TW201416437A - 奈米電極晶片 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種奈米電極晶片，可應用於使單一細胞之細胞膜局部電穿孔以讓微流體物質進入單一細胞。奈米電極晶片包含矽基層、結構層、絕緣層以及微流體層。當單一細胞被放置於已產生至少一電場之複數個奈米電極間之孔隙上，電場作用於單一細胞，使單一細胞之細胞膜局部電穿孔以產生複數個奈米小孔，隨後，微流體物質(例如藥物、DNA分子等)將可經由小孔流入單一細胞內。此發明不僅能夠有效、精準地控制細胞膜上小孔的尺寸，同時也可清晰地提供後續追蹤微流體物質進入單一細胞中所需光學觀測的路徑。

Description

奈米電極晶片

本發明係關於一種電極晶片之領域，特別是利用遠小於待測單一細胞尺寸之電極間距，以對單一細胞進行局部電穿孔，用以達成提高藥物傳輸且不破壞細胞本體的結構之目的之奈米電極晶片。

藥物傳輸是生物醫學技術裡的一項重要技術。而與其相關的基因傳輸技術包括了多種不同的方法與手段。傳統的病毒轉染(viral transfection)雖然係現今普為接受、有效的傳輸技術方法之一，然而其可能造成的病人的免疫性反應、低控制率等問題，使得這項技術還有可成長的空間。

此外，一般用於基因傳輸的非病毒轉染方法包括射流噴注(jet injection)、脂體轉輸(lipid mediated entry into cells)、超音波震盪(sonoporation)、或電穿孔法(electroporation)。傳統的電氣穿孔法有可能造成細胞膜融合、損壞的問題，無法有效且快速地傳送基因或藥物到細胞體內。另外，傳統的方法在極性方向難以控制，無法有效控制基因或藥物的注射位置。

因此，一項非病毒轉染的基因或藥物傳輸系統就成為近年來研究發展的主要課題，其中包括了高電壓脈衝的電氣穿孔法。傳統上的技術多為使用兩顆大型電極產生AC/DC脈衝，再組合細胞膜的結構而產生開口，然而此些方法往往會造成具有開口的細胞膜的可逆性消失、結構崩解等問題。

據此，提供一種應用電極細胞穿孔晶片於單一細胞局部藥品釋放之方法，用以達成提高局部藥物傳輸而又不破壞細胞本體的結構之目的，是迫切需要的。

有鑑於上述習知技藝之問題，本發明之目的就是在提供一種奈米電極晶片，係用以解決習知技藝於細胞電穿孔時，往往造成具有開口的細胞膜的可逆性消失、細胞膜結構崩解，而導致藥物無法準確地送入細胞之問題。

本發明之奈米電極晶片包含矽基層、結構層、絕緣層以及微流體層。矽基層上沉積有結構層，且結構層上沉積有複數個電極，複數個電極間具有貫穿結構層之至少一孔隙；絕緣層沉積於電極上方，絕緣層具有貫穿絕緣層之孔隙；微流體層設置有複數個通孔，複數個通孔之其中一部分與孔隙連通。其中，當單一細胞被放置於已產生至少一電場之複數個電極間之孔隙上，電場作用於單一細胞，使單一細胞之細胞膜局部電穿孔以產生複數個小孔，流入複數個通孔之其中一部分之微流體可通過複數個電極間之孔隙，以從該些小孔流入單一細胞。

