CN104928329A

CN104928329A - 一种铜藻多糖酶解物及其应用

Info

Publication number: CN104928329A
Application number: CN201510284404.2A
Authority: CN
Inventors: 邵平; 朱岳琼; 孙培龙
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Hangzhou Zhiweiguan Food Co Ltd
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2015-05-28
Publication date: 2015-09-23
Anticipated expiration: 2035-05-28
Also published as: CN104928329B

Abstract

一种铜藻多糖酶解物及其应用，所述铜藻多糖酶解物通过如下方法制备：(1)酶解预处理：取铜藻粉末与水混合，调节pH为5.5，加入复合酶，所述复合酶为木瓜蛋白酶与纤维素酶按照质量比1：1的混合物，然后于50℃搅拌60～80min，离心取上清液，即得酶解预处理液；(2)醇沉得到铜藻粗多糖SHP组分；(3)径向流脱色脱蛋白得到SHPA多糖；(4)SHPA酶解及纯化得到酶解产物；(5)离子柱层析；(6)凝胶柱层析得到铜藻多糖酶解物。所述的铜藻多糖酶解物可用于制备调节肠道菌群失调的食品或药物中。本发明所述的铜藻多糖酶解物通过控制其分子量和杂质含量，使得对于有益菌具有显著的增值作用，降低肠道pH，从而能够改变肠道菌群结构。

Description

一种铜藻多糖酶解物及其应用

(一)技术领域

本发明涉及海藻多糖提取物技术领域，具体涉及一种铜藻多糖酶解物及其在制备调节肠道菌群失调的食品或药物中的应用。

(二)背景技术

肠道健康是近年来备受瞩目的诸多健康问题之一，由于环境污染、抗生素在食物链中的沉积、居民膳食结构的变化以及人们健康需求的提高，对健康关注度的持续增长，人们对健康的理解已经开始由“表”及“里”，更加关注健康的本源—体内微生态环境。益生元在增加肠道内源性益生菌的数量、调节肠道菌群组成等方面有着很大优势。多糖作为代表性的益生元，具有来源广泛、性质稳定、代谢产物无毒无害等优点，是一种天然的功能性食品成分。

海藻是海洋生物资源的重要组成部分。铜藻又称柱囊马尾藻、草茜、竹茜菜，隶属于马尾藻属，是北太平洋西部特有的暖温带性海藻，不连续分布在我国沿海，是提取褐藻胶的重要原料。铜藻多糖具有增强机体免疫力、抗菌、抗病毒和抑制肿瘤细胞等生理活性，但目前主要应用于饲料和有机肥料方面，产品附加值低，造成资源的严重浪费。目前，关于海藻多糖研究主要集中于羊栖菜、岩藻、海带多糖等分离纯化、药理活性等方面。

目前市场上常见的具有改善胃肠道功能的保健食品或药品很多。中国专利公开号CN102172270A，公开了一种调理保健胃肠的多糖冲剂及其制备方法，由猴头菇多糖粉、山楂粉、菊粉、低聚果糖粉、低聚木糖粉复合配比而成。利用微生物发酵技术获得猴头菇多糖比分离纯化提取猴头菇多糖效率高，更经济，但是其纯度和调理效果较后者差。中国专利公开号CN102018216A，公开了一种调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，所述组合物由经高密度培养和双层包埋的双歧杆菌、低聚糖、维生素、金属元素和辅料混合配制而成。虽然双歧杆菌经过双层包埋技术和高密度培养，生产速率提高，较一般包埋技术到达肠道后外层胶体更易溶解，但生产成本高，工艺繁琐。

