CN104928358A

CN104928358A - 一种癌症早期基因诊断试剂盒及诊断方法

Info

Publication number: CN104928358A
Application number: CN201510076089.4A
Authority: CN
Inventors: 冯宝章
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-02-13
Filing date: 2015-02-13
Publication date: 2015-09-23

Abstract

本发明涉及一种癌症早期基因诊断试剂盒及诊断方法，使用检测癌症致病基因和癌变基因扩增的两对引物，以疑似MDS或癌症早期的骨髓或癌组织DNA作模板，在定量PCR仪器上作PCR反应。根据此PCR特异性阳性反应与否及强度，判断该患者是否系MDS或早MDS，或癌前期。

Description

一种癌症早期基因诊断试剂盒及诊断方法

技术领域

本发明涉及癌症基因诊断和基因治疗领域，尤其涉及一种癌症早期基因诊断试剂盒及诊断方法。

背景技术

现有技术中已经研究出关于癌症发病的原理和病因，癌症发病有以下步骤：1，致病基因突变/扩增；2，其调节基因缺失/失活；3，癌变基因扩增：骨髓等组织干细胞从只有致病基因突变/扩增的癌前干细胞，发展为拥有致病基因和癌变基因双扩增的癌干细胞；4，癌干细胞表面多个生长因子受体与其微环境中多种生长因子间的互动，推动癌干细胞集落向癌瘤发展；5，在转化生长因子及其受体等因素介导下发生癌瘤细胞侵润和转移，并形成新部位的癌瘤。

目前，国内外流行的基因诊断多采用聚合酶链反应(PCR)技术。采用已知基因的一对引物(primers)，以待测生物标本DNA作模板，在特定的反应系统中，经过热变性-退火-延伸，数十个循环后，对反应产物作聚丙烯酰胺电泳分析，观察电泳带型及其强度，判断待测基因扩增与否，及其与疾病的关系。近10几年来，在此基础上作技术改进，发明适时定量PCR仪，克服了普通PCR仪的缺点，并使产物定量化，从而更适合临床使用。

为了彻底战胜癌症，本发明创作者經过长期努力，在创立癌症早期基因治疗技术并应用于临床的同时，开发出癌症早期基因诊断技术和晚期癌特定组合的靶向治疗加基因治疗技术。这些都是前所未有的发明和创造。而非对某项技术的补充。

发明内容

本发明的目的在于提供一种癌症早期基因诊断试剂盒及诊断方法，满足癌症早期基因治疗的需要。

为实现上述目的，本发明提供一种癌症早期基因诊断试剂盒，试剂盒包含致病基因和癌变基因两对PCR引物；

其中，V-erbB PCR引物序列如下：

P1：5‘CAC TGT GTG AAG GCC TGC 3’；

P2：5‘CTT ATA AAT AGT GCC AAA AGC 3’；

TS引物序列根据TS基因编码区随机设计。

本发明还提供一种癌症早期基因诊断试剂盒的诊断方法，采用聚合酶链反应方法，即针对上述两基因设计两对引物，会同其它试剂组合而成基因诊断试剂盒；

步骤a，骨髓细胞模板DNA的提取：用小刀将患者骨髓涂片上的细胞刮下来，收集于1.5ml EP管内，加入TEN(15Mm Tris，15mM EDTA，15mMNacl，PH8.0)液500ul，10％SDS 75ul，蛋白酶K(2.0mg/ml)10ul，于55℃水浴中孵育5小时；

步骤b，聚合酶链反应条件：模板变性条件为97℃，7分钟，32个循环，每个循环中变性条件为94℃5分钟，退火条件为52℃，1分钟，延伸条件为72℃，2分钟，最后一次循环之后延伸时间为5分钟，取出置于4℃保存。

现将本基因诊断法产生之前的研发过程简述如下：

1，吸收国外有关研究成果即禽类原始红细胞增多症(AvianErythroblastosis)及其传染性致病病毒(AEV-ES4)基因组所含癌基因V-erbB和V-erbA。正是它们的协同作用导致禽类红白血病的发生。研究证明，V-erbB产物与EGFR-TK，高度同源且EGFR在大多数肿瘤高表达。针对EGFR的单抗和针对TK的小分子抑制剂治疗肿瘤均有效。

2，引进上述病毒癌基因作探针和Southern blot杂交技术，对急性白血病，肿瘤，MDS，特别是家族性白血病和MDS，进行细胞遗传学和一系列分子生物学研究。并最终证明，内源性V-erbB是白血病等癌症共同致病基因。它的缺失或插入等突变并扩增，导致白血病等癌症的发生。

3，骨髓细胞姐妹染色单体分染和互换(SCD/SCE)技术证明：1)SCD阴性(细胞周期成倍延长)之MDS，转白血病的机制在于骨髓造血细胞TS基因协同扩增；2)骨髓细胞SCE水平(SCE/Cell)愈高，其原始程度愈高。换言之，干细胞有最高水平SCE，说明它最易于发生突变。鉴于国外认为癌症是干细胞基因突变所致，我们因而认为，上述内源性V-erbB突变最大可能发生于骨髓和组织干细胞。

