CN105174493A - 一种水产养殖用发酵型中草药水质改良剂的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水产养殖用发酵型中草药水质改良剂的制备方法及其应用，属于水产养殖技术领域。其由枯草芽孢杆菌CGMCC？1.1413和植物乳杆菌CGMCC？1.557两株具不同性状和生态活性的微生物菌株，混合发酵具抑菌和提高免疫力的鱼腥草、黄芪等中草药，制成液态发酵型中草药水质改良剂。本发明有效地提高了中草药的水溶性和生物可利用性，将微生物与中草药有机地结合，使用方便，使用量小，每亩水面每米水深的最小用量仅为0.5公斤，不受环境条件的影响；使用后效果稳定，可有效地去除或转化养殖水体中的氨氮和亚硝酸氮，抑制和拮抗弧菌等病原生物，减少养殖中后期有害物质的积累，提高养殖生物机体的免疫力，达到生物净水防病的目的，减轻病害所造成的经济损失，保证养殖产量和质量。

Description

一种水产养殖用发酵型中草药水质改良剂的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种水产养殖用发酵型中草药水质改良剂的制备方法及其应用，属于水产养殖技术领域。

背景技术

改革开放以来，我国的水产养殖业取得了突飞猛进的发展，成为世界上唯一养殖产量超过捕捞产量的渔业大国。我国现有的水产养殖业大多秉承了以“密、混、轮”为技术特征的传统养殖模式，即以多品种、高密度、大量施肥投饵而获得高产量的养殖模式。为了提高单位水体的养殖产量，往往过分地增加水体营养，过度投饵、施肥和加大放养密度，致使水中氮、磷猛增，透明度下降，水质恶化，水体中的饵料和养殖品种的代谢物大量积聚于池塘底部，底质污染严重。水体和底质中过量的有机质分解不仅可消耗水体中的溶解氧，使水体环境处于缺氧状态，同时可释放出许多有害物质，如氨氮、亚硝酸盐和硫化氢等，直接危害水体中的养殖生物，或引起养殖生物的应激反应。对水产动物，产生应激的起因主要是环境因素造成的。低溶氧、低pH值、高水温、高密度、感染寄生虫以及分子氨、硫化氢等有毒物质都会造成养殖对象产生程度不同的应激反应。动物应激的生理学表现的主要指标是体内肾上腺素和皮质醇大量产生或长期处于较高水平，使其合成代谢降低，分解代谢升高，抑制生长和繁殖活动。应激反应也会抑制动物的免疫功能，导致病害。生产中很多难以治愈的顽固性的鱼病往往是长期处于应激反应的结果。据调查，除了寄生虫病之外，所有的“细菌性”、“病毒性”病症几乎都与慢性、长期应激有关联。在天然水体中，各种有益菌和致病微生物是共存的，处于一种平衡状态。而当水体环境因子产生异常时，这种平衡状态将被打破，导致水产动物处于一种应激状态，生理功能紊乱，逐渐感染疾病。因此从生态学角度来看，尽管养殖水体是一个极为复杂的水生生态系统，但不论其多复杂，主要是水生生物—病原—环境三者之间的平衡关系。养殖水体生态环境的控制已成为发展我国水产养殖的关键问题。

目前在水产养殖环境控制上，微生物制剂受到极大的关注。其安全性高、使用方便、成本低、控制效果好，但当水体中病原生物大量繁殖时因受生物竞争的影响而效果不佳。而在病原控制上，当前的主要措施仍是消毒剂和抗生素，虽然具有一定的效果，但存在风险隐患。中草药因具有天然、高效、毒副作用少、资源丰富等优点，在水产动物病害防治和抗应激上日益受到重视。但中草药成分复杂、药理性不明确、提取困难、水溶性不佳等又影响了其在水产养殖水体环境和病害控制上的应用。因此构建一种使用方便、安全无害、兼具微生物制剂净水和中草药抑菌抗应激功能于一体、能在短时间内快速净化水质、恢复水产动物生理机能、提高免疫的微生物发酵中草药产品显得十分重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种水产养殖用发酵型中草药水质改良剂及制备方法及其应用，利用两种特异性微生物菌种经合理组配，形成混合菌种，在以糖蜜等为基础的培养液中发酵具抑菌和提高免疫力的中草药，生成含微生物活菌的发酵型中草药制剂。将制剂直接投入养殖水体，可有效地去除或转化养殖水体中的氨氮和亚硝酸氮，抑制和拮抗弧菌等病原生物，减少养殖中后期有害物质的积累，提高养殖生物机体的免疫力，达到生物净水防病的目的，减轻病害所造成的经济损失，保证养殖产量和质量。

