CN104940363A

CN104940363A - 一种枳提取物的体内外降糖用途

Info

Publication number: CN104940363A
Application number: CN201510343441.6A
Authority: CN
Inventors: 李鲜; 贾胜; 孙崇德; 陈昆松
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-06-20
Filing date: 2015-06-20
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2035-06-20
Also published as: CN104940363B

Abstract

本发明提供一种枳提取物在制备降糖功能食品、保健品或降糖药物中的应用。枳油胞层、白皮层、囊衣和汁胞提取物能够在人肝癌HepG2细胞内（in vitro）显著增加葡萄糖消耗，能够在糖尿病C57BL/6小鼠体内（in vivo）显著降低空腹血糖，增加葡萄糖耐量，减少胰岛素抵抗。可作为降糖功能食品、保健品，也可制备降糖药物，用于糖代谢异常相关疾病的防治。

Description

一种枳提取物的体内外降糖用途

技术领域

本发明属食品药品领域，涉及天然来源的枳提取物在制备降糖功能食品、保健品或防治药物中的应用，尤其涉及枳提取物在人肝癌HepG2细胞和糖尿病C57BL/6小鼠模型中降糖的应用。

背景技术

糖尿病是以体内高血糖为特征的一种流行病。糖尿病分为两种：1型糖尿病（胰岛素依赖）和2型糖尿病（非胰岛素依赖），遗传和环境因素对于两者都有影响。糖尿病的发展通常伴随其它代谢综合征，例如肥胖、高血脂和炎症等。在过去的几十年间，糖尿病及其并发症的发生率显著增加，根据世界卫生组织（WHO）的数据，全世界范围内有3.47亿糖尿病患者。2型糖尿病占糖尿病的90%，它的发生由于胰岛素抵抗或者胰岛素分泌受损，表现为高血糖和葡萄糖不耐受。2013年，在中国有9840万糖尿病病例（IDF）。因此，对于糖尿病及其并发症的预防和控制项目刻不容缓。

枳（Poncirus trifoliata），别名枳实、枸橘、橘红等，属落叶灌木或小乔木，在我国多地均有栽培，广泛用作绿篱。枳果实可提有机酸；种子可榨油；叶、花及果皮可提芳香油。枳壳是传统的中药材，可供药用，能破气消积等。然而，关于枳提取物在体内外是否具有降糖活性，未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种枳提取物在制备降血糖药物中的应用。所述枳提取物为油胞层、白皮层、囊衣和汁胞的固相萃取（SPE）粉末。

本发明的另一个目的是提供一种枳提取物在制备降糖功能食品、保健品中的应用。所述枳提取物为油胞层、白皮层、囊衣和汁胞的固相萃取（SPE）粉末。

所述枳提取物是通过将枳油胞层、白皮层、囊衣和汁胞提取物从其冷冻干燥粉末开始，经过甲醇超声提取、旋转蒸发、过固相萃取柱、真空干燥得到。

本发明发现在人肝癌HepG2细胞内（in vitro）枳提取物可以显著增加葡萄糖消耗。

本发明发现在高脂饮食诱导糖尿病C57BL/6小鼠体内（in vivo）枳提取物可以显著降低糖尿病C57BL/6小鼠的空腹血糖，增加葡萄糖耐量，减少胰岛素抵抗。

本发明强调枳提取物这种天然产物在糖尿病防治中的最新发现。

本发明提供一种枳提取物在制备降糖功能食品、保健品或防治药物中的应用。枳提取物能够在人肝癌HepG2细胞内（in vitro）显著增加葡萄糖消耗，能够在糖尿病C57BL/6小鼠体内（in vivo）显著降低空腹血糖，增加葡萄糖耐量，减少胰岛素抵抗。可作为功能食品、保健品或防治药物用于糖代谢异常相关疾病的防治。

附图说明

图1是以人肝癌HepG2细胞为模型，枳提取物对其葡萄糖消耗的影响。其中，二甲亚砜（DMSO）为阴性对照，常用降糖药二甲双胍（MET）为阳性对照，枳油胞层、白皮层、囊衣和汁胞SPE粉末各设置4个浓度（终浓度）梯度，分别为0.2 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL和25 μg/mL，n=4。用SPSS软件进行差异显著性分析，进行t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，与DMSO组比较。

