剪刀将胃袋延大弯从下端开口处剪开部分，再用镊子将胃袋翻转，夹住未剪开端，用PBS缓冲盐溶液将食物残渣洗尽，在冷的PBS缓冲盐溶液中暂时保存。将配好的5％的胰酶溶液，按照每个胃袋4-5ml的用量，进行消化。将胃内壁细胞刮下，分散到取出的冷胰酶中。将分散有内膜层细胞的冷胰酶放入37℃水浴中消化10min。消化过程中每2-3min轻轻振摇一次，防止消化的细胞堆积。消化完成后，在无菌条件下用移液枪轻轻吹打，使细胞尽量多的脱落。用200目的筛网将细胞和组织分开。将细胞液转入10ml离心管中，于1200rpm下离心8min，弃掉溶液，迅速加入DMEM培养基。

将上述细胞制成单细胞悬液，用DMEM培养基调整细胞浓度至1×10⁵/ml左右，接种于96孔板，每孔100μl。分别加入奥美拉唑(10ug/ml)、95％乙醇提取物(80、40和20ug/ml)、大白栓水提物(80、40和20ug/ml)3-氢化松苓酸B(40、20和10ug/ml)，(所加药物均用浓度小于0.1％的DMSO溶解后加培养基稀释，经0.22μm滤膜过滤)，37℃孵育4h后，每种药物浓度共计三个平行测定样，用H⁺，K⁺-ATPase活性测定试剂盒测定酶活性，计算抑制率。

表2 大白栓菌提取物对H⁺，K⁺-ATPase活性的影响(n＝6)

与对照组比*p﹤0.05,**p﹤0.01

(2)抗胃溃疡作用：取昆明种小鼠，随机分成组，每组10只雌雄各半。试验组每天灌胃给予相应药物，共五天，第四天给药后禁食不禁水，末次给药后1小时后，灌胃阿斯匹林-乙醇溶液0.2ml(将阿斯匹林 200mg/kg用40％的乙醇溶解)，4h后处死小鼠，将小鼠沿胃大弯处剪开，翻转后用清水洗去内容物，于解剖显微镜下观察胃溃疡点，根据病变程度记分。局部充血发红为1分，点状出血或糜烂各为1分，线状糜烂1个为3分，总计后作为溃疡指数。同时取胃组织匀浆，测定酶活。

表3 大白栓菌提取物对小鼠胃溃疡的影响(n＝10)

与模型组比*p﹤0.05,**p﹤0.01

体内外实验结果显示，大白栓菌具有抗消化性溃疡作用，大白栓提取物、3-氢化松苓酸B是主要有效成分。

分子对接计算：Auto Dock 4.0软件中，分别构建H⁺，K⁺-ATPase(受体)和3-氢化松苓酸B(配体)的三维结构，将配体和受体对接，运行软件，查看对接结果。对接结果以对接分值用结合能△G表示，由图2的3-氢化松苓酸B和H⁺，K⁺-ATPase分子对接结果可知H⁺，K⁺-ATPase和3-氢化松苓酸B的结合能△G＝-4.75。

2.改善胃动力的试验

胃动力低下大鼠模型制作：

SD大鼠购进后，适应性饲养3d，随机分组，空白组和模型组分别给予2ml的生理盐水和甘草煎剂(10g/kg)，隔日半量进食，持续10天，制作胃动力低下大鼠模型，造模成功后，模型组继续给予生甘草溶液、正常对照组给予以等量生理盐水，药物组给予相应药物，并继续每日灌胃甘草溶液(10g/kg)。第7天灌胃时加入苯酚红溶液0.8ml，灌胃结束20min后，颈椎脱臼处死大鼠，剖开腹部，结扎贲门和幽门，摘取胃及小肠。

胃残留率及小肠推进率测定：

胃残留率：取0.002g/ml苯酚红溶液1ml加入至10ml 0.1mol/L的NaOH溶液中，震荡混匀。取0.2ml 溶解至1ml纯水中，即为标准液。波长560nm下紫外可见分光光度计于测定其吸光度，即为标准液OD值。将全胃浸于0.1mol/L的NaOH溶液中并剪碎，充分洗涤，摇匀，室温下4000rpm离心10min，收集上清液0.2ml，加入纯水1ml，同样使用紫外可见分光光度计测定其再560nm下的吸光度，即为测定液OD值。按以下公式计算胃残留率：

胃残留率(％)＝测定液OD值/标准液OD值×100％。

小肠推进率：截取幽门至远端回盲部部分，平铺于解剖板上，测量全长。观察苯酚红前沿到幽门的距离并测量其长度。若不能清楚显示苯酚红，则从远端剪开肠管，注射器滴加0.1mol/L NaOH，若颜色显示为红色则提示苯酚红已推进至此处。以酚红在小肠的推进长度占小肠全长的百分数计算小肠推进率。

小肠推进率(％)＝苯酚红推进距离/小肠全长(cm)×100％。

表4 大白栓菌提取物对胃残留率及小肠推进率的影响(n＝8)

与模型组比*p﹤0.05,**p﹤0.01

实验结果显示，大白栓菌能增加胃动力，大白栓提取物、3-氢化松苓酸B是主要有效成分。

胃动力指胃部肌肉的收缩蠕动力，包括胃部肌肉收缩的力量和频率。胃动力障碍是造成非溃疡性消化不良的主要原因。胃动力出现障碍时，会发生消化不良，出现腹胀、嗳气、食欲不振、反酸、恶心、呕吐等消化不良症状。大白栓菌能增加胃动力，可用于治疗胃动力不足引起的消化不良。