铜藻俗称“丁香屋”(中国南麂岛)，隶属于马尾藻属。铜藻是北太平洋西部特有的暖温带性海藻，是提取褐藻胶的重要原料，因富含有益的生源要素而被广泛应用到医药、食品、饲料和有机肥料方面。研究表明，铜藻藻体含褐藻酸、褐藻淀粉、甘露醇及多种氨基酸、多糖、蛋白质、维生素等。铜藻具有消痰软坚、清热利水的功效。近年来，铜藻多糖的开发和用途已经成为一个研究的新课题，但目前对于铜藻多糖的研究主要集中在其保湿保润作用以及抗氧化活性，例如本申请发明人之前发表的文章[径向流耦合超滤分离纯化铜藻多糖及其烟丝保润的应用,食品与发酵工业,2012年08期，第197-202页]、[铜藻多糖微波辅提工艺优化及其抗氧化活性研究，核农学报，,2014年06期，第1062-1069页]以及专利申请CN2015100921966均是关于铜藻多糖的抗氧化活性或者保湿保润性能，我们的实验表明，根据这些文献制备得到的铜藻多糖或者铜藻多糖的酶修饰物对于胃肠道功能的改善不起作用。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种铜藻多糖酶解物及其在制备调节肠道菌群失调的食品或药物中的应用，所述的铜藻多糖酶解物通过控制其分子量和杂质含量，使得对于有益菌具有显著的增值作用，降低肠道pH，从而能够改变肠道菌群结构。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种铜藻多糖酶解物，其通过如下方法制备：

(1)酶解预处理：取铜藻粉末与水混合，调节pH为5.5，加入复合酶，所述复合酶为木瓜蛋白酶与纤维素酶按照质量比1：1的混合，然后于50℃搅拌60～80min，离心取上清液，即得酶解预处理液；

(2)醇沉：取酶解预处理液，加入乙醇溶液使得最终乙醇体积分数为60％并在该条件下进行沉淀操作，冷冻离心得到沉淀，加入蒸馏水使沉淀溶解，再经蒸发溶剂、冷冻干燥得到铜藻粗多糖SHP组分；

(3)径向流脱色脱蛋白：使用装填有弱碱性阳离子交换树脂的径向流色谱柱对铜藻粗多糖SHP组分进行脱色脱蛋白操作，其中洗脱剂为纯水，得到SHPA多糖；

(4)SHPA酶解及纯化：在pH 4.5～5.5的HAc-NaAc缓冲液体系中，SHPA多糖和葡聚糖酶于50℃进行酶解反应2～3h，终止反应后酶解反应液采用孔径大小为500Da规格的透析袋进行流水透析，透析液经浓缩、冷冻干燥得到酶解产物；

(5)离子柱层析：酶解产物配成水溶液用0.45μm微滤膜过滤，所得滤液用DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱层析系统进行离子柱层析，分别以蒸馏水、0.1～0.4mol/LNaCl水溶液进行洗脱，选定最大洗脱峰对应的洗脱液，浓缩、用0.45μm微滤膜过滤得到滤液；

(6)凝胶柱层析：步骤(5)所得滤液用Sephadex G-25凝胶层析系统进行凝胶柱层析，以蒸馏水进行洗脱，以硝酸银指示剂检测洗脱液中是否脱盐完全并收集不含盐的多糖部分，浓缩，冷冻干燥得到铜藻多糖酶解物。

进一步，步骤(1)中，铜藻粉末、水、复合酶的投料质量比为1：14.5～15.5：0.4％～0.6％，优选为1:15:0.5％。

进一步，步骤(3)中，所述弱碱性阴离子交换树脂为A103S、A105或A100，优选A103S。所述的径向流脱色脱蛋白可按照文献(例如[铜藻多糖微波辅提工艺优化及其抗氧化活性研究，核农学报，2014年06期，第1062-1069页])报道的方法进行操作，得到洗脱液，洗脱液经浓缩、冷冻干燥即得到SHPA多糖。

进一步，步骤(4)中，SHPA多糖与葡聚糖酶的投料质量比为1：0.5～2，优选为1:1～2，更优选1:1；所述葡聚糖酶在所述缓冲液体系中的质量浓度为0.3-0.4％。

进一步，步骤(4)中，酶解时间优选为3小时。

进一步，步骤(5)中，离子柱层析中，上样流速优选为1～2mL/min，洗脱流速优选为2～4mL/min。

进一步，步骤(6)中，凝胶柱层析中，上样流速为1～3mL/min，洗脱流速为2～4mL/min。

本发明中，冷冻离心在转速8000～10000rpm、温度4～15℃条件下进行，离心时间优选5～15min。

本发明中，木瓜蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶均使用市售商品。

本发明还提供了所述铜藻多糖酶解物在制备调节肠道菌群失调的食品或药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明采用复合酶解法提取铜藻多糖，一方面通过降解细胞壁使多糖更易提取从而提高得率；另一方面可以针对其中的大多数杂质(纤维素、蛋白质等)选择性降解，以更利于后续分离纯化的进行；同传统水提法、微波和单一酶解法等相比，能够提高多糖得率，有效控制杂质含量，同时提取工艺条件温和，节能降耗。

