CN104950033B - 一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法 - Google Patents
一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104950033B CN104950033B CN201510312617.1A CN201510312617A CN104950033B CN 104950033 B CN104950033 B CN 104950033B CN 201510312617 A CN201510312617 A CN 201510312617A CN 104950033 B CN104950033 B CN 104950033B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bath
- microelectrophoresis
- cell
- dna
- frustule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法。包括单细胞凝胶电泳试剂的配制、微电泳槽的制作、绿藻细胞的样品制备方法和单细胞凝胶电泳步骤改进与优化。微电泳槽的制作采用普通的光滑载玻片，并通过载玻片表面改性，使所铺制的凝胶只有一层，与传统样品制备载玻片上要铺制三层凝胶以及随后的改进型两层凝胶工艺相比，具有样品制备工艺简单、成功率高、易于操作、背景荧光值低、样品图像清晰和实验成本低等优点。基于绿藻细胞具有细胞壁的特点，改进了细胞裂解步骤的条件；根据不同类型的DNA损伤形式，加入相应的核酸内切酶进行酶解的步骤，使得绿藻细胞内的损伤的核DNA更易在电场作用下发生迁移，使实验成功率发生显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及单细胞检测技术，特别提供了一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法。
背景技术
单细胞凝胶电泳又称彗星实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单、双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越小，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。
尽管单细胞凝胶电泳具有较高的灵敏度和优越性，以往利用该方法检测浮游藻细胞DNA损伤时也存在诸多问题。Erbes等人于1997年第一次将单细胞凝胶电泳运用于基因毒性化合物引起的单细胞绿藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的DNA损伤(Erbes etal.,1997)。该方法通过对Singh等人(1988)的实验流程进行改进，主要改动是利用含有离子型去污剂的碱性裂解液和缩短碱解旋和电泳的时间。不幸的是，该方法在Erbes等人报道之后再无人报道(Panáková,2001)。等人对该现象进行了推测，认为利用该方法对莱茵衣藻的DNA损伤进行检测存在如下一些技术难点：(1)细胞壁的存在导致细胞裂解效率低下的问题；(2)在细胞核周围存在物理或生物屏障，使得产生“彗星”拖尾现象发生率低；(3)存在“彗星”图像观察和DNA损伤定量的困难(et al.,2004)。
发明内容
本发明的目的是克服单细胞凝胶电泳在浮游藻细胞DNA损伤检测方面的障碍，提供了一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法，该方法特别适用于淡水绿藻细胞，方法简单，结果清晰，线性关系良好。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法，包括以下步骤：
1)微电泳槽的制作和表面改性：用玻璃刀沿光滑载玻片的宽将载玻片划成20～25个25mm×3mm×1mm(长×宽×厚)的窄条。然后将这些窄条用中性玻璃胶(包含3％～5％硅酸钠)贴到干净的光滑载玻片上，围成正方形小槽，即为微电泳槽。微电泳槽的表面改性采用镀膜法，即微电泳槽在2g/L的(常规分析用)正常熔点琼脂糖浸没1min后，置37℃孵箱烘烤2～12h。
2)原生质体的制备：将藻培养液离心，去上清液，藻细胞悬浮于酶解液中(使藻细胞密度约为107个/mL)，25℃避光保温1.5h。1000×g离心1min，然后用同体积0.55mol/L甘露醇洗涤一次，再次离心(1000×g，1min)后轻柔悬浮于0.55mol/L甘露醇中。
所述的酶解液为0.55mol/L甘露醇加入20g/L纤维素酶和10g/L离析酶，pH 5.8。
3)包埋细胞：将悬浮于甘露醇中的细胞与熔化的低熔点琼脂糖(浓度是7.5～10g/L)混匀，使100μL低熔点琼脂糖凝胶中含有4000～5000个细胞，平铺于微电泳槽中；
4)细胞裂解：将包埋好藻细胞的微电泳槽放在表面皿中，加入藻细胞裂解液，液面没过微电泳槽，4℃避光裂解1～2h。
