CN103451021A

CN103451021A - 一种用co2 超临界萃取神香草全草挥发油的方法及其用途

Info

Publication number: CN103451021A
Application number: CN2013103621396A
Authority: CN
Inventors: 阿不都热依木·玉苏甫; 麦合苏木·艾克木; 安尼瓦尔·托乎提
Original assignee: Xinjiang Medical University
Current assignee: Xinjiang Medical University
Priority date: 2013-08-19
Filing date: 2013-08-19
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2033-08-19
Also published as: CN103451021B

Abstract

本发明涉及一种用CO₂超临界萃取神香草全草挥发油的方法及其用途,它是将维吾尔药神香草全草经CO₂超临界萃取神香草全草挥发油，得率为5%以上。本方法提供的神香草全草挥发油具有显著的抗炎、止咳、祛痰及平喘作用,可作为制备抗炎、止咳、祛痰及平喘产品的原料或作为制备治疗肺炎、哮喘及调节呼吸系统功能食品、保健品、药品的组成成分。本制备方法安全简便，可重复性好，无环境污染，适用于规模化生产。

Description

一种用CO2 超临界萃取神香草全草挥发油的方法及其用途

技术领域

本发明涉及CO₂超临界萃取技术，尤其是对神香草全草中的有效挥发油成分的提取及使用，效果极佳。

背景技术

神香草是维吾尔医常用药材，维吾尔名为“祖发”，是唇形科植物硬尖神香草（Hyssopus cuspidatus Boriss.）或同属植物欧神香草（Hyssopusofficinalis L.）的干燥全草，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准：维吾尔药分册》（乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999年）、《中华本草·维吾尔药卷》（上海：上海科学技术出版社，2005年）、《维吾尔药志》（上册）（乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999年）。在《中华人民共和国卫生部药品标准：维吾尔药分册》中记载：神香草成熟及清除异常粘液质，促进机体自然随和，止咳化痰，平喘利肺，用于胸肺粘稠性顽疾，头痛胸痛，气喘气短，胸肋痛疼，久咳痰多。在《中华本草·维吾尔药卷》中记载：神香草生干生热，温肺平喘，祛寒止咳，燥湿祛痰，发汗解毒，消炎退肿，主治湿寒性和粘液质性呼吸器官疾病，如寒性哮喘，咳嗽感冒，湿性痰多，乃孜来毒液流窜胸肺，胸膜炎，气管炎，肺炎及水肿。据文献报道，神香草全草含挥发油、黄酮类、多糖类等化学成分，具有抑制血糖升高、止咳、祛痰、平喘、抑菌、解痉、抗氧化等作用。

神香草全株主要含挥发油，具有痉挛停生物碱样作用，使支气管痉挛接除，而具有镇咳作用，主要用于止咳、平喘、祛风寒、杀菌，用于咳嗽、头疼、哮喘及寒性引起的上呼吸道感染等。神香草还可作为香料、芳香精油用于化工原料等。

神香草主要产于新疆北部山区（阿尔泰地区盛产）、新疆南部和田地区、独联体国家及俄罗斯、印度、伊朗、欧洲等亦有分布，野生于山地林边或草坡上。最近，在新疆库尔勒人工种植神香草获得成功，从而为其开发和利用提供了充足的物质资源。

本发明采用CO₂超临界萃取神香草全草挥发油，经GC-MS法鉴别出34种化合物，其中含量较高的是目前被认为具有生物活性的化合物，如γ-谷甾醇（31.882%）、二十一烷（19.953%）、亚麻酸（16.279%）、三十六烷（15.939%）、棕榈酸（13.80%）、亚麻酸乙酯（8.766%）等。CO₂超临界萃取的神香草全草挥发油具有显著的抗炎、止咳、祛痰作用并能显著降低哮喘大鼠BALF中Eos、TGF-β1水平及肺组织TGF-β1水平，能够改善肺组织炎症情况。

本发明采用CO₂超临界萃取神香草全草挥发油，与水蒸气蒸馏提取神香草全草挥发油相比，用CO₂超临界萃取神香草全草挥发油成分耗时少，收得率高5%以上（水蒸气蒸馏的收率在0.7%左右），提取的成分也多，经GC-MS解析，超临界萃取法能将所需的有效成分提取出来。而且用CO₂超临界萃取神香草全草挥发油防止挥发油氧化、热解以及提高挥发油的品质，且提取的挥发油无有机试剂，无毒副作用，可以直接用于食品、医药等领域。

发明内容

本发明的目的在于：提供神香草全草挥发油，具有显著的抗炎、止咳、祛痰作用，可作为制备抗炎、止咳、祛痰及平喘产品的原料或作为肺炎、哮喘及调节呼吸系统功能的制剂的组成成分配伍。

本发明的目的是这样实现的：一种用CO₂超临界萃取神香草全草挥发油的方法，按步骤进行：

a、将神香草全草洗净、晾干、经粉碎机粉碎，过20-40目筛，得到神香草全草粉末；

b、接通超临界萃取设备电源，打开冷循环及加热开关，设定萃取缸温度为35-50℃，分离缸Ⅰ温度为35℃，分离缸II温度为35℃，其CO₂流量2L/min；

c、将神香草全草粉末放入萃取缸中，启动CO₂循环系统，调节萃取缸压力为15-25MPa，分离缸Ⅰ压力为5MPa,分离缸II的压力为5MPa；

d、用无水乙醇作为夹带剂，其用量占加料量的25-75%；

e、待萃取缸、分离缸Ⅰ和分离缸II的温度及压力达到b、c设定值时，开始记录时间，其中萃取时间为60-120min；

f、萃取结束，从分离缸Ⅰ和分离缸II放料，即得到神香草全草挥发油。

本产品的用途,获得的神香草全草挥发油作为制备抗炎、止咳、祛痰及平喘产品的原料或作为制备治疗肺炎、哮喘及调节呼吸系统功能食品、保健品的组成成分配伍。

本发明的作用机理：用CO₂超临界萃取神香草全草中挥发油的制备工艺简单、萃取效率高、无残留，节约能耗的优点。本发明提供的神香草全草挥发油，进行支气管哮喘相关的药理实验，结果表明，发明提供的神香草全草挥发油具有显著的抗炎、止咳、祛痰作用并能显著降低哮喘大鼠BALF中Eos、TGF-β1水平及肺组织TGF-β1水平，能够改善肺组织炎症情况等功效。采用该方法提取率达到5%以上，可规模生产，彰显技术进步。

具体实施方式

本发明结合实施例作进一步说明。

实施例1

1）神香草全草的预处理

将神香草全草洗净、常温干燥、切段，经粉碎机粉碎后过20目筛，得到神香草全草粉末。

称取500g神香草全草粉末，加入占加料量75%的无水乙醇，置于5L的萃取釜中，装好密封圈，旋紧堵头，当超临界CO₂设定参数与实验参数相一致时，即萃取压力20MPa，萃取温度40℃，分离缸Ⅰ压力5MPa，分离缸II的压力5MPa，分离缸Ⅰ温度30℃，分离缸II温度35℃，CO₂流量2L/min开始萃取，并同开始计时。

2）神香草全草挥发油的分离

上步1）神香草全草开始萃取，每间隔30min从分离缸Ⅰ和分离缸II放料口放出挥发油，120min的萃取结束，即得神香草全草挥发油，其萃取率为5.5%，萃取的神香草全草挥发油为深棕红色，具有香味。

实施例2

1）神香草全草的预处理

称取500g神香草草全草粉末，加入占加料量75%的无水乙醇，置于5L的萃取釜中，装好密封圈，旋紧堵头，当超临界CO₂设定参数与实验参数相一致时，即萃取压力15MPa，萃取温度45℃，分离缸Ⅰ压力5MPa，分离缸II的压力5MPa，分离缸Ⅰ温度30℃，分离缸II温度35℃，CO₂流量2L/min开始萃取，并同开始计时。