值得注意的是，複數個電極間之孔隙尺寸為50奈米至1微米，較佳地可為50奈米至500奈米。

較佳地，微流體可於複數個通孔與孔隙之間流通。

較佳地，複數個電極可分別地施加正電壓及負電壓以產生至少一電場。

較佳地，複數個電極可為氧化銦錫電極。

較佳地，複數個電極可為三角形尖端之電極。

較佳地，絕緣層可為氧化矽層。

較佳地，微流體可藉由複數個通孔之至少一個與複數個通孔之至少另一個與至少一孔隙進行微流體之循環。

較佳地，矽基層之底部更可沉積有另一結構層、另一絕緣層及透光層。

較佳地，矽基層、另一結構層、另一絕緣層與透光層可界定具有至少一通孔之微流體腔室，以使微流體從複數個通孔進出微流體腔室。

承上所述，依本發明之奈米電極晶片，其可具有一或多個下述優點：

(1)本發明所提供之奈米電極晶片，可應用於提高局部藥物傳輸而又不破壞細胞本體的結構，以增加藥物傳輸之效率。

(2) 透過電極之間的電場強度控制，電穿孔方法可得到局部性更高的穿孔結果，而此電穿孔方法更可產生可逆性電穿孔過程以及產生可供追蹤藥物或DNA被傳遞進入細胞中的光學路徑。

以下將參照相關圖式，說明依本發明之奈米電極晶片之實施例，為使便於理解且簡潔描述，下列所述之任一實施例中之相同作用之相同元件係可以相同之元件符號標示來說明，或可以相同作用之元件於不同實施例中所採用之相似之元件符號來說明。於不同實施例中，代表相同元件符號之元件，其連結、作動及功效視為相同；應理解的是，相同的元件係具有相同的功效，為便於描寫，其功能將不再贅述，合先敘明。

請參閱第1圖，其係為本發明之奈米電極晶片之一實施例之第一示意圖。如圖所示，本發明之奈米電極晶片1包含矽基層10、結構層20、絕緣層50與微流體層60。結構層20沉積於矽基層10上且結構層20上沉積有複數個電極30，且複數個電極30間具有貫穿結構層20之至少一孔隙40。結構層20可為氮化矽層或其他類似性質的結構層，但不應以此為侷限。電極30可為氧化銦錫(indium tin oxide, ITO)電極或其他類似性質之電極材料，但不應以此為侷限。值得注意的是，複數個電極30間之孔隙40尺寸可為50奈米至1微米，較佳地可為50奈米至500奈米。其中，絕緣層50是沉積於電極30之上方。值得注意的是，電極30上所沉積之絕緣層50可為氧化矽層或其他類似性質的氧化層，但不應以此為侷限。微流體層60設置有複數個通孔100，且其中之一通孔70與孔隙40為相互連通。也就是說，如本實施例所設置之兩個通孔100，其中之一可用以注入新鮮的微流體90，另一個可用以排出使用後的微流體90，以使微流體90的循環更有效率。另一方面，微流體90也可藉由至少一通孔70及孔隙40之間之連通關係，以進行微流體90之循環，以確保微流體90之新鮮度，並可更有效率地利用微流體90。

此外，於本實施例中，當單一細胞80被放置於已產生至少一電場之複數個電極30之孔隙40上，電場作用於單一細胞80，使單一細胞80之細胞膜局部電穿孔以產生複數個小孔800，從其中一通孔100注入微流體90，流出通孔70之微流體90可通過電極30間之孔隙40，從小孔800進入單一細胞80。詳細的說，當微流體90從複數個通孔70中流出電極30間之孔隙40，進而通過單一細胞80之複數個小孔800，即可將微流體90中所包含之奈米分子材料、分子藥物、分子探針或其組合送入單一細胞80內，以進行後續觀察或實驗步驟。

值得注意的是，由於電極30間之孔隙40尺寸遠小於單一細胞80的尺寸，所以電極30間所產生之電場之作用範圍僅會作用於單一細胞80之小部分之細胞膜上，使其產生局部地電穿孔現象。因此，本發明之奈米電極晶片在細胞膜上所產生的小孔800，其為可逆反應，也就是說其並不會影響單一細胞80的主要整體結構。詳細的說，當微流體90進入單一細胞80經電穿孔後，其細胞膜上產生的小孔800時，若將實驗後之單一細胞80放置一段時間，其細胞膜上之小孔800將會癒合回復至原本的狀態，故稱為可逆反應。