3.抗胃癌作用试验

细胞株的体外培养：人胃粘膜上皮细胞GES-1和人胃癌细胞HGC-27用DMEM培养基培养，细胞培养液均含胎牛血清体积分数为10％，含青、链霉素各100U/ml。所有细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养， 以0.25％的胰蛋白酶消化细胞传代，取对数生长期细胞用于实验。

3-氢化松苓酸B在不同pH值下对细胞存活率的影响：

取对数生长期细胞常规消化制成单细胞悬液，用培养液调整细胞浓度至5×10⁴-1×10⁵ml左右，接种于96孔板，每孔100μl。培养24h后加入3-氢化松苓酸B(1μg/ml、5μg/ml和10μg/ml)、大白栓菌醇提物(20μg/ml和40μg/ml)和大白栓菌水提物(20μg/ml和40μg/ml)，另设空白对照组和正常对照组，同时每组设置不同pH值(pH 7.5,pH 6.5和pH 5.5)，每组设6个复孔。37℃继续培养，培养24h，后，每孔加入5mg/ml MTT20μl，37℃孵育4h，弃去培养液，每孔加入DMSO 150μl，轻微摇动，使结晶物充分溶解，用酶联免疫检测仪在波长492nm处检测每孔的吸收度(OD值)。

按下列公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率(％)＝1-(加药组平均OD值/正常对照组平均OD值)×100％。

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，实验数据以表示，以P<0.05为具有统计学差异。

表5 药物在不同PH值下对HGC-27细胞增殖的影响(n＝6)

与空白组比*p﹤0.05,**p﹤0.01

表6 药物在正常PH值(PH＝7.5)下对GES-1细胞增殖的影响(n＝6)

实验结果表明，大白栓醇提物对胃癌细胞细胞的增殖有一定抑制作用，在酸性环境下其抑制作用大大增强，低浓度3-氢化松苓酸B(10μg/ml、5μg/ml)、高浓度大白栓醇提物(40μg/ml)和大白栓水提物(40μg/ml)作用24h后对细胞的抑制率分别达到61.4％、81.5％、40％和32.9％，而此浓度在正常pH环境下对人正常胃粘膜上皮细胞几乎没有影响。

4.抗食管癌作用试验

细胞株的体外培养：将人食管癌细胞株Eca-109置于RPMI1640培养液中(含10％胎牛血清和青霉素、链霉素各100U/ml)，在37℃饱和湿度，5％CO₂培养箱中培养。待细胞进入对数生长期后，经0.25％胰蛋白酶消化，收集，调配成相应的细胞浓度。

MTT试验：制备成1×10⁴/ml的Eca-109细胞悬液，吹打均匀后加入96孔板中，培养12h后，分为空白对照组、阳性组(20μg/ml丝裂霉素)和大白栓菌醇提物、大白栓菌水提物及3-氢化松苓酸B 5个实验组，每个实验组分4个剂量组，分别加入不同浓度的药物(100，80，40，20和10μg/ml)，对照组加入培养液，继续培养48h，然后每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，继续培养4h。弃去培养液，每孔加入DMSO 150μl，轻微摇动，用酶联免疫检测仪在波长492nm处检测每孔的吸收度(OD值)。

表7 大白栓提取物对Eca-109细胞的体外抑制作用(n＝6)

结果表明，大白栓提取物对食管癌Eca-109细胞的增殖有抑制作用。

5.抗大肠癌作用试验

细胞株的体外培养：将人大肠癌细胞株LOVO置于DMEM培养液中(含10％胎牛血清和青霉素、链霉素各100U/ml)，在37℃饱和湿度，5％CO2培养箱中培养。待细胞进入对数生长期后，经0.25％胰蛋白酶消化，收集，调配成相应的细胞浓度。

MTT试验：制备成5×10⁴/ml的LOVO细胞悬液，吹打均匀后加入96孔板中，培养12h后，分为空白对照组、阳性组(20μg/ml丝裂霉素)和大白栓菌醇提物、大白栓菌水提物及3-氢化松苓酸B 3个实验组，每个实验组分4个剂量组，分别加入不同浓度的药物(100，80，40，20和10μg/ml)，对照组加入培养液，继续培养48h，然后每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，继续培养4h。弃去培养液，每孔加入DMSO 150μl，轻微摇动，用酶联免疫检测仪在波长492nm处检测每孔的吸收度(OD值)。

表8 大白栓提取物对LOVO细胞的体外抑制作用(n＝6)

结果表明，大白栓提取物对大肠癌LOVO细胞的增殖有抑制作用。

Claims (6)

1.一种大白栓菌中提取的3-氢化松苓酸B在制备预防和治疗消化性溃疡的药中的应用。

2.一种大白栓菌中提取的3-氢化松苓酸B在制备抑制H⁺，K⁺-ATPase活性及抗胃溃疡的药中的应用。

3.一种大白栓菌中提取的3-氢化松苓酸B在制备预防和治疗非溃疡性消化不良的药中的应用。

4.一种大白栓菌中提取的3-氢化松苓酸B在制备预防和治疗胃癌的药中的应用。

5.一种大白栓菌中提取的3-氢化松苓酸B在制备预防和治疗食管癌的药中的应用。

6.一种大白栓菌中提取的3-氢化松苓酸B在制备预防和治疗大肠癌的药中的应用。