4，骨髓发生代赏性增生的机制在于骨髓干细胞发生EGFR，TS/TK等基因扩增。此间，已有V-erbB突变/扩增的白前干细胞势必发生上述代赏性增生和相应的基因扩增，从而形成拥有双重癌基因扩增的癌干细胞。美国NIH证明，TS基因是个癌基因，我们则认定此基因为癌变基因。因为它强化了癌前干细胞的增殖力，使骨髓原始和早幼粒细胞％增加，同时染色体和细胞周期异常检出率也增加。MDS患者转白血病率也增加。因此，白血病等癌症发生的重大危险在于癌干细胞生成及其癌克隆形成和随后的发展。

与现有技术相比较，本发明的有益效果在于：本专利的目的在于对癌症作早期基因诊断，即同时检测骨髓标本是否有致病基因和癌变基因的扩增，以便进行基因治疗和预防，实现癌症的治愈。而晚期癌治疗很困难，费用很高，死亡率也高。

附图说明

图1为本发明的适应症MDS疾病发展演进图；

图2为本发明的PCR产物电泳图A；

图3为本发明的PCR产物电泳图B；

图4为本发明的图B的光扫描图。

具体实施方式

以下，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

本发明的试剂盒旨在早期发现和诊断白血病等癌症，以便早期基因治疗和预防。从而避免发展到晚期，转移和死亡。因此，本发明中的试剂盒将主要针对不同癌症共同致病基因和癌变基因的扩增，采用PCR基因扩增技术进行检测。

本发明的试剂盒的成分为：试剂盒包含致病基因和癌变基因两对PCR引物；

其中，V-erbB PCR引物序列如下：

P1：5‘CAC TGT GTG AAG GCC TGC 3’；

P2：5‘CTT ATA AAT AGT GCC AAA AGC 3’；

TS引物序列根据TS基因编码区随机设计。

本发明的试剂盒的使用方法：采用聚合酶链反应(PCR)方法，即针对上述两基因设计两对引物，会同此反应的其它试剂组合而成基因诊断试剂盒；

步骤1，骨髓细胞模板DNA的提取：用小刀将患者骨髓涂片上的细胞刮下来，收集于1.5ml EP管内，加入TEN(15Mm Tris，15mM EDTA，15mMNacl，PH8.0)液500ul，10％SDS 75ul，蛋白酶K(2.0mg/ml)10ul，于55℃水浴中孵育5小时。

步骤2，聚合酶链反应(PCR)条件：模板变性条件为97℃，7分钟，32个循环，每个循环中变性条件为94℃5分钟，退火条件为52℃，1分钟，延伸条件为72℃，2分钟，最后一次循环之后延伸时间为5分钟，取出置于4℃保存。

PCR产物的检测：1.8％琼脂糖凝胶电泳，每孔点样品(PCR产物)10ul，60V，30mA，电泳20-25分钟，EB染色，紫外灯下观察结果。

PCR检测结果：

对32例MDS和12例可疑MDS作PCR检测结果如下：(1)RA和可疑RA有其特殊的PCR产物电泳带型即4条大小不同的条纹，如图2所示，其为PCR产物电泳图A，显示RA和RAEB，有4条带纹；图3为本发明的PCR产物电泳图B，显示AA(再障)无带纹，其母亲有两条较小的带纹。

(2)典型再障(AA)和ITP均无带纹；

(3)可疑AA有1-2条带，与早期红血病相似；

(4)少数ITP和溶贫(HA)有1-2条带纹；

(5)正常人和巨幼贫(MA)无带；其他贫血病和出血病均无此带型。表明其高度的特异性。

表1 44例MDS和可疑MDS患者骨髓检查结果

注：*含4例+8而PCR均阴性者，扣除此4例，其PCR阳性率应为87.5％，表中少数病例未做SCD或核型分析。

本发明的试剂盒的适应症：1，骨髓增生异常综合症(MDS)；2，骨髓增殖性肿瘤(MPN)；3，急性白血病完全缓解(AL-CR)；4，多种肿瘤早期(重度增生)。

本发明试剂盒的规格：2ml和20ml两种。具有10人份，50人份和100人份，三种。

用法用量：

静脉注射：每公斤体重1-3单位，1次/日X3为一个疗程；

局部注射：每公分瘤体直径1-2单位，1次/日X3为一个疗程。

试剂盒的保存期：冰箱(4℃)，保存3个月。采用玻璃安培包装。

结果判断：

1，对致病基因检测呈阳性反应且有高考贝数扩增者，视为白血病前期或MDS-RA(S)，或癌早期；

2，对致病基因和癌变基因呈双阳性反应且有高考贝数扩增者，视为高危MDS或急性白血病，或原位癌；

3，对仅有癌变基因呈阳性反应者，应除外白前和癌前。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种癌症早期基因诊断试剂盒，其特征在于，试剂盒包含致病基因和癌变基因两对PCR引物；

其中，V-erbB PCR引物序列如下：

P1：5‘CAC TGT GTG AAG GCC TGC 3’；

P2：5‘CTT ATA AAT AGT GCC AAA AGC 3’；

TS引物序列根据TS基因编码区随机设计。

2.一种癌症早期基因诊断试剂盒的诊断方法，其特征在于，采用聚合酶链反应方法，即针对上述两个癌基因设计两对引物，会同其它试剂组合而成基因诊断试剂盒；

步骤2，聚合酶链反应条件：模板变性条件为97℃，7分钟，32个循环，每个循环中变性条件为94℃5分钟，退火条件为52℃，1分钟，延伸条件为72℃，2分钟，最后一次循环之后延伸时间为5分钟，取出置于4℃保存。