所述的细胞裂解液为2.5mol/L NaCl，100mmol/L EDTA，10mmol/L Tris，pH 10，1％(V/V)Triton X-100，10％(V/V)DMSO。
5)酶解：利用特异性识别DNA损伤并将受损的DNA切割成DNA断片的核酸内切酶按1:103～1:104倍数进行稀释，37℃酶解30～45min。优选的，对于氧化胁迫造成的DNA损伤，嘌呤碱基氧化损伤可用甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(FPG酶)检测，嘧啶碱基氧化损伤可用核酸内切酶III(Nth酶)检测，对UV造成的cis-syn型环丁烷嘧啶二聚体DNA损伤可用T4核酸内切酶V(T4PDG酶)检测。
6)碱解旋：将包埋有藻细胞的微电泳槽置于碱性电泳液中4℃解旋20～40min。
所述的碱性电泳液的配方为：300mmol/L NaOH，1mmol/L Na2EDTA，pH 13。
7)电泳，中和，干燥和染色，拍照与结果分析。
以上所述的步骤中，具体的，步骤7)中，电泳为冷水浴，在碱性解旋液中电泳50min，电压30～35V，电流200～300mA；中和步骤利用0.4mol/L Tris buffer，pH 7.4，室温(20～25℃，以下相同)下中和三次，每次10min；37℃烘干。染色利用2μg/mL碘化丙啶PI染液，避光染色10～15min。以上所述的方法，优选的用于淡水绿藻细胞。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和效果：
(1)微电泳槽的制作采用普通的光滑载玻片，避免了磨砂载玻片背景荧光干扰的缺点，使所得的荧光图像具有背景荧光值低、样品图像清晰的特点。
(2)通过对微电泳槽表面改性，使所铺制的凝胶只有一层，与传统样品制备要铺制三层凝胶以及随后的改进型两层凝胶工艺相比，具有样品制备工艺简单、成功率高、易于操作和实验成本低等优点。
(3)根据绿藻细胞具有细胞壁的特点，增加了去除绿藻细胞壁的步骤，并改进了细胞裂解步骤的条件；同时根据不同类型的DNA损伤形式，加入相应的核酸内切酶进行酶解的步骤，使得绿藻细胞内的损伤的核DNA更易在电场作用下发生迁移，使实验成功率发生显著提高。(4)利用硅酸钠为主要成分的中性玻璃胶，实现了玻璃窄条在光滑载玻片上的永久固定。
附图说明
图1为采用本发明方法对不同时间高压汞灯辐射作用下，蛋白核小球藻细胞的T4PDG-单细胞凝胶电泳荧光图像。
其中，高压汞灯(high voltage mercury lamp，HVML)辐射强度为49±0.8μmol/m2/s，照射10s，30s，1min，3min。阳性对照，太阳光(solar light，SL)辐射816±20μmol/m2/s下照射30s。
表1为采用本发明方法对不同时间高压汞灯辐射作用下，DNA损伤的蛋白核小球藻细胞的T4PDG-单细胞凝胶电泳参数分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法：
1)微电泳槽的制作和表面改性：用玻璃刀沿光滑载玻片的宽将载玻片划成20～25个25mm×3mm×1mm(长×宽×厚)的窄条。然后将这些窄条用中性玻璃胶(包含3％～5％硅酸钠)贴到干净的光滑载玻片上，围成正方形小槽，即为微电泳槽。微电泳槽的表面改性采用镀膜法，即微电泳槽在2g/L的(常规分析用)正常熔点琼脂糖浸没1min后，置37℃孵箱烘烤2h。
2)原生质体的制备：
(1)UV暴露：培养至第6天蛋白核小球藻细胞，直径9cm的培养皿中加入10mL藻液(藻细胞密度为107个/mL)。藻细胞距125W高压汞灯10cm处(光量子强度为49±0.8μmol/m2/s)照射0，10s，30s，1min，3min；太阳光816±20μmol/m2/s下直射30s。
(2)蛋白核小球藻原生质体的制备：用0.55mol/L甘露醇加入20g/L纤维素酶和10g/L离析酶，pH 5.8的酶解液降解细胞壁。将培养液中的细胞离心，去上清液悬浮于酶解液(使藻细胞密度为107个/mL)中，25℃避光保温1.5h。1000×g离心1min，然后用同体积0.55mol/L甘露醇洗涤一次，再次离心(1000×g，1min)后轻柔悬浮于0.55mol/L甘露醇中(使藻细胞密度为106个/mL)。
(3)细胞的包埋：95μL 7.5g/L低熔点琼脂糖凝胶和5μL藻细胞原生质体的混合液，使100μL低熔点琼脂糖凝胶中含有4000～5000个细胞，混合均匀后铺于微电泳槽内。
(4)细胞裂解：将包埋好藻细胞的微电泳槽放在表面皿中，加入藻细胞裂解液，液面没过微电泳槽，4℃避光裂解1.5h。
所述的细胞裂解液为2.5mol/L NaCl，100mmol/L EDTA，10mmol/L Tris，pH 10，1％(V/V)Triton X-100，10％(V/V)DMSO。
(5)酶解：用T4PDG酶缓冲液2mL漂洗微电泳槽3次，每次5min；加入T4PDG酶使其终浓度为2U/mL，37℃酶解30min。
(6)碱解旋：将微电泳槽置于碱性电泳液(300mmol/L NaOH，1mmol/L Na2EDTA，pH13)中4℃解旋30min。