(2)本发明制得的铜藻多糖酶解物对于有益菌具有显著的增值作用，证明其能够改变肠道菌群结构，降低肠道pH，可用于制备调节胃肠道菌群失调的食品或药物。

(四)附图说明

图1是发酵过程pH的变化；

图2是益生元指数变化。

(五)具体实施方式

下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1

(1)酶解预处理：

将铜藻洗净，控水，置于烘箱内60℃烘干，粉碎。拣选破碎后过100目筛网的铜藻，取100.0g粉末，加入1500g的水中，调节pH为5.5，加入0.5g复合酶，复合酶为木瓜蛋白酶(上海蓝季科技发展有限公司，100万U/g)与纤维素酶(张家港金源生物化工有限公司，8万U/g)质量比1：1的混合，放置于50℃恒温水浴锅，进行匀速搅拌60min，4000rpm离心10分钟，取上清液即得酶解预处理液；

(2)醇沉：

取酶解预处理液旋转蒸发浓缩至1L，加入95％乙醇溶液至最终乙醇体积分数为60％，静置过夜。样液冷冻离心10min(转速10000rpm，温度4℃)，取沉淀，加入少量蒸馏水将沉淀完全溶解，减压蒸发并将残留酒精完全蒸发，经冷冻干燥得铜藻粗多糖SHP组分，酶解提取法的多糖得率达2.52％。

(3)径向流脱色脱蛋白工艺

将步骤(2)得到的粗多糖加水配制得到7mg/ml浓度的铜藻粗提液，加入装填有A103S阴离子树脂的径向流色谱柱(所用径向流色谱柱为美国Sepragen公司的型号SUPERFLO-250COLUMN的径向流色谱柱)中，用纯水洗脱，径向流色谱的条件为：上样流速/柱高为3ml/(min·cm)，洗脱速度/柱高为12ml/(min·cm)，柱体积/上样量为5mL/mL，洗脱30min，收集得到洗脱液，旋转蒸发将上清液浓缩，经冷冻干燥得SHPA多糖样品。蛋白脱除率达到89.3％，SHPA多糖含量为79.6％。

(4)SHPA酶解及纯化：

取0.4g SHPA溶于100mL乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.0)配制成4mg/mL样液，取葡聚糖酶加入缓冲液(pH 5.0)配制成质量浓度4％酶溶液。将样液10mL、酶液1mL各自保温10min，混匀，于50℃反应2h，沸水浴加热5min钝化酶活性终止反应。静置冷却，减压蒸发浓缩至4％待用。

选取孔径大小为500Da规格的透析袋，装入可溶性固形物4％的15mL酶解反应液分别流水透析24h，静置过夜。重复多次，并将透析液减压浓缩至10mL，冷冻干燥，储备待用。

将酶解产物组分配制成10～20mg/mL的水溶液，过孔径为0.45μm微孔滤膜所得滤液进行离子柱上样。

(5)离子柱层析：DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱(XK 26×100cm)层析系统，上样量15mL，上样流速为2mL/min；分别以蒸馏水、0.1mol/L NaCl水溶液进行洗脱，洗脱流速为3.5mL/min，自动分部收集器收集洗脱液，每管8mL。绘制洗脱曲线，并分别收集各洗脱峰所对应的组分。

选定最大洗脱峰对应洗脱液浓缩至5mg/mL左右浓度，用孔径为0.45μm微孔滤膜过滤，待凝胶柱层析。

(6)凝胶柱层析：Sephadex G-25凝胶(XK 16×100cm)层析系统，上样量1mL，上样流速为1mL/min；以蒸馏水进行洗脱，洗脱流速为2mL/min，自动分部收集器收集洗脱液，每管10mL。以硝酸银指示剂检测洗脱液中是否脱盐完全并收集不含盐的多糖部分，浓缩，冷冻干燥。经上述操作分别得到酶解产物SHPA-2，其平均分子量21.42KDa。

实施例2

反应步骤和条件同实施例1，唯一不同是步骤(4)中于50℃反应3小时，最后得到酶解产物SHPA-3，其平均分子量10.54KDa。

实施例3

取MRS-葡萄糖培养基和3个MRS无糖培养基，在3个MRS无糖培养基中分别添加与葡萄糖等量的SHPA-2、SHPA-3及FOS(低聚果糖)(上海易蒙斯化工科技有限公司)，记为MRS-SHPA-2、MRS-SHPA-3、MRS-FOS。

收集受试者新鲜粪便于无菌蓝盖瓶中，立即送检。定量称取标本，悬浮于冰冷PBS缓冲液(pH7.3)中，使粪样浓度为50mg/mL，加无菌玻璃珠蜗旋lmin，静置备用。

将制备的粪悬液按5％的量分别接种到MRS-SHPA-2、MRS-SHPA-3、葡萄糖、MRS-FOS培养液中，37℃(50rpm)摇床培养，测定24h后培养液的pH值，结果见图1。以PBs缓冲液(pH7.3)对发酵液进行梯度稀释，梯度设置为10³-10⁶取不同梯度的稀释液点样到各选择性培养基相应梯度区域中，适当条件下培养(24-48h)观察菌落形态，计算菌落数，用logcfu/mL发酵液表示，并且按照公式1计算体外发酵的PI值(益生元指数)，结果见图2。

PI = \frac{Bif - Bac + Lac - Clos}{Total}

(公式1)

其中，Bif代表处理后双歧杆菌的数量/接种数量；Bac代表处理后类杆菌的数量/接种数量；Lac代表处理后乳酸杆菌的数量/接种数量；Clos代表处理后厌氧梭菌的数量/接种数量；Total代表总菌落数。

从图1可以看出接种肠道菌群后发酵液的初始pH值均较高，随着发酵时间的延长，发酵液的pH值均呈下降趋势。24h后无糖培养基pH为5.2，下降幅度最小；葡萄糖培养基pH下降速度最快，但最终pH值与FOS、SHPA-2、SHPA-3培养基无明显差异，而MRS-SHPA-3由最初pH值7.6降至4.2，pH降低程度最显著。添加铜藻多糖的培养基接种肠道菌群24h后，pH值下降，与添加了FOS的培养基结果类似。这说明铜藻多糖在代谢过程中被双歧杆菌利用产生了乙酸等短链脂肪酸，从而引起培养基pH值下降，说明了铜藻多糖对有益菌有增值作用，其中SHPA-3增值效果最显著。

通过计算24h后发酵液的PI值(图2)可以看出，FOS、SHPA-2、SHPA-3的PI值均大于1，说明SHPA-2、SHPA-3均有益生元活性。其中SHPA-3的PI值达到3.44，而SHPA-2仅有1.26，说明SHPA-3分子量更小，可以更容易被双歧杆菌和乳杆菌利用，根据PI值的意义(PI值越大，表示益生元的效果越好)，说明SHPA-3的益生元效果最好。

综上所述，经过酶解分离出的SHPA-3对于有益菌具有显著的增值作用，证明SHPA-3能够降低肠道pH，改变肠道菌群结构。

对比实施例1：

将铜藻洗净，控水，置于烘箱内60℃烘干，粉碎。取100g藻粉，加1L 95％乙醇溶液浸泡脱脂，静置过夜。按1:10料液比加入蒸馏水，95℃水浴2h。热水提取结束冷却静置1h，冷冻离心5min(转速8000rpm，温度4℃)。取上清液即多糖粗提液旋转蒸发浓缩至适当浓度，加入95％乙醇溶液至最终乙醇体积分数为60％，沉淀过夜。样液冷冻离心10min(转速10000rpm，温度4℃)，取沉淀，加入少量蒸馏水将沉淀完全溶解，减压蒸发并将残留酒精完全蒸发，并浓缩至2ml，经冷冻干燥得SHP粗多糖组分，水回流提取多糖方法，多糖得率为2.07％。

对比实施例2：

将铜藻洗净，控水，置于烘箱内低温(50～65℃)烘干，粉碎过60目筛。取100g藻粉，按一定料液比加入蒸馏水，按照设定的参数进行微波辅助提取。提取完成后冷却静置1h，然后以转速为1000r·min^-1、温度4℃冷冻离心10min，得上清液和沉淀。取上清液，旋转蒸发浓缩至适当浓度，加入95％乙醇溶液使样品最终乙醇浓度为60％，放置过夜，离心得沉淀，加入少量蒸馏水使沉淀溶解，并将残留的少量酒精完全蒸发，冷冻干燥得SHP粗多糖组分,微波提取多糖方法，多糖得率为2.33％。

对比实施例3：

(1)酶解预处理：

将铜藻洗净，控水，置于烘箱内60℃烘干，粉碎。拣选破碎后过100目筛网的铜藻，取100.0g粉末，加入1500g的水中，调节pH为5.5，加入0.5g木瓜蛋白酶(上海蓝季科技发展有限公司，100万U/g)，放置于50℃恒温水浴锅，进行匀速搅拌60min，4000rpm离心10分钟，取上清液即得酶解预处理液；

(2)醇沉：

取酶解预处理液旋转蒸发浓缩至1L，加入95％乙醇溶液至最终乙醇体积分数为60％，静置过夜。样液冷冻离心10min(转速10000rpm，温度4℃)，取沉淀，加入少量蒸馏水将沉淀完全溶解，减压蒸发并将残留酒精完全蒸发，经冷冻干燥得铜藻粗多糖SHP组分，单一木瓜蛋白酶提取方法的多糖得率达2.05％。

对比实施例4：

(1)酶解预处理：

将铜藻洗净，控水，置于烘箱内60℃烘干，粉碎。拣选破碎后过100目筛网的铜藻，取100.0g粉末，加入1500g的水中，调节pH为5.5，加入0.5g纤维素酶(张家港金源生物化工有限公司，8万U/g)，放置于50℃恒温水浴锅，进行匀速搅拌60-80min，4000rpm离心10分钟，取上清液即得酶解预处理液；

(2)醇沉：

取酶解预处理液旋转蒸发浓缩至1L，加入95％乙醇溶液至最终乙醇体积分数为60％，静置过夜。样液冷冻离心10min(转速10000rpm，温度4℃)，取沉淀，加入少量蒸馏水将沉淀完全溶解，减压蒸发并将残留酒精完全蒸发，经冷冻干燥得铜藻粗多糖SHP组分，单一纤维素酶提取方法的多糖得率达1.87％。

Claims

1.一种铜藻多糖酶解物，其通过如下方法制备：

(1)酶解预处理：取铜藻粉末与水混合，调节pH为5.5，加入复合酶，所述复合酶为木瓜蛋白酶与纤维素酶按照质量比1：1的混合物，然后于50℃搅拌60～80min，离心取上清液，即得酶解预处理液；

2.如权利要求1所述的铜藻多糖酶解物，其特征在于：步骤(1)中，铜藻粉末、水、复合酶的投料质量比为1：14.5～15.5：0.4％～0.6％。

3.如权利要求1所述的铜藻多糖酶解物，其特征在于：步骤(1)中，铜藻粉末、水、复合酶的投料质量比为1:15:0.5％。

4.如权利要求1～3之一所述的铜藻多糖酶解物，其特征在于：步骤(3)中，所述弱碱性阴离子交换树脂为A103S、A105或A100。

5.如权利要求1～3之一所述的铜藻多糖酶解物，其特征在于：步骤(4)中，SHPA多糖与葡聚糖酶的投料质量比为1：0.5～2，所述葡聚糖酶在所述缓冲液体系中的质量浓度为0.3-0.4％。

6.如权利要求1～3之一所述的铜藻多糖酶解物，其特征在于：步骤(4)中，酶解时间为3小时。

7.如权利要求1所述的铜藻多糖酶解物，其特征在于：步骤(5)中，离子柱层析中，上样流速优选为1～2mL/min，洗脱流速为2～4mL/min。

8.如权利要求1～3之一所述的铜藻多糖酶解物，其特征在于：步骤(6)中，凝胶柱层析中，上样流速为1～3mL/min，洗脱流速为2～4mL/min。

9.如权利要求1～3之一所述的铜藻多糖酶解物，其特征在于：冷冻离心在转速8000～10000rpm、温度4～15℃条件下进行，离心时间为5～15min。

10.如权利要求1所述的铜藻多糖酶解物在制备调节肠道菌群失调的食品或药物中的应用。