图2是以高脂饮食诱导糖尿病C57BL/6小鼠为饲喂对象，枳油胞层、白皮层、囊衣和汁胞SPE粉末对其空腹血糖的影响。给药13周，第8、10周测定其空腹血糖。低脂+清水组为低脂饮食组，高脂+清水组为高脂饮食诱导糖尿病组，4个处理组剂量都为40 mg/kg BW，n=6-10。用SPSS软件进行差异显著性分析，进行t检验，**p<0.01，***p<0.001，与高脂+清水组比较。

图3-1是以高脂饮食诱导糖尿病C57BL/6小鼠为饲喂对象，枳油胞层、白皮层、囊衣和汁胞SPE粉末对其葡萄糖耐量试验（OGTT）的影响。给药13周，第12周测定其葡萄糖耐量。低脂+清水组为低脂饮食组，高脂+清水组为高脂饮食诱导糖尿病组，4个处理组剂量都为40 mg/kg BW，n=6-10。

图3-2是以高脂饮食诱导糖尿病C57BL/6小鼠为饲喂对象，枳油胞层、白皮层、囊衣和汁胞SPE粉末对其曲线下面积（AUC）的影响。给药13周，第12周进行OGTT试验，计算其曲线下面积。低脂+清水组为低脂饮食组，高脂+清水组为高脂饮食诱导糖尿病组，4个处理组剂量都为40 mg/kg BW，n=6-10。用SPSS软件进行差异显著性分析，进行t检验，**p<0.01，***p<0.001，与高脂+清水组比较。

图4是以高脂饮食诱导糖尿病C57BL/6小鼠为饲喂对象，枳油胞层、白皮层、囊衣和汁胞SPE粉末对其胰岛素抵抗评价指数（HOMA-IR）的影响。给药13周，试验结束后处死小鼠取血清，测定其血清血糖和血清胰岛素含量，计算胰岛素抵抗评价指数。低脂+清水组为低脂饮食组，高脂+清水组为高脂饮食诱导糖尿病组，4个处理组剂量都为40 mg/kg BW，n=6-10。用SPSS软件进行差异显著性分析，进行t检验，*p<0.05，***p<0.001，与高脂+清水组比较。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1 枳提取物的制备

枳成熟果实（采自浙江省台州市黄岩区）经过手工分离得到油胞层、白皮层、囊衣和汁胞，液氮速冻后经过低温真空干燥，磨样后得到冷冻干燥粉末。分别称取枳油胞层、白皮层、囊衣和汁胞冷冻干燥粉末1 g，用80%甲醇20 mL（固液比1:20）超声30 min，频率为60 kHz，功率为30 W，提取液通过10000 rpm离心得到澄清上清液，如此重复3次，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸去甲醇，得到枳提取物水溶液。

水溶液用固相萃取（SPE）Sep-Pak^? C18柱进行纯化（12 cc/2 g，Waters），纯化过程包括活化、平衡、上样、淋洗和洗脱五个步骤：Sep-Pak^?C18柱首先用20 mL甲醇活化，再用20 mL去离子水平衡，然后水溶液上样，待充分吸附后，小柱用40-80 mL去离子水淋洗以洗去果实中的糖酸等极性物质，真空抽干后用足量的甲醇（根据洗脱颜色判断）充分洗脱，洗脱液用真空干燥仪蒸干，分别得到粉末66.7 mg、64.4 mg、69.9 mg和34.2 mg，得到的粉末即为枳油胞层、白皮层、囊衣和汁胞SPE粉末。

实施例2 枳提取物的HepG2葡萄糖消耗试验

HepG2细胞用含10 %胎牛血清的高糖型DMEM培养基于37 ℃、5 % CO₂细胞培养箱中孵育，隔天更换新鲜培养液，2-3天传代1次。实验时，HepG2细胞接种于96孔板，并设无细胞空白对照孔。待细胞生长至70-80 %融合，弃去原培养基，用PBS缓冲液洗2遍，换上含0.2 % BSA的无血清1640培养基，分组加药。设DMSO溶剂对照组，二甲双胍（MET）对照组（终浓度为1 mmol/L）和不同浓度枳提取物组（终浓度分别为0.2 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL和25 μg/mL）。作用24 小时后，用酶标仪检测各孔OD值（检测波长：505 nm），用葡萄糖氧化酶法测定每孔培养液的葡萄糖含量。每孔培养液葡萄糖消耗量=无细胞空白孔培养液葡萄糖含量－每孔培养液葡萄糖含量，每组设4个复孔。相同实验重复4次。