按照本发明提供的技术方案，一种水产养殖用发酵型中草药水质改良剂的制备方法，所述发酵型中草药水质改良剂为液体制剂，由枯草芽孢杆菌CGMCC1.1413和植物乳杆菌CGMCC1.557组成混合菌在一定培养基和发酵温度下与中草药一同发酵，完成后加工成液体制剂；

按重量份计具体步骤如下：

（1）枯草芽孢杆菌的培养：从试管斜面上取一环枯草芽孢杆菌CGMCC1.1413菌苔，接种到50~100mL灭菌的肉汤培养基中，于30~35℃、100~120r·min^-1摇床上培养24~30h；然后将其接入5~8L经灭菌的肉汤培养基中，于30~35℃、100~120r·min^-1摇床上培养24~30h，制成菌种种子液备用；

（2）植物乳杆菌的培养：从试管斜面上取一环植物乳杆菌CGMCC1.557菌苔，接种到50~100mL灭菌的MRS液体培养基中，于32~37℃静置培养30~40h；然后将其接入5~8L经灭菌的MRS液体培养基中，于32~37℃静置培养28~32h，制成菌种种子液备用；

（3）混合菌的组合：取步骤（1）培养至活菌浓度≥10⁸CFU·mL^-1的枯草芽孢杆菌和步骤（2）中培养至活菌浓度≥10⁸CFU·mL^-1的植物乳杆菌各5~8L，放入经灭菌的25L桶中混合，得到菌种混合种子液备用；

（4）中草药的微生物发酵：在1.0吨不锈钢发酵罐中加入总体积600~700L的液体发酵培养基，经121℃灭菌15min后冷却备用；将步骤（3）所得菌种混合种子液10~16L接入发酵罐，在32~37℃、转速40~80r·min^-1的条件下培养28~35h，待菌液浓度≥10⁸CFU·mL^-1时，调pH值为3.2~3.8，用5L塑料桶分装，最后包装入库，得到产品水产养殖用发酵型中草药水质改良剂。

步骤（1）中所述的肉汤液体培养基为：蛋白胨10g·L^-1，牛肉膏5g·L^-1，NaCl5g·L^-1，调节pH值6.8~7.2，经121℃灭菌20min后冷却备用；

步骤（2）中所述的MRS液体培养基为，牛肉膏10g·L^-1，蛋白胨10g·L^-1，酵母膏5g·L^-1，葡萄糖5g·L^-1，柠檬酸二胺2g·L^-1，吐温801g·L^-1，乙酸钠5g·L^-1，磷酸氢二钾2g·L^-1，硫酸镁0.2g·L^-1、硫酸锰0.05g·L^-1，碳酸钙20g·L^-1，调节pH值6.4~6.6，经121℃灭菌15min后冷却备用；

步骤（4）中所述液体发酵培养基，其组份比例按重量份数计：糖蜜12~18份，大豆粉3~7份，酵母膏3~7份，乙酸钠1~3份，硫酸镁0.1~0.5份，磷酸氢二钾1~2份，中草药12~20份，水50~60份，于室温下在发酵罐中溶解混合，调节溶液pH值至6.4~6.6，121℃灭菌15min，冷却后备用。

步骤（1）中所得菌种种子液的OD₆₀₀值为0.9~1.2，活菌数≥10⁸CFU·mL^-1；步骤（2）中所得菌种种子液活菌数≥10⁸CFU·mL^-1。

所述糖蜜中糖分含量≥55%。

所述中草药为100目以上的粉状混合物，其组份比例按重量份数计：鱼腥草35~45份，金银花12~18份，黄芪10~20份，黄芩10~15份，甘草10~15份。

采用乳酸和碳酸氢钠调节pH值。

所述水产养殖用发酵型中草药水质改良剂的应用，将水产养殖用发酵型中草药水质改良剂投放于水质待改善的养殖池塘中，用量为0.5~1kg/亩·米水深，连用3~5天。

本发明中各组分的作用原理如下：

（1）枯草芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌（Basillussubtilis）是芽孢杆菌属的一种，单个菌体0.7～0.8μm×2～3μm，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢大小为0.6～0.9μm×1.0～1.5μm，椭圆至柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。枯草芽孢杆菌菌液是枯草芽孢杆菌的发酵生产的，在菌体生长过程中能产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，对水环境中的病原微生物有明显的抑制作用；枯草芽孢杆菌可刺激水产养殖动物生长发育，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力；枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，可使中草药的药用成份释放，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用；枯草芽孢杆菌在生长过程中可吸收利用水中的COD、氨氮、亚硝酸盐等，具有较好的净水效果。本发明利用其发酵中草药，释放中草药有效药用成份，并通过抑菌、净水等多种功能来修复水体环境。

（2）植物乳杆菌：植物乳杆菌（Lactobacillusplantarμm）是乳酸菌的一种，菌种为直或弯的圆端直杆菌，通常为0.9~1.2μm×3.0~8.0μm，单个、成对或短链状。通常缺乏鞭毛，但能运动。革兰氏阳性，不生芽孢。兼性厌氧，表面菌落直径约3mm，凸起，呈圆形，表面光滑，细密，色白，偶尔呈浅黄或深黄色。属化能异养菌，生长需要营养丰富的培养基，需要泛酸钙和烟酸，但不需要硫胺素、吡哆醛或吡哆胺、叶酸、维生素B₁₂。能发酵戊糖或葡萄糖酸盐，终产物中85%以上是乳酸。通常不还原硝酸盐，不液化明胶，接触酶和氧化酶皆阴性。能产生DL-乳酸，有1,6-二磷酸果糖醛缩酶和单磷酸己糖途径的活性，能在葡萄酸盐中生长，并产CO₂。发酵1分子的核糖或其他的戊糖生成1分子的乳酸和1分子的乙酸。15℃能生长，通常最适生长温度为30～35℃。此菌与其他乳酸菌的区别在于此菌的活菌数比较高，能大量的产酸，使水中的pH值稳定不升高，而且其产出的酸性物质能降解重金属；由于此菌是兼性好氧，在繁殖过程中能产出特有的乳酸杆菌素，乳酸杆菌素是一种生物型的防腐剂。在养殖中后期，由于动物的粪便和残饵料增加，会下沉到池塘的底部，并且腐烂，滋生很多病菌，生成大量的氨氮和亚硝酸盐，使底部偷死现象严重。如果长期使用植物乳酸杆菌，就能很好的抑制底部粪便和残饵料的腐烂，也就降低了氨氮和亚硝酸盐的增加，大量减少了化工降解素的用量，使养殖成本降低。

此外，植物乳杆菌具有一定的免疫调节作用；对致病菌有抑制作用；可降低血清胆固醇含量和预防心血管疾病；维持肠道内菌群平衡；促进营养物质吸收；缓解乳糖不耐症；抑制肿瘤细胞的形成等。本发明利用其发酵中草药，释放中草药有效药用成份，并通过其分泌乳酸和乳酸杆菌素来抑菌、转化去除水体中的亚硝酸盐等。

（3）鱼腥草：精细棕黄色粉末，为鱼腥草全草的干燥品粉碎物，具有清热解毒，消痈排浓，利尿通淋功能。用于防治肺痈吐脓，痰热喘咳，热痢，热淋，痈肿疮毒。本发明应用鱼腥草作为抗菌抑菌、清热解毒的药物，防止弧菌、气单胞菌等侵染水产生物机体。

（4）金银花：金银花又名忍冬，自古被誉为清热解毒的良药。它性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪。金银花既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等症，均效果显著。金银花含有绿原酸、木犀草素苷等药理活性成分，对溶血性链球菌、金黄葡萄球菌等多种致病菌及上呼吸道感染致病病毒等有较强的抑制力，另外还可增强免疫力、抗早孕、护肝、抗肿瘤、消炎、解热、止血（凝血）、抑制肠道吸收胆固醇等，其临床用途非常广泛，可与其它药物配伍用于治疗呼吸道感染、菌痢、急性泌尿系统感染、高血压等40余种病症。本发明应用金银花抗菌抗病毒，提高水产生物机体的免疫力。

（5）黄芪：黄芪又名绵芪，主产于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等地。黄芪性甘温，归肺经，有补气升阳、益卫固表之功能。经常用黄芪配伍琼珍灵芝煎汤或泡水代茶饮，具有良好的防病保健作用。现代医学研究表明，黄芪有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。黄芪不仅能扩张冠状动脉，改善心肌供血，提高免疫功能，而且能够延缓细胞衰老的进程。本发明应用黄芪抗应激，提高水产生物机体的免疫力。

（6）黄芩：黄芩别名山茶根、土金茶根，是唇形科黄芩属多年生草本植物；肉质根茎肥厚，叶坚纸质，生于向阳草坡地、休荒地上，海拔60～1300（1700～2000）米，产于黑龙江，辽宁，内蒙古，河北，河南，甘肃，陕西，山西，山东，四川等地，中国北方多数省区都可种植。俄罗斯东西伯利亚，蒙古，朝鲜，日本均有分布。黄芩的根入药，味苦、性寒，有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。主治温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痢疾、咳血、目赤、胎动不安、高血压、痈肿疖疮等症。黄芩的临床抗菌性比黄连好，而且不产生抗药性。本发明应用黄芩作为抗菌抑菌、清热解毒的药物，防止弧菌、气单胞菌等侵染水产生物机体。

（7）甘草：甘草别名国老、甜草、乌拉尔甘草、甜根子，豆科、甘草属多年生草本，根与根状茎粗壮，是一种补益中草药。药用部位是根及根茎，药材性状根呈圆柱形，长25～100厘米，直径0.6～3.5厘米。外皮松紧不一，表面红棕色或灰棕色。根茎呈圆柱形，表面有芽痕，断面中部有髓。气微，味甜而特殊。甘草多生长在干旱、半干旱的荒漠草原、沙漠边缘和黄土丘陵地带。根和根状茎供药用。功能主治清热解毒、祛痰止咳、脘腹等。可调和某些药物的烈性，如可缓和大黄、芒硝的泻下作用及其对胃肠道的刺激。甘草还有抗炎，抗过敏作用，能保护发炎的咽喉和气管粘膜。甘草浸膏和甘草酸对某些毒物有类似葡萄糖醛酸的解毒作用。本发明应用甘草作为调和、解毒的药物，提高中草药抗菌抗病毒功效，减少毒性影响。

生物材料样品保藏：

枯草芽孢杆菌Basillussubtilis，CGMCC1.1413，公开于中国普通微生物菌种保藏管理中心，网址http://www.bnbio.com/p_28/p_45328.html；植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，CGMCC1.557，公开于中国普通微生物菌种保藏管理中心，网址http://www.bnbio.com/p_66/p_50866.html。

本发明的有益效果：本发明利用枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌两株具不同性状和生态活性的微生物菌株，混合发酵具抑菌和提高免疫力的鱼腥草、黄芪等中草药，生成含微生物活菌的发酵型中草药制剂，集净化水质、抑制病原、修复肠道、保肝护肝、促进消化、防病促长等多功能于一体，可直接泼洒，使用方便，使用量小，每亩水面每米水深的最小用量仅为0.5公斤，不受环境条件的影响，特别是提高了中草药的水溶性和生物可利用性，将微生物与中草药有机地结合在一起；使用后可有效地去除或转化养殖水体中的氨氮和亚硝酸氮，抑制和拮抗弧菌等病原生物，减少养殖中后期有害物质的积累，提高养殖生物机体的免疫力，达到生物净水防病的目的，减轻病害所造成的经济损失，保证养殖产量和质量。

具体实施方式

实施例1：一种水产养殖用发酵型中草药水质改良剂及制备方法，采用以下工艺步骤：

（1）枯草芽孢杆菌的培养：从试管斜面上取一环枯草芽孢杆菌（Basillussubtilis，CGMCC1.1413，由由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供）菌苔，接种到50mL灭菌的肉汤培养基中，于30℃、120r·min^-1摇床上培养24h。然后将其接入5L经灭菌的肉汤培养基中，于30℃、120r·min^-1摇床上培养24h，制成菌种种子液备用。此时菌液的OD₆₀₀值约等于1.0，活菌数≥10⁸CFU·mL^-1。

所述的肉汤液体培养基，含蛋白胨10g·L^-1，牛肉膏5g·L^-1，NaCl5g·L^-1，

调节pH7.0，经121℃灭菌20min后冷却备用。

（2）植物乳杆菌的培养：从试管斜面上取一环植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum，CGMCC1.557，由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供）菌苔，接种到50mL灭菌的MRS液体培养基中，于35℃静置培养36h。然后将其接入5L经灭菌的MRS液体培养基中，于35℃静置培养30h，制成菌种种子液备用。此时菌液的活菌数≥10⁸CFU·mL^-1。

所述的MRS液体培养基为，牛肉膏10g·L^-1，蛋白胨10g·L^-1，酵母膏5g·L^-1，葡萄糖5g·L^-1，柠檬酸二胺2g·L^-1，吐温801g·L^-1，乙酸钠5g·L^-1，磷酸氢二钾2g·L^-1，硫酸镁0.2g·L^-1、硫酸锰0.05g·L^-1，碳酸钙20g·L^-1，调节pH6.5，经121℃灭菌15min后冷却备用。

（3）混合菌的组合：取上述培养至活菌浓度≥10⁸CFU·mL^-1的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌各5L，放入经灭菌的25L桶中混合，备用。

（4）中草药的微生物发酵：在1.0吨不锈钢发酵罐中加入总体积700L的液体发酵培养基，经121℃灭菌15min后冷却备用。将上述菌种混合种子液10L接入发酵罐，在35℃、转速60r·min^-1的条件下培养30h，待菌液浓度≥10⁸CFU·mL^-1时，调pH为3.5，用5L塑料桶分装，最后包装入库。

所述的液体发酵培养基，其组份比例按重量份数计：糖蜜（糖分含量≥55%）15份，大豆粉7份，酵母膏5份，乙酸钠2份，硫酸镁0.2份，磷酸氢二钾1份，中草药18份，水51.8份，于室温下在发酵罐中溶解混合，调节溶液pH值至6.5，121℃灭菌15min，冷却后备用。

所述中草药为100目以上的粉状混合物，其组份比例按重量份数计：鱼腥草40份，金银花15份，黄芪15份，黄芩15份，甘草15份。

所述的不锈钢发酵罐为常规设备，在市场上购买，无任何特殊要求，采用通常的加工方法。

实施例2：一种水产养殖用水产养殖用发酵型中草药水质改良剂及制备方法，采用以下工艺步骤：

（1）枯草芽孢杆菌的培养：从试管斜面上取一环枯草芽孢杆菌（Basillussubtilis，CGMCC1.1413，由由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供）菌苔，接种到100mL灭菌的肉汤培养基中，于35℃、100r·min^-1摇床上培养28h。然后将其接入8L经灭菌的肉汤培养基中，于35℃、100r·min^-1摇床上培养28h，制成菌种种子液备用。此时菌液的OD₆₀₀值约等于1.0，活菌数≥10⁸CFU·mL^-1。

所述的肉汤液体培养基，含蛋白胨10g·L^-1，牛肉膏5g·L^-1，NaCl5g·L^-1，调节pH7.2，经121℃灭菌20min后冷却备用。

（2）植物乳杆菌的培养：从试管斜面上取一环植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum，CGMCC1.557，由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供）菌苔，接种到100mL灭菌的MRS液体培养基中，于37℃静置培养30h。然后将其接入8L经灭菌的MRS液体培养基中，于37℃静置培养28h，制成菌种种子液备用。此时菌液的活菌数≥10⁸CFU·mL^-1。

所述的MRS液体培养基为，牛肉膏10g·L^-1，蛋白胨10g·L^-1，酵母膏5g·L^-1，葡萄糖5g·L^-1，柠檬酸二胺2g·L^-1，吐温801g·L^-1，乙酸钠5g·L^-1，磷酸氢二钾2g·L^-1，硫酸镁0.2g·L^-1、硫酸锰0.05g·L^-1，碳酸钙20g·L^-1，调节pH6.6，经121℃灭菌15min后冷却备用。

（3）混合菌的组合：取上述培养至活菌浓度≥10⁸CFU·mL^-1的枯草芽孢杆菌8L和植物乳杆菌5L，放入经灭菌的25L桶中混合，备用。

（4）中草药的微生物发酵：在1.0吨不锈钢发酵罐中加入总体积600L的液体发酵培养基，经121℃灭菌15min后冷却备用。将上述菌种混合种子液10L接入发酵罐，在35℃、转速60r·min^-1的条件下培养30h，待菌液浓度≥10⁸CFU·mL^-1时，调pH为3.5，用5L塑料桶分装，最后包装入库。

所述的液体发酵培养基，其组份比例按重量份数计：糖蜜（糖分含量≥55%）15份，大豆粉5份，酵母膏5份，乙酸钠2份，硫酸镁0.1份，磷酸氢二钾1份，中草药15份，水56.9份，于室温下在发酵罐中溶解混合，调节溶液pH值至6.5，121℃灭菌15min，冷却后备用。

所述中草药为100目以上的粉状混合物，其组份比例按重量份数计：鱼腥草38份，金银花16份，黄芪16份，黄芩15份，甘草15份。

所述的不锈钢发酵罐为常规设备，在市场上购买，无任何特殊要求，采用通常的加工方法。

实施例3：一种水产养殖用水产养殖用发酵型中草药水质改良剂及制备方法，采用以下工艺步骤：

（1）枯草芽孢杆菌的培养：从试管斜面上取一环枯草芽孢杆菌（Basillus

subtilis，CGMCC1.1413，由由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供）菌苔，接种到75mL灭菌的肉汤培养基中，于30℃、110r·min^-1摇床上培养30h。然后将其接入5L经灭菌的肉汤培养基中，于30℃、110r·min^-1摇床上培养30h，制成菌种种子液备用。此时菌液的OD₆₀₀值约等于1.0，活菌数≥10⁸CFU·mL^-1。

所述的肉汤液体培养基，含蛋白胨10g·L^-1，牛肉膏5g·L^-1，NaCl5g·L^-1，调节pH7.0，经121℃灭菌20min后冷却备用。

（2）植物乳杆菌的培养：从试管斜面上取一环植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum，CGMCC1.557，由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供）菌苔，接种到50mL灭菌的MRS液体培养基中，于32℃静置培养40h。然后将其接入5L经灭菌的MRS液体培养基中，于32℃静置培养32h，制成菌种种子液备用。此时菌液的活菌数≥10⁸CFU·mL^-1。

所述的MRS液体培养基为，牛肉膏10g·L^-1，蛋白胨10g·L^-1，酵母膏5g·L^-1，葡萄糖5g·L^-1，柠檬酸二胺2g·L^-1，吐温801g·L^-1，乙酸钠5g·L^-1，磷酸氢二钾2g·L^-1，硫酸镁0.2g·L^-1、硫酸锰0.05g·L^-1，碳酸钙20g·L^-1，调节pH6.4，经121℃灭菌15min后冷却备用。

（3）混合菌的组合：取上述培养至活菌浓度≥10⁸CFU·mL^-1的枯草芽孢杆菌6L和植物乳杆菌5L，放入经灭菌的25L桶中混合，备用。

（4）中草药的微生物发酵：在1.0吨不锈钢发酵罐中加入总体积700L的液体发酵培养基，经121℃灭菌15min后冷却备用。将上述菌种混合种子液10L接入发酵罐，在32℃、转速40r·min^-1的条件下培养35h，待菌液浓度≥10⁸CFU·mL^-1时，调pH为3.5，用5L塑料桶分装，最后包装入库。

所述的液体发酵培养基，其组份比例按重量份数计：糖蜜（糖分含量≥55%）18份，大豆粉3份，酵母膏3份，乙酸钠1份，硫酸镁0.1份，磷酸氢二钾1份，中草药20份，水53.9份，于室温下在发酵罐中溶解混合，调节溶液pH值至6.5，121℃灭菌15min，冷却后备用。

所述中草药为100目以上的粉状混合物，其组份比例按重量份数计：鱼腥草40份，金银花12份，黄芪18份，黄芩15份，甘草15份。

所述的不锈钢发酵罐为常规设备，在市场上购买，无任何特殊要求，采用通常的加工方法。

应用实施例1应用于浙江地区的鳜鱼养殖

浙江湖州地区的鳜鱼养殖池塘，面积20亩，水深2.0米，因大量投饲冰鲜饵料鱼，导致高温季节池塘水质过浓，水色不好，水质中氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等分别达到1.78mg/L、0.65mg/L和0.40mg/L，超标严重。底质发黑发臭，影响鳜鱼的生长，病害严重，水体中检出嗜水性气单胞菌。在一晴天上午10点左右将将按实例1配方的发酵型中草药水质改良剂应用于养殖池塘中，用量为0.5kg/亩·米水深，连用3天。用后5天水色好转，透明度增大至30cm，底质臭味消失，水体中氨氮、亚硝酸盐和硫化氢含量降至0.75mg/L、0.15mg/L和0.12mg/L，嗜水性气单胞菌未检出，鱼类活动恢复正常。

应用实施例2应用于广东地区的罗非鱼养殖

广东茂名地区的罗非鱼养殖塘，面积15亩，水深1.5米，夏季高温时池塘水质过浓，水色不好，水质中氨氮、亚硝酸氮分别达到2.06mg/L、0.45mg/L，超标严重，水体中无乳链球菌达5.2×10⁵个/mL，影响罗非鱼的生长。在一晴天上午10点左右将将按实例2配方的发酵型中草药水质改良剂应用于养殖池塘中，用量为0.8kg/亩·米水深，连用3天。用后5天水色好转，由浓绿色转为浅黄绿色，透明度增大；水体中氨氮、亚硝酸氮含量降至0.52mg/L和0.15mg/L；无乳链球菌数量下降为7.8×10³个/mL，罗非鱼摄食正常。

应用实施例3应用于江苏地区的南美白对虾养殖

江苏苏州地区的南美白对虾养殖塘，面积为25亩，水深1.2米以上。6月夏初时节发现有白便现象，此时水面藻类较多，蓝藻占30%以上，水质氨氮达1.25mg/L，亚硝酸盐达0.38mg/L。对虾肝脏发红，肠道细长，空肠空胃，反应迟钝。将按实例3配方的发酵型中草药水质改良剂均匀泼洒于养殖池中，用量为1kg/亩·米水深，连续使用3天。停用二天后分析可见，与不用的对照池塘相比，使用的池塘水色明显好转，氨氮下降至0.56mg/L，亚硝酸盐下降至0.11mg/L，南美白对虾摄食增加，胃肠填充物增多，肝脏红肿减退，白便减少70%，南美白对虾的不健康状况得到有效改善。

Claims (7)

1.一种水产养殖用发酵型中草药水质改良剂的制备方法，其特征是：所述发酵型中草药水质改良剂为液体制剂，由枯草芽孢杆菌CGMCC1.1413和植物乳杆菌CGMCC1.557组成混合菌在一定培养基和发酵温度下与中草药一同发酵，完成后加工成液体制剂；

按重量份计具体步骤如下：

（1）枯草芽孢杆菌的培养：从试管斜面上取一环枯草芽孢杆菌CGMCC1.1413菌苔，接种到50~100mL灭菌的肉汤培养基中，于30~35℃、100~120r·min^-1摇床上培养24~30h；然后将其接入5~8L经灭菌的肉汤培养基中，于30~35℃、100~120r·min^-1摇床上培养24~30h，制成菌种种子液备用；

（2）植物乳杆菌的培养：从试管斜面上取一环植物乳杆菌CGMCC1.557菌苔，接种到50~100mL灭菌的MRS液体培养基中，于32~37℃静置培养30~40h；然后将其接入5~8L经灭菌的MRS液体培养基中，于32~37℃静置培养28~32h，制成菌种种子液备用；

（3）混合菌的组合：取步骤（1）培养至活菌浓度≥10⁸CFU·mL^-1的枯草芽孢杆菌和步骤（2）中培养至活菌浓度≥10⁸CFU·mL^-1的植物乳杆菌各5~8L，放入经灭菌的25L桶中混合，得到菌种混合种子液备用；

（4）中草药的微生物发酵：在1.0吨不锈钢发酵罐中加入总体积600~700L的液体发酵培养基，经121℃灭菌15min后冷却备用；将步骤（3）所得菌种混合种子液10~16L接入发酵罐，在32~37℃、转速40~80r·min^-1的条件下培养28~35h，待菌液浓度≥10⁸CFU·mL^-1时，调pH值为3.2~3.8，用5L塑料桶分装，最后包装入库，得到产品水产养殖用发酵型中草药水质改良剂。

2.如权利要求1所述水产养殖用发酵型中草药水质改良剂的制备方法，其特征是：步骤（1）中所述的肉汤液体培养基为：蛋白胨10g·L^-1，牛肉膏5g·L^-1，NaCl5g·L^-1，调节pH值6.8~7.2，经121℃灭菌20min后冷却备用；

步骤（2）中所述的MRS液体培养基为，牛肉膏10g·L^-1，蛋白胨10g·L^-1，酵母膏5g·L^-1，葡萄糖5g·L^-1，柠檬酸二胺2g·L^-1，吐温801g·L^-1，乙酸钠5g·L^-1，磷酸氢二钾2g·L^-1，硫酸镁0.2g·L^-1、硫酸锰0.05g·L^-1，碳酸钙20g·L^-1，调节pH值6.4~6.6，经121℃灭菌15min后冷却备用；

步骤（4）中所述液体发酵培养基，其组份比例按重量份数计：糖蜜12~18份，大豆粉3~7份，酵母膏3~7份，乙酸钠1~3份，硫酸镁0.1~0.5份，磷酸氢二钾1~2份，中草药12~20份，水50~60份，于室温下在发酵罐中溶解混合，调节溶液pH值至6.4~6.6，121℃灭菌15min，冷却后备用。

3.如权利要求1所述水产养殖用发酵型中草药水质改良剂的制备方法，其特征是：步骤（1）中所得菌种种子液的OD₆₀₀值为0.9~1.2，活菌数≥10⁸CFU·mL^-1；步骤（2）中所得菌种种子液活菌数≥10⁸CFU·mL^-1。

4.如权利要求2所述水产养殖用发酵型中草药水质改良剂的制备方法，其特征是：所述糖蜜中糖分含量≥55%。

5.如权利要求2所述水产养殖用发酵型中草药水质改良剂的制备方法，其特征是：所述中草药为100目以上的粉状混合物，其组份比例按重量份数计：鱼腥草35~45份，金银花12~18份，黄芪10~20份，黄芩10~15份，甘草10~15份。

6.如权利要求1-5之一所述水产养殖用发酵型中草药水质改良剂的制备方法，其特征是：采用乳酸和碳酸氢钠调节pH值。

7.权利要求1所述水产养殖用发酵型中草药水质改良剂的应用，其特征是：将水产养殖用发酵型中草药水质改良剂投放于水质待改善的养殖池塘中，用量为0.5~1kg/亩·米水深，连用3~5天。