2）神香草全草挥发油的分离

上步1）神香草全草开始萃取，每间隔30min从分离缸Ⅰ和分离缸II放料口放出挥发油，90min的萃取结束，即得神香草全草挥发油，其萃取率为5.1%，萃取的神香草全草挥发油为深棕红色，具有香味。

实施例3

1）神香草全草的预处理

取500g神香草草全草粉末，加入占加料量70%的无水乙醇，置于5L的萃取釜中，装好密封圈，旋紧堵头，当超临界CO₂设定参数与实验参数相一致时，即萃取压力15MPa，萃取温度50℃，分离缸Ⅰ压力5MPa，分离缸II的压力5MPa，分离缸Ⅰ温度30℃，分离缸II温度35℃，CO₂流量2L/min开始萃取，并同开始计时。

2）神香草全草挥发油的分离

上步1）神香草全草开始萃取，每间隔30min从分离缸I和分离缸II放料口放出挥发油，90min的萃取结束后，即得神香草全草挥发油，其萃取率为5.0%，萃取的神香草全草挥发油为深棕红色，具有香味。

本发明选用的SFE221-50-06型超临界流体萃取装置，由南通华兴石油仪器有限公司生产。

本发明方法获取神香草全草挥发油的药效学实验验证，具有良好的抗炎、止咳、祛痰、平喘作用，能明显降低哮喘模型大鼠肺泡灌洗液（BLAF）TFG-β1水平、细胞总数及Ly、Eos、Neu百分率，明显改善肺组织病理学改变。

1）神香草全草挥发油对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（抗炎作用）

取昆明种小鼠50只，体重（20士2）g，雌雄各半，随机分成5组：空白对照组（0.9%生理盐水），阳性对照组（急支糖浆，5.0g/kg）、神香草全草挥发油高剂量组（2.7g/kg）、神香草全草总挥发油中剂量组（1.35g/kg）、神香草全草挥发油低剂量组（0.675g/kg）；灌胃给药1次/日，连续7d，灌胃体积均为0.2mL/10g，末次给药后30min，各组小鼠均在小鼠右耳前、后面均匀涂二甲苯20μL致炎，1h后颈椎脱臼处死小鼠，沿耳廓基线剪下两耳，用直径9mm打孔器分别在两耳的同一部位打下圆耳片，精密称重，以左右耳重量差为肿胀度，以此判断神香草全草挥发油对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响；

耳肿胀度（mg）=右耳片重—左耳片重；

肿胀抑制率（%）=【（空白对照组平均肿胀度—给药组平均肿胀度）/空白对照组平均肿胀度】×100%；

实验结果，致炎后各组小鼠右耳立刻出现高度红肿现象，阳性对照组和三个不同剂量的神香草全草挥发油给药组对二甲苯所致的小鼠耳肿胀均有明显抑制作用（P<0.05），三个不同剂量的神香草全草挥发油给药组肿胀抑制率呈明显的剂量依赖关系，抑制作用随剂量的增加而增加（P<0.05），见表1。

表1神香草全草挥发油对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，与阳性对照组比较，#P＜0.05，与神香草全草挥发油各剂量组之间组比较△P＜0.05。

实验结果验证，在以血管通透性增加为主要改变的急性炎症模型实验中，神香草全草挥发油能显著抑制二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀炎症反应，说明神香草全草挥发油具有抗炎作用。

2）神香草全草挥发油对浓氨水致小鼠咳嗽反应的影响（止咳作用）

取昆明种小鼠50只，体重（20士2）g，雌雄各半，随机分成5组：空白对照组（0.9%生理盐水），阳性对照组（急支糖浆，5.0g/kg）、神香草全草挥发油高剂量组（2.7g/kg）、神香草全草挥发油中剂量组（1.35g/kg）、神香草全草挥发油低剂量组（0.675g/kg）；灌胃给药1次/日，连续7d，灌胃体积均为0.2mL/10g，末次给药后lh，将小鼠逐一放入4L密闭干燥容器内，恒压喷入25%浓氨水气雾，喷雾5s引咳，观察其咳嗽潜伏期及2min内咳嗽次数；