(7)电泳：冷水浴，在碱性解旋液中电泳50min，电压30～35V，电流200～300mA；可通过调节电泳缓冲液的高度来调节电流电压。微电泳槽直接放在水平电泳槽里，一定要放直，和边缘靠齐。往电泳仪里倒电泳液的时候，也要注意，防止电泳液把微电泳槽冲歪。
(8)中和：电泳完后将微电泳槽置于表面皿内，加入中和液(0.4mol/L Trisbuffer，pH7.4)使微电泳槽完全没入中和液中，室温下中和三次，每次10min。
(9)干燥与染色：微电泳槽中和后置于37℃30min干燥。每微电泳槽加100μL的2μg/mL碘化丙啶PI染液，避光染色10～15min。然后用双蒸水温柔冲去多余染液，滤纸吸去多余水分，37℃烘干。
(10)拍照与结果分析：利用激光共聚焦显微镜(放大500倍，物镜EC PlnN40×/0.75DICII)和Zen Light Edition软件系统观察藻细胞的彗星荧光图像。PI-DNA复合物的荧光由氩离子激光器(4.5mW)的514nm激光激发，发射光由566～719nm的光电倍增管(PMT)检测。PMT电压设定为980V。同时获取明场图像，明场PMT电压设定为205V。每张图片的实际尺寸为212.3μm×212.3μm。PI染色的DNA图象呈桔红色，通过荧光显微镜可清楚地观察到核DNA和迁移的DNA(即彗星尾)。
每个样本随机选择100个细胞，用彗星分析软件(Comet Assay SoftwareProject,CASP)进行分析，并给出结果。
如图1所示，本实施例的T4PDG-单细胞凝胶电泳图像显示清晰，样品的荧光强度与背景之间具有较高的对比度。损伤的DNA在电场作用下脱离细胞核形成典型的“彗星”状拖尾图像，且显示清晰。利用CASP软件对各处理组的细胞荧光图像进行分析，得到的彗星参数主要有：尾距(Tail Moment)、Olive尾距(Olive Tail Moment)、彗星尾部DNA百分比(TailDNA％)和尾长(Tail Length)。通过对这些参数的统计分析，得到在不同时间高压汞灯辐射条件下，蛋白核小球藻细胞的DNA损伤程度。如表1所示，数据表明，蛋白核小球藻细胞的DNA损伤与辐射时间之间呈现出良好的剂量-效应关系。
表1
Claims (4)
1.一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法，包括以下步骤：
1)微电泳槽的制作和表面改性：用玻璃刀沿光滑载玻片的宽将载玻片划成20～25个25mm×3mm×1mm的窄条；然后将这些窄条用中性玻璃胶贴到干净的光滑载玻片上，围成正方形小槽，即为微电泳槽；微电泳槽的表面改性采用镀膜法，即微电泳槽在2g/L的正常熔点琼脂糖浸没1min后，置37℃孵箱烘烤2～12h；
2)原生质体的制备：将藻培养液离心，去上清液，藻细胞悬浮于酶解液中，使藻细胞密度为107个/mL，25℃避光保温1.5h；1000×g离心1min，然后用同体积0.55mol/L甘露醇洗涤一次，再次离心后轻柔悬浮于0.55mol/L甘露醇中；
所述的酶解液为0.55mol/L甘露醇加入20g/L纤维素酶和10g/L离析酶，pH 5.8；
3)包埋细胞：将悬浮于甘露醇中的细胞与熔化的浓度是7.5～10g/L低熔点琼脂糖混匀，使100μL低熔点琼脂糖凝胶中含有4000～5000个细胞，平铺于微电泳槽中；
4)细胞裂解：将包埋好藻细胞的微电泳槽放在表面皿中，加入藻细胞裂解液，液面没过微电泳槽，4℃避光裂解1～2h；
所述的细胞裂解液为2.5mol/L NaCl，100mmol/L EDTA，10mmol/L Tris，pH 10，1％Triton X-100，10％DMSO；
5)酶解：利用特异性识别DNA损伤并将受损的DNA切割成DNA断片的核酸内切酶按1:103～1:104倍数进行稀释，37℃酶解30～45min；
6)碱解旋：将包埋有藻细胞的微电泳槽置于碱性电泳液中4℃解旋20～40min；
7)电泳，中和，干燥和染色，拍照与结果分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述的中性玻璃胶为包含3％～5％硅酸钠的中性玻璃胶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5)中，所述的DNA损伤，嘌呤碱基氧化损伤用甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶检测，嘧啶碱基氧化损伤用核酸内切酶III检测，UV造成的cis-syn型环丁烷嘧啶二聚体DNA损伤用T4核酸内切酶V检测。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤6)中，所述的碱性电泳液的配方为：300mmol/L NaOH，1mmol/L Na2EDTA，pH 13。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510312617.1A CN104950033B (zh) | 2015-06-08 | 2015-06-08 | 一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510312617.1A CN104950033B (zh) | 2015-06-08 | 2015-06-08 | 一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104950033A CN104950033A (zh) | 2015-09-30 |
| CN104950033B true CN104950033B (zh) | 2017-04-19 |
Family
ID=54164846
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510312617.1A Active CN104950033B (zh) | 2015-06-08 | 2015-06-08 | 一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104950033B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106018529B (zh) * | 2016-07-07 | 2019-03-12 | 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 | 一种单细胞凝胶电泳检测细胞dna损伤的方法 |
| KR102141496B1 (ko) | 2018-04-27 | 2020-08-06 | 한국화학연구원 | 투명화된 거대조직의 면역염색용 조성물 및 이를 이용한 투명화된 거대 생체 조직의 면역염색 방법 |
| CN109306370A (zh) * | 2018-09-26 | 2019-02-05 | 浙江海洋大学 | 纳米材料胁迫下桡足类dna损伤的检测方法 |
| CN111474231A (zh) * | 2019-01-23 | 2020-07-31 | 天津师范大学 | 利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体dna损伤程度的方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101570785A (zh) * | 2009-06-10 | 2009-11-04 | 南京大学 | 一种检测水体中有机污染物潜在遗传毒性的方法 |
| CN101838700A (zh) * | 2010-05-28 | 2010-09-22 | 中国海洋大学 | 一种浮游植物群落结构的检测方法 |
| CN101892310A (zh) * | 2010-05-28 | 2010-11-24 | 中国海洋大学 | Dgge技术在检测浮游植物群落结构中的使用方法 |
| CN101975814A (zh) * | 2010-10-11 | 2011-02-16 | 国家海洋局第一海洋研究所 | 海水中有机污染物潜在遗传毒性的检测方法 |
| CN103740826A (zh) * | 2014-01-08 | 2014-04-23 | 南京大学 | 一种检测土壤中重金属污染物潜在遗传毒性的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102004046364A1 (de) * | 2004-09-24 | 2006-03-30 | Intox Gmbh | Verfahren zur Bestimmung von DNA- Schäden und Vielkammer-Behälter |
-
2015
- 2015-06-08 CN CN201510312617.1A patent/CN104950033B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101570785A (zh) * | 2009-06-10 | 2009-11-04 | 南京大学 | 一种检测水体中有机污染物潜在遗传毒性的方法 |
| CN101838700A (zh) * | 2010-05-28 | 2010-09-22 | 中国海洋大学 | 一种浮游植物群落结构的检测方法 |
| CN101892310A (zh) * | 2010-05-28 | 2010-11-24 | 中国海洋大学 | Dgge技术在检测浮游植物群落结构中的使用方法 |
| CN101975814A (zh) * | 2010-10-11 | 2011-02-16 | 国家海洋局第一海洋研究所 | 海水中有机污染物潜在遗传毒性的检测方法 |
| CN103740826A (zh) * | 2014-01-08 | 2014-04-23 | 南京大学 | 一种检测土壤中重金属污染物潜在遗传毒性的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104950033A (zh) | 2015-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104950033B (zh) | 一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法 | |
| Moyes et al. | Differential staining of bacteria: gram stain | |
| Ino et al. | Local redox‐cycling‐based electrochemical chip device with deep microwells for evaluation of embryoid bodies | |
| CN102580794B (zh) | 可定位细胞及生物体的微流控芯片及其应用 | |
| Fine et al. | [127] The use of starch electrophoresis in dehydrogenase studies | |
| Wang et al. | A Photoelectrochemical Nanoreactor for Single‐Cell Sampling and Near Zero‐Background Faradaic Detection of Intracellular microRNA | |
| CN105039153B (zh) | 一种硅基阵列微反应池数字pcr芯片及其制备方法 | |
| CN101570785A (zh) | 一种检测水体中有机污染物潜在遗传毒性的方法 | |
| CN105021575A (zh) | 基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器 | |
| CN103276048A (zh) | 一种简便、快速检测细胞dna损伤的样品制备方法及施用于该方法的试剂盒 | |
| Karbaschi et al. | Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay | |
| Bulychev et al. | Long-distance signal transmission and regulation of photosynthesis in characean cells | |
| Gautam et al. | Kinetics of leukocyte‐induced changes in endothelial barrier function | |
| Magome et al. | Photo-control of excitation waves in cardiomyocyte tissue culture | |
| Zhang et al. | A modified protocol for the comet assay allowing the processing of multiple samples | |
| Van Gisbergen et al. | Microinjecting FM4–64 validates it as a marker of the endocytic pathway in plants | |
| Zhang et al. | Creation of an ethanol-tolerant Saccharomyces cerevisiae strain by 266 nm laser radiation and repetitive cultivation | |
| Bodénès et al. | Microdevice for studying the in situ permeabilization and characterization of Chlamydomonas reinhardtii in lipid accumulation phase | |
| TW201416437A (zh) | 奈米電極晶片 | |
| Eynard et al. | Electrooptics studies of Escherichia coli electropulsation: orientation, permeabilization, and gene transfer | |
| Hewapathirane et al. | Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain | |
| Maghasi et al. | Spectroelectrochemical sensing based on attenuated total internal reflectance stripping voltammetry. 2. Determination of mercury and lead | |
| Simonis et al. | Mediated amperometry as a prospective method for the investigation of electroporation | |
| CN103760137B (zh) | 细胞dna损伤检测方法 | |
| CN102146455A (zh) | 一种细胞dna损伤检测试剂盒及其检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |