CN104293722A

CN104293722A - 高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂及其制备方法

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Publication number: CN104293722A
Application number: CN201410568427.1A
Authority: CN
Inventors: 杨长根; 兰春春
Original assignee: ZHEJIANG SHANGSHENG AGRICULTURE DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: ZHEJIANG SHANGSHENG AGRICULTURE DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2014-10-23
Filing date: 2014-10-23
Publication date: 2015-01-21

Abstract

本发明涉及一种高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂及其制备方法，属于水产养殖技术领域。其主要取短乳杆菌、脱氮副球菌的高浓度培养物和乳酸、聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯，按重量比例充分混合，经灌装机灌装后封口，每个包装净含量为5L。本发明可直接投入养殖水体，快速有效降解养殖水体中的蛋白质、碳水化合物等有机物质，去除水体中氨氮、亚硝酸盐等有害氮素，不增加水体耗氧率，降低并维持水体pH的稳定，拮抗水体中的有害微生物、防止水草腐烂，促进养殖生物的摄食，优化和修复养殖环境，为高温期的养殖生物营造一个健康良好的水体生态环境。

Description

高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂及其制备方法，属于水产养殖技术领域。

背景技术

随着经济的快速发展和养殖业者对高产高效益的追求，中国的水产养殖朝着高密度、集约化、规模化的方向发展，形成了高生物负载量和高投入量的养殖模式，使得水体的富营养化日益严重。水体富营养化的根本原因是植物性营养元素（氮、磷）的含量过高，而氮磷等植物性营养元素来自工业废水、生活污水的不当排放以及水产养殖中过量投入饲料、渔肥等产生的自身污染。

养殖水体富营养化的直观表现是水体中氮磷元素含量高，水体中的藻类（主要是蓝藻）短时间内大量繁殖并聚集，造成水体pH升高，溶氧下降，氨氮和亚硝态氮对养殖生物产生毒性。尤其在高温期间，随着水温的不断升高，养殖水体中的有害微生物剧增，水体中残剩的肥料、饲料、生物排泄物和代谢产物不断地累积，可分解产生氨氮、亚硝酸盐等有害物质，降低水体溶氧，影响水环境质量，危害养殖生物健康。而此时因藻类大量生长，使水体pH值上升，加剧了这种危害作用。因此如何在保证高温期间养殖生物安全的前提下有效净化养殖水质、降低水质pH和氮素含量是养殖业者关注的焦点。

近年来，相关的研究和应用取得了一定的效果，主要是通过外源添加高活性的微生物来达到净化的目的，但同样存在诸多问题。在水产养殖水体的净化上，多采用安全高效的微生物控制技术，如EM菌、芽孢杆菌等，成本低、使用方便、效果显著，可有效控制水体的有机污染，降低水体中氨氮、亚硝酸盐的污染水平。但目前所使用的这类微生物制剂多为好氧性微生物，在高温季节使用会加大水体的耗氧，使得本身含量已不高的溶解变得更低，甚至可导致水体缺氧。而低溶氧又反过来抑制微生物本身的活性。同时此类微生物对水体pH的降低和稳定效果不佳。而高pH下一些无机氮素对养殖生物的毒性会增强。因此水产养殖在高温期的一项重点工作是水质的健康管理，降低pH、有效去除氮素，这需要开发一种环境友好的，集净化水质、防止缺氧、降碱脱氮于一体的功能性生物制剂，为水产养殖的良性发展提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂及其制备方法，利用短乳杆菌、脱氮副球菌的高浓度培养物和乳酸、聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯，经合理加工和复配后直接投入养殖水体，快速有效降解养殖水体中的蛋白质、碳水化合物等有机物质，去除水体中氨氮、亚硝酸盐等有害氮素，不增加水体耗氧率，降低并维持水体pH的稳定，拮抗水体中的有害微生物、防止水草腐烂，促进养殖生物的摄食，优化和修复养殖环境，为高温期的养殖生物营造一个健康良好的水体生态环境。

本发明为解决上述技术问题而采用的技术方案是：一种高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂，按重量份计包括：短乳杆菌的高浓度培养物45~55份，脱氮副球菌的高浓度培养物35~50份，乳酸3~5份，聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯1~2份。将上述物料混合均匀后装入包装瓶中，即得产品高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂。

一种高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂的制备方法，其主要步骤如下：

（1）短乳杆菌的高浓度培养物制备：从试管斜面上取一环短乳杆菌菌苔，接种到50 mL经过灭菌处理的MRS液体培养基中，于35 ℃静置培养40 h；然后将其接入5 L经过灭菌处理的MRS液体培养基中，于35 ℃静置培养30 h，制成菌种种子液备用；此时菌种种子液的活菌数≥10⁹CFU·mL^-1；

在0.5吨不锈钢发酵罐中加入总体积350 L的液体发酵培养基，经121 ℃灭菌处理15 min后冷却备用；

将上述菌种种子液接入不锈钢发酵罐，在35 ℃、转速120 r·min^-1的条件下培养30 h，待菌种种子液浓度≥10⁹CFU·mL^-1时放入经灭菌的500 L桶中备用；

（2）脱氮副球菌的高浓度培养物制备：从试管斜面上取一环脱氮副球菌菌苔，接种到50 mL经过灭菌处理的LB液体培养基中，于30 ℃静置培养30 h；然后将其接入5 L经过灭菌处理的LB液体培养基中，于30 ℃静置培养28h，制成菌种种子液备用；此时菌种种子液的活菌数≥10⁹CFU·mL^-1；

在0.5吨不锈钢发酵罐中加入总体积350 L的液体发酵培养基，经121 ℃灭菌15 min后冷却备用；

将上述菌种种子液接入不锈钢发酵罐，在30 ℃、转速120 r·min^-1的条件下培养30 h，待菌种种子液浓度≥10⁹CFU·mL^-1时放入经灭菌的500 L桶中备用；

（3）混合：先将短乳杆菌的高浓度培养物和脱氮副球菌的高浓度培养物混合，然后加入乳酸，最后加入聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯，混匀后包装。

进一步地，在本发明的所述步骤（1）中，所述的MRS液体培养基包括：牛肉膏10 g·L^-1，蛋白胨10 g·L^-1，酵母膏5 g·L^-1，葡萄糖 5 g·L^-1，柠檬酸二胺2 g·L^-1，吐温80 1 g·L^-1，乙酸钠5 g·L^-1，磷酸氢二钾2 g·L^-1，硫酸镁0.2 g·L^-1、硫酸锰0.05 g·L^-1，碳酸钙20 g·L^-1，将所述MRS液体培养基的pH调节至6.5，经121℃灭菌处理15 min后冷却备用。

进一步地，在本发明的所述步骤（2）中，所述的LB液体培养基为基础富集培养基，包括蛋白胨10 g·L^-1，酵母膏5 g·L^-1，NaCl 10 g·L^-1 ，将所述LB液体培养基的pH调节至7.0，经121℃灭菌处理20min后冷却备用。

进一步地，本发明的所述液体发酵培养基，其组份比例按重量份数计包括：糖蜜（糖分含量≥55%）15份、大豆粉5份、鲜鱼膏5份、酵母膏5份、乙酸钠2份、硫酸镁 0.1份、磷酸氢二钾 1.0份、水66.9份，将所有组份于室温条件下在不锈钢发酵罐中溶解混合，将所述液体发酵培养基的pH值调节至6.5~6.8，经121 ℃灭菌处理15 min，冷却后备用。

本发明中各组分的作用原理如下：

1、短乳杆菌：短乳杆菌（Lactobacillus brevis）属乳杆菌目、乳杆菌科、短乳杆菌属，分布较广，在植物茎叶表面附有，在泡菜中更为常见，在人和动物体消化系统中以小肠最多。短乳杆菌细胞呈杆状，不形成芽孢，革兰氏染色阳性；接触酶、氧化酶阴性；在空气中不生长，兼性厌氧，发酵葡萄糖、葡萄糖酸钠、阿拉伯糖、果糖、核糖、乳糖、麦芽糖、蜜二糖、半乳糖产酸；能在与人体小肠胆盐浓度接近的环境中生长；食盐的适宜浓度大致为2%~3%；在pH 6.0附近生长良好，在pH 3.0的环境中也能表现出良好的耐酸性，但pH过低或者过高都会抑制其生长；发酵的适宜温度是29.5~30℃。