实验结果，阳性对照组和三个不同剂量的神香草全草挥发油给药组对浓氨水致小鼠咳嗽反应有明显的抑制作用，能延长小鼠咳嗽反应的潜伏期（P<0.05），并减少咳嗽次数（P<0.05），三个不同剂量的神香草全草挥发油给药组止咳作用呈明显的剂量依赖关系（P<0.05），见表2。

表2神香草全草挥发油对氨水引咳的影响

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，与阳性对照组比较，#P＜0.05，与各剂量组之间组比较△P＜0.05。

实验结果验证，神香草全草挥发油能显著抑制浓氨水喷雾引起的小鼠咳嗽反应及延长咳嗽潜伏期，提示神香草全草挥发油作用于有关化学感受器,抑制支气管粘膜对刺激的反应性而表现出镇咳作用。

3）神香草全草挥发油对小鼠气管段酚红排泌量的影响（祛痰作用）

取昆明种小鼠50只，体重（20士2）g，雌雄各半，随机分成5组：空白对照组（0.9%生理盐水），阳性对照组（急支糖浆，5.0g/kg）、神香草全草挥发油高剂量组（2.7g/kg）、神香草全草挥发油中剂量组（1.35g/kg）、神香草全草挥发油低剂量组（0.675g/kg）；灌胃给药1次/日，连续7d，灌胃体积均为0.2mL/10g，最后一次给药后30min，每只小鼠腹腔注射5%酚红生理盐水溶液0.2mL/20g体重，30min后处死小鼠，仰位固定，颈部拉直，解剖分离出气管，将各气管段放入预先盛有1.5mL5%NaHCO₃溶液的试管中，超声波清洗，使气管段中的酚红完全释放，清洗液离心，取上清液于分光光度计546nm处比色，测定OD值，与酚红标准曲线比较，折算成酚红含量，根据酚红含量和动物体重计算出校正酚红含量；

实验结果，阳性对照组和三个不同剂量的神香草全草挥发油给药组能明显提高小鼠呼吸道酚红排泌量（P<0.05），三个不同剂量的神香草全草挥发油给药组祛痰作用呈明显的剂量依赖关系（P<0.05），见表3。

表3神香草全草挥发油对小鼠气管段酚红排泄量的影响

注：对空白照组比较，*P＜0.05，与阳性对照组比较，#P＜0.05，与各剂量组之间组比较△P＜0.05。

实验结果验证，神香草全草挥发油能显著促进小鼠气管段酚红排泄量，提示神香草全草挥发油具有明显的祛痰作用。

4)神香草全草挥发油对哮喘大鼠气道炎症细胞和肺组织及BALF中TFG-β1的影响（气道炎症细胞和转化生长因子β1抑制作用）

雄性健康Wistar大鼠60只，4～6周龄，体重（200士20）g，随机分成5组：空白对照组（0.9%生理盐水），阳性对照组（氨茶碱0.1g/kg）、神香草全草挥发油高剂量组（2.7g/kg）、神香草全草挥发油中剂量组（1.35g/kg）、神香草全草挥发油低剂量组（0.675g/kg）；除正常组外，各组大鼠于实验第1天腹腔注射1mL抗原液（含10mg OVA，100mg Al(OH)₃，5×10⁹个百白破疫苗）以初次致敏，实验第8天重复一次以加强致敏。正常对照组以等量灭菌生理盐水代替。从实验第15天开始，每天一次将大鼠置于密闭玻璃钟罩，以10%OVA生理盐水雾化吸入20min以激发引喘（正常对照组以生理盐水代替），实验第22天，最后一次雾化吸入后24h内，各组大鼠腹腔注射10%的水合氯醛0.3mL/100g以麻醉，迅速开胸，暴露气管和双肺，从甲状软骨处上方剪开一V形缺口，插入磨平的针头，用备好的丝线结扎固定，再用注射器吸取冷藏5%生理盐水3mL，立即回抽，收集灌洗液（BALF），灌洗3次，回收的BALF以4℃，2000r/min离心10min，分离上清液及沉淀物，分别放于-4℃冰箱内保存，上清液，用于测定BALF中的TFG-β1水平，离心后沉淀物用于炎症细胞计数和分类，取左肺组织放于液氮中保存，用于测定肺组织中的TFG-β1水平。