葡萄糖含量测定后，弃去板中培养基，细胞用10%三氯醋酸固定1小时，用双蒸水洗涤并干燥后，每孔加入100 μL磺基罗丹明B（SRB）溶液（4 mg/mL），室温染色20分钟，1%醋酸洗涤并干燥。每孔加入100 μL10 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液使SRB溶解。用酶标仪检测各孔OD值（检测波长：515 nm），用于反映细胞增殖状况，以矫正细胞接种数目及化合物毒性等综合因素造成的实验误差。最后计算各组葡萄糖消耗量与溶剂对照组比较的增加百分率。

数据用平均值±标准误（）表示，使用SPSS软件进行数据分析，进行t检验。具体的佛手柑素葡萄糖消耗活性见附图1。

实施例3 枳提取物的C57BL/6小鼠试验

C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲喂的低脂饲料（含10%脂肪）和高脂饲料（含45%脂肪）购自江苏美迪森生物医药有限公司。所有小鼠在恒温恒湿环境下饲养，提供12 h光照12 h黑暗环境。每组10只小鼠，低脂+清水组为低脂饮食组，高脂+清水组为高脂饮食诱导糖尿病组，4个处理组剂量都为40 mg/kg BW。所有小鼠可以自由摄取食物和蒸馏水，处理组通过灌胃针灌胃的方式进行给药，灌胃体积为20 mL/kg BW，低脂和高脂对照组灌胃蒸馏水。试验为期13周，1周连续给药6天，停药1天。从第8周开始测定空腹血糖，间隔1周测定1次，测定前小鼠禁食过夜，对小鼠尾静脉剪尾取血，用强生One Touch Ultra ZSJ 843ETT型血糖仪测定空腹血糖值。数据用平均值±标准误（）表示，使用SPSS软件进行数据分析，进行t检验。具体的3周空腹血糖测定值见图2。

试验进行的第12周测定OGTT。测OGTT之前，小鼠禁食过夜，给药，1 h后测OGTT。采血作为0 min血糖值，然后给予20%葡萄糖（4 g/kg BW，灌药体积为10 mL/kg BW)灌胃后，于30、60、90、120 min四个时间点分别尾静脉采血，用强生One Touch Ultra ZSJ 843ETT型血糖仪测定血糖值，绘制糖耐量曲线。曲线下面积计算公式为：AUC=(G0+G30)×15+(G30+G60)×15+(G60+G120)×30。数据用平均值±标准误（）表示，使用SPSS软件进行数据分析，进行t检验。具体的C57BL/6小鼠糖耐量曲线和曲线下面积（AUC）分别见附图3-1和附图3-2。

试验进行13周后处死小鼠，采集血清，使用罗氏Cobas 8000生化仪测定血清血糖，使用上海朗顿生物科技有限公司的ELISA试剂盒测定血清胰岛素，按照胰岛素抵抗评价指数公式HOMA-IR=血清血糖×血清胰岛素/22.5计算，具体的胰岛素抵抗评价指数见附图4。

Claims

1.一种枳提取物在制备降糖药物中的应用，其特征在于，所述枳提取物为油胞层、白皮层、囊衣和汁胞的固相萃取粉末。

2.一种枳提取物在制备降糖功能食品、保健品中的应用，其特征在于，所述枳油胞层、白皮层、囊衣和汁胞的固相萃取粉末。

3.根据权利要求1或2所述的一种枳提取物的应用，其特征在于，所述枳提取物是通过将枳油胞层、白皮层、囊衣和汁胞提取物从其冷冻干燥粉末开始，经过甲醇超声提取、旋转蒸发、过固相萃取柱、真空干燥得到。