此外，施加於複數個電極30之正電壓(+V)與負電壓(-V)所產生的電場可為脈衝形式給予，較佳地可為方波脈衝，更佳地可為單一正向方波脈衝。使用者可以透過調整電場脈衝的頻率、強度、持續時間，以控制單一細胞80上之複數個小孔800的數量、開孔大小、開孔密度等，用以配合使用者所欲送入單一細胞80的微流體90所包含之分子、藥物、探針或是生醫材料之大小。此外，在奈米等級的孔隙40內，複數個電極30所產生的電場脈衝可以被高度地集中，且電場脈衝的作用範圍也可被盡可能的縮小，以使對單一細胞80的傷害降至最低。

此外，本發明之奈米電極晶片1之微流體層60之底層更可包含透光層110，舉例但不局限於：玻璃層。採用透光層110的優勢在於，當微流體90所包含的分子藥物或材料在微流體層60中流動，或往單一細胞80流動時，可藉由外接之感測器(未繪示於圖中)從透光層110感測並接收奈米電極晶片1於作用時之各種信號，特別是光學信號，用以評估本發明之奈米電極晶片1於作用時之效果與速率。舉例來說，若是微流體90是包含有可放出螢光的物質，例如：碘化丙啶(propidium iodide, PI)。當微流體90帶有碘化丙啶進入單一細胞80後，碘化丙啶將會鑲嵌於單一細胞80之去氧核醣核酸(DNA)上，以積聚於單一細胞80內；且當單一細胞80之細胞膜上之小孔800癒合回復至原本的狀態時，碘化丙啶則會留在單一細胞內80。此時，外接之感測器即可感測到碘化丙啶於上述流動的過程中，從碘化丙啶發出之螢光訊號的改變，進而可以得到本發明之奈米電極晶片1之使用效果。

請參閱第2圖，其係為本發明之奈米電極晶片之電極排列之示意圖。如圖所示，本發明之奈米電極晶片1所包含之複數個電極30可以為三角型尖端之設計且其排列可以為放射狀、同心圓形狀或陣列式排列等，為使便於描述，於本實施例中係採用三角型尖端之設計及放射狀形狀排列，但不應以此為侷限。值得注意的是，孔隙40較佳地是以聚焦離子束(focus ion beam, FIB)的方式產生，孔隙40可位於複數個電極30之間距之幾何中心上，以使孔隙40間所產生之電場更為均勻，進而使電場對單一細胞80的電穿孔的效率更佳。此外，當電極30之間的孔隙40之距離越小時，越能使所產生之電場集中，強度更可以由所施加在複數個電極30之相反電性的電壓大小進行改變，以可配合所欲被電穿孔之單一細胞80之不同細胞膜特性。也就是說，使用者可以透過使用本發明之奈米電極晶片1，針對不同所欲實驗之單一細胞80樣本，進行不同適合電信參數、電極距離參數之調整，以得到最佳的結果。

請參閱第3圖，其係為本發明之奈米電極晶片之一實施例之第二示意圖。應理解的是，相同的元件係具有相同的功效與連接關係，為使便於描寫，將不再重複贅述其功能與連結關係。如圖所示，在本實施例中，矽基層450之頂部和底部亦可被分別沉積有結構層410與另一結構層410；接下來，再對位於矽基層450底部之另一結構層410進行蝕刻，以產生預定圖樣，預定圖樣可根據使用者之需求有所改變，例如：若是使用者需要若干個通孔於矽基層450，則可蝕刻若干個預定圖樣；隨後，再對矽基層450底部之另一結構層410沉積另一絕緣層440；接下來，對位於矽基層450頂部所沉積之結構層410沉積電極420，再對於電極420沉積絕緣層440；接下來，使用聚焦離子束的方式產生至少一通孔70、100與至少一孔隙40。最後，對位於最外側兩端之另一絕緣層440接合透光層4100，以完成整個晶片結構。值得注意的是，矽基層450、結構層410與另一結構層410、另一絕緣層440與透光層4100可界定具有至少一通孔70、100之微流體腔室4110，以使微流體90從通孔100進出微流體腔室4110。

請參閱第4圖，其係為本發明之奈米電極晶片之微流體擴散結果之示意圖。如圖所示，橫座標為碘化丙啶之擴散時間，縱座標為單一細胞內碘化丙啶之擴散百分比。在本實施例中，微流體90是以碘化丙啶作為實施態樣，但不應以此為侷限。當細胞樣本加載至奈米電極晶片1上，並經過局部電穿孔動作後，於微流體層60中所加入之碘化丙啶大約經過20秒左右即可達到百分之九十以上之擴散率。也就是說，透過本發明之奈米電極晶片1，確實可使微流體90準確且快速地進入單一細胞80並保持單一細胞80的完整性，以解決習知技藝之具有開口細胞膜的可逆性消失、細胞主體結構崩解而導致細胞死亡等問題。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

1．．．奈米電極晶片

10、450．．．矽基層

20、410．．．結構層

30、420．．．電極

40．．．孔隙

4110．．．微流體腔室

420．．．電極

50、440．．．絕緣層

60．．．微流體層

70、100．．．通孔

80．．．單一細胞

800．．．小孔

90．．．微流體

110、4100．．．透光層

第1圖係為本發明之奈米電極晶片之一實施例之第一示意圖。
第2圖係為本發明之奈米電極晶片之電極排列之示意圖。
第3圖係為本發明之奈米電極晶片之一實施例之第二示意圖。
第4圖係為本發明之奈米電極晶片之微流體擴散結果之示意圖。

1．．．奈米電極晶片

10．．．矽基層

20．．．結構層

30．．．電極

40．．．孔隙

50．．．絕緣層

60．．．微流體層

70、100．．．通孔

80．．．單一細胞

800．．．小孔

90．．．微流體

110．．．透光層

Claims (9)

1. 一種奈米電極晶片，係應用於使一單一細胞局部電穿孔以讓一微流體進入該單一細胞，其包含：
   一矽基層；
   一結構層，該結構層係沉積於該矽基層上方，該結構層上沉積有複數個電極，該複數個電極之間具有貫穿該結構層之至少一孔隙；
   一絕緣層，該絕緣層係沉積於該複數個電極上方，該絕緣層具有貫穿該絕緣層之該至少一孔隙；以及
   一微流體層，其設置有複數個通孔，該複數個通孔之其中一部分與該孔隙連通；
   其中，當該單一細胞被放置於已產生至少一電場之該複數個電極間之該孔隙上，該電場作用於該單一細胞，使該單一細胞之細胞膜局部電穿孔以產生複數個小孔，流入該複數個通孔之其中一部分之該微流體係通過該複數個電極間之該孔隙，以從該些小孔流入該單一細胞。
2. 如申請專利範圍第1項所述之奈米電極晶片，其中該微流體於該複數個通孔與該孔隙之間流通。
3. 如申請專利範圍第1項所述之奈米電極晶片，其中該複數個電極係分別地施加正電壓及負電壓以產生該至少一電場。
4. 如申請專利範圍第1項所述之奈米電極晶片，其中該複數個電極係為氧化銦錫電極。
5. 如申請專利範圍第1項所述之奈米電極晶片，其中該複數個電極係為三角形尖端之電極。
6. 如申請專利範圍第1項所述之奈米電極晶片，其中該絕緣層係為氧化矽層。
7. 如申請專利範圍第1項所述之奈米電極晶片，其中該微流體係藉由該複數個通孔之至少一個與該複數個通孔之至少另一個與該至少一孔隙進行該微流體之循環。
8. 如申請專利範圍第1項所述之奈米電極晶片，其中該矽基層之底部更沉積有一另一結構層、一另一絕緣層及一透光層。
9. 如申請專利範圍第8項所述之奈米電極晶片，其中該矽基層、該另一結構層、該另一絕緣層與該透光層係界定具有該至少一通孔之一微流體腔室，以使該微流體從該複數個通孔進出該微流體腔室。