将离心后沉淀物，用100uL10%小牛血清-PBS重悬细胞，吸取0.1mL置于细胞计数板上，在显微镜下计数细胞总数。吸取0.01mL涂片，制作3张涂片，瑞氏染色后，进行细胞分类计数，测定细胞总数及Ly、Eos、Neu的百分比。

将肺组织和BALF离心上清液，严格按照大鼠转化生长因子β1(TFG-β1)ELISA试剂盒说明,分别检测各组哮喘大鼠肺组织和肺泡灌洗液（BALF）中的TFG-β1水平。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样各组大鼠肺组织和肺泡灌洗液（BALF）中TFG-β1浓度。

①对哮喘大鼠气道炎症细胞的影响实验结果，阳性对照组和三个不同剂量的神香草全草挥发油给药组能明显降低BALF中的细胞总数及Ly、Eos、Neu百分率（P<0.05），三个不同剂量的神香草全草挥发油给药组气道炎症细胞抑制作用呈明显的剂量依赖关系（P<0.05），见表4。

表4BALF中的细胞总数及各种炎症细胞的百分率比较

注：对正常照组比较，*P＜0.05，与阳性对照组比较，#P＜0.05，与各剂量组之间组比较△P＜0.05。

实验结果验证，神香草全草挥发油能显著降低哮喘大鼠BALF中的细胞总数及Ly、Eos、Neu百分率，提示神香草全草挥发油具有明显的气道炎症细胞抑制作用。

②对哮喘大鼠肺组织和BLAF中的TFG-β1水平的影响实验结果，阳性对照组和三个不同剂量的神香草全草挥发油给药组能明显降低哮喘大鼠肺组织及BALF中的TFG-β1的水平（P<0.05），三个不同剂量的神香草全草挥发油给药组降低哮喘大鼠肺组织及BALF中的TFG-β1的水平呈明显的剂量依赖关系（P<0.05），见表5。

表5神香草全草挥发油对肺组织和BLAF中的TFG-β1水平的影响

实验结果验证，神香草全草挥发油能显著降低哮哮喘大鼠肺组织及BALF中的TFG-β1的水平，提示神香草全草挥发油具有明显的转化生长因子β1抑制作用。

Claims

1.一种用CO₂超临界萃取神香草全草挥发油的方法及其用途，其特征在于：方法按步骤进行：

b、接通超临界萃取设备电源，打开冷循环及加热开关，设定萃取缸温度为35-50℃，分离缸Ⅰ温度为35℃，分离缸Ⅱ温度为35℃，其CO₂流量2L/min；

c、将神香草全草粉末放入萃取缸中，启动CO₂循环系统，调节萃取缸压力为15-25MPa，分离缸Ⅰ压力为5MPa,分离缸Ⅱ的压力为5MPa；

d、用无水乙醇作为夹带剂，其用量占加料量的25-75%；

e、待萃取缸、分离缸Ⅰ和分离缸Ⅱ的温度及压力达到b、c设定值时，开始记录时间，其中萃取时间为60-120min；

f、萃取结束，从分离缸Ⅰ和分离缸Ⅱ放料，即得到神香草全草挥发油。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：获得的神香草全草挥发油作为制备抗炎、止咳、祛痰及平喘产品的原料或作为制备治疗肺炎、哮喘及调节呼吸系统功能食品、保健品的组成成分。