短乳杆菌可自行产生天然的抗生素—乳酸杆菌素（Lactobacillin），乳酸杆菌素具有刺激机体分泌抗体、提高免疫力和促进有益菌的生长、选择性杀死致病菌等重要功能。短乳杆菌产生的多糖能诱导机体产生干扰素，引起非特异性免疫。短乳杆菌有较强的去除亚硝酸盐能力，若亚硝酸盐含量在250 mg·L^-1以内，接种短乳杆菌48 h亚硝酸盐就可全部去除，短乳杆菌去除亚硝酸盐的最适pH值为5.0~6.0，最适温度为30℃；若亚硝酸盐含量在200 mg·L^-1以内，短乳杆菌对亚硝酸盐的去除量与底物浓度有着极显著的线性关系。

本发明利用其分泌乳酸和乳酸杆菌素来降低水体pH值，清除水体的有机污染，同时转化去除水体中的亚硝酸盐、高温期使用不耗水体溶氧等。

2、脱氮副球菌：脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）属于变形菌门(Proteobacteria)、甲型变形菌纲(Alphaproteobacteria)、红细菌目(Rhodobacterales)、红细菌科(Rhodobacteraceae)、副球菌属(Paracoccus)，是一种革兰氏阴性菌，球状或短杆状成簇，不运动。菌落直径大小约2-3mm，圆形、边缘完整、平滑、白色不透明。它可在温度5~37℃，pH7.0~8.5范围内生长，最适生长温度为25~35℃，最适pH为7.5左右。它们生活在好氧或厌氧环境中，适应性强，常见于土壤以及自然或人工的湖泊或海洋中。脱氮副球菌可以在好氧条件下进行反硝化作用，同时又是一种兼性化能无机自养细菌。既能在H₂、O₂、CO₂同时存在的情况下进行自养生长，也能利用各种糖类、氨基酸等有机物进行异养生长。另外对有机污染物具有很高的降解能力。本发明主要将其作为菌种来生产菌液，利用其具有的异养硝化和好氧反硝化能力，实现在溶氧变化较大的条件下有效治理水产养殖水体的无机氮素污染。

3、乳酸：学名为2-羟基丙酸，是一种化合物，在多种生物化学过程中起作用。其分子式为C₃H₆O₃，是一个含有羟基的羧酸，因此是一个α-羟酸（AHA）。在水溶液中它的羧基释放出一个质子，而产生乳酸根离子CH3CHOHCOO^－。乳酸有很强的防腐保鲜功效，可用在果酒、饮料、肉类、食品、糕点制作、蔬菜腌制以及罐头加工、粮食加工、水果的贮藏，具有调节 pH 值、延长保质期、调味、保持食品色泽、提高产品质量等作用；在农药方面可用于生产缓释农药，例如除草剂，具有对农作物和土壤无毒无害且高效的特点；还用于青饲料贮藏剂、牧草成熟剂；在饲料中作为生长促进剂。乳酸可以降低胃内的 pH 值，起到活化消化酶、改善氨基酸消化能力的作用，并对肠道上皮的生长有好处。

本发明利用其对水体pH的缓冲和降低作用来净化水质，并保持产品中微生物的贮存有效期和活性。

4、聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯：俗名为吐温-40，表面活性剂。分子式为：C₂₂H₄₂O₆·（C₂H₄O）n。本品为琥珀色油状液体，相对密度1.05～1.10，折射率1.470，粘度0.4～0.6Pa·s （25℃），HLB值15.6。溶于水、稀酸、稀碱和多数有机溶剂，不溶于植物油和矿物油。用作乳化剂、增溶剂、稳定剂、扩散剂和纤维润滑剂。本发明利用其缓冲和稳定作用。

本发明具有如下优点：本发明利用短乳杆菌、脱氮副球菌的高浓度培养物和乳酸、聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯，经合理加工和复配后直接投入养殖水体，快速有效降解养殖水体中的蛋白质、碳水化合物等有机物质，去除水体中氨氮、亚硝酸盐等有害氮素，不增加水体耗氧率，降低并维持水体pH的稳定，拮抗水体中的有害微生物、防止水草腐烂，促进养殖生物的摄食，优化和修复养殖环境，为高温期的养殖生物营造一个健康良好的水体生态环境。

本发明的高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂使用方便，使用量小，每亩水面每米水深的用量仅为1000~1500 mL；使用后不会造成水体缺氧，可显著降低水体中有机物质、氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等有害物质的含量，降低pH值，改善水质和底质的环境质量；可拮抗水体中的病原微生物，防止水草腐烂，改善高温期养殖生物的摄食情况和生存条件，提高养殖产量和质量。

需要说明的是：本发明中的短乳杆菌Lactobacillus brevis，CGMCC1.558，由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供；本发明中的脱氮副球菌Paracoccus denitrificans，ACCC10489，由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供。

具体实施方式

下述的不锈钢发酵罐、混合机、包装机等均为常规设备，在市场上购买，无任何特殊要求，采用通常的加工方法。本发明所采用的物料来源方便，均可在市场上购买。

下面本发明将结合实施例作进一步描述：

实施例1：

以下实施例均采用如下工艺步骤：

（1）MRS液体培养基的制备：该MRS液体培养基包括：牛肉膏10 g·L^-1，蛋白胨10 g·L^-1，酵母膏5 g·L^-1，葡萄糖 5 g·L^-1，柠檬酸二胺2 g·L^-1，吐温80 1 g·L^-1，乙酸钠5 g·L^-1，磷酸氢二钾2 g·L^-1，硫酸镁0.2 g·L^-1、硫酸锰0.05 g·L^-1，碳酸钙20 g·L^-1，将MRS液体培养基的pH调节至6.5，经121℃灭菌处理15 min后冷却备用。

（2）LB液体培养基的制备：LB液体培养基的LB液体培养基为基础富集培养基，包括蛋白胨10 g·L^-1，酵母膏5 g·L^-1，NaCl 10 g·L^-1 ，将LB液体培养基的pH调节至7.0，经121℃灭菌处理20min后冷却备用。

（3）液体发酵培养基的制备：液体发酵培养基，其组份比例按重量份数计包括：糖蜜（糖分含量≥55%）15份、大豆粉5份、鲜鱼膏5份、酵母膏5份、乙酸钠2份、硫酸镁 0.1份、磷酸氢二钾 1.0份、水66.9份，将所有组份于室温条件下在不锈钢发酵罐中溶解混合，将所述液体发酵培养基的pH值调节至6.5~6.8，经121 ℃灭菌处理15 min，冷却后备用。

（4）短乳杆菌的高浓度培养物制备：从试管斜面上取一环短乳杆菌菌苔，接种到50 mL经过灭菌处理的MRS液体培养基中，于35 ℃静置培养40 h；然后将其接入5 L经过灭菌处理的MRS液体培养基中，于35 ℃静置培养30 h，制成菌种种子液备用；此时菌种种子液的活菌数≥10⁹CFU·mL^-1。

在0.5吨不锈钢发酵罐中加入总体积350 L的液体发酵培养基，经121 ℃灭菌处理15 min后冷却备用。

将上述菌种种子液接入该0.5吨不锈钢发酵罐，在35 ℃、转速120 r·min^-1的条件下培养30 h，待菌种种子液浓度≥10⁹CFU·mL^-1时放入经灭菌的500 L桶中备用。

（5）脱氮副球菌的高浓度培养物制备：从试管斜面上取一环脱氮副球菌菌苔，接种到50 mL经过灭菌处理的LB液体培养基中，于30 ℃静置培养30 h；然后将其接入5 L经过灭菌处理的LB液体培养基中，于30 ℃静置培养28h，制成菌种种子液备用；此时菌种种子液的活菌数≥10⁹CFU·mL^-1。

在0.5吨不锈钢发酵罐中加入总体积350 L的液体发酵培养基，经121 ℃灭菌15 min后冷却备用。

将上述菌种种子液接入该0.5吨不锈钢发酵罐，在30 ℃、转速120 r·min^-1的条件下培养30 h，待菌种种子液浓度≥10⁹CFU·mL^-1时放入经灭菌的500 L桶中备用。

（6）混合：按重量份数计，取短乳杆菌的高浓度培养物45~55份，脱氮副球菌的高浓度培养物35~50份，乳酸3~5份，聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯1~2份，混合均匀后装入包装瓶中，即得产品高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂。

实施例1：

在上述步骤（3）中，将液体发酵培养基的pH值调节至6.5~6.8；

在上述步骤（6）中，按重量份数计，取短乳杆菌的高浓度培养物50份，脱氮副球菌的高浓度培养物45份，乳酸4份，聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯1份，混合均匀后装入包装瓶中，即得产品高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂。

应用实施例1：

取实施例1制备的产品在浙江上虞一白对虾养殖池塘使用。

面积10亩，夏季高温（8月）时池塘水质过浓，水色不好，呈深绿色，底质有些黑臭，水体氨氮达1.2 mg·L^-1，亚硝酸盐为0.35 mg·L^-1，溶解氧为4.2 mg·L^-1，水体透明度低，为18 cm，pH达9.2，虾类生长不良。第一天上午10点将上述配方的生物制剂用于养殖池塘中，用量为1000g/亩·米水深。用后2天池塘中的亚硝酸盐降为0.18 mg·L^-1，氨氮降为0.8 mg·L^-1，溶解氧为4.8 mg·L^-1，pH为8.8水质变得清爽；5天后水体透明度增大至25cm，底质臭味消退，虾类活动恢复正常，蜕壳增加。

实施例2：

在上述步骤（3）中，将液体发酵培养基的pH值调节至6.5~6.8；

在上述步骤（6）中，按重量份数计，取短乳杆菌的高浓度培养物48份，脱氮副球菌的高浓度培养物46份，乳酸5份，聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯1份，混合均匀后装入包装瓶中，即得产品高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂。

应用实施例2：

取实施例2制备的产品在浙江湖州一加州鲈鱼养殖池塘使用。

面积15亩，夏季高温（8月）时池塘水质过浓，水色不好，呈深绿色，底质有些黑臭，水体氨氮达1.6 mg·L^-1，亚硝酸盐为0.32 mg·L^-1，溶解氧为4.0 mg·L^-1，pH达8.9，水体透明度低，为15 cm，鱼类生长摄食情况不佳。第一天上午10点将上述配方的生物制剂用于养殖池塘中，用量为1000g/亩·米水深。用后2天池塘中的亚硝酸盐降为0.20 mg·L^-1，氨氮降为0.95 mg·L^-1，溶解氧为4.5 mg·L^-1，pH为8.6，水质变得清爽；5天后水体透明度增大至23 cm，底质臭味消退，鱼类活动恢复正常，摄食增加。

实施例3：

在上述步骤（3）中，将液体发酵培养基的pH值调节至6.5~6.8；

在上述步骤（6）中，按重量份数计，取短乳杆菌的高浓度培养物47份，脱氮副球菌的高浓度培养物46份，乳酸5份，聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯2份，混合均匀后装入包装瓶中，即得产品高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂。

应用实施例3:

取实施例3制备的产品在浙江杭州一甲鱼养殖池塘使用。

面积10亩，夏季高温（7月）时池塘水质过浓，水色不好，呈深绿色，底质有些黑臭，水体氨氮达2.3 mg·L^-1，亚硝酸盐为0.38 mg·L^-1，溶解氧为3.8 mg·L^-1，pH达8.9，水体透明度低，为20 cm，甲鱼生长不良。第一天上午10点将上述配方的生物制剂用于养殖池塘中，用量为1500g/亩·米水深。用后2天池塘中的亚硝酸盐降为0.12 mg·L^-1，氨氮降为0.82 mg·L^-1，溶解氧为5.0 mg·L^-1，pH为8.5，水质变得清爽；5天后水体透明度增大至30 cm，底质臭味消退，甲鱼活动恢复正常，摄食增加。

Claims

1.一种高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂，其特征在于：按重量份计包括：短乳杆菌的高浓度培养物45~55份，脱氮副球菌的高浓度培养物35~50份，乳酸3~5份，聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯1~2份。

2.根据权利要求1所述的高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂的制备方法，其主要步骤如下：

（1）短乳杆菌的高浓度培养物制备：从试管斜面上取一环短乳杆菌菌苔，接种到50 mL经过灭菌处理的MRS液体培养基中，于35 ℃静置培养40 h；然后将其接入5 L经过灭菌处理的MRS液体培养基中，于35 ℃静置培养30 h，制成菌种种子液备用；

（2）脱氮副球菌的高浓度培养物制备：从试管斜面上取一环脱氮副球菌菌苔，接种到50 mL经过灭菌处理的LB液体培养基中，于30 ℃静置培养30 h；然后将其接入5 L经过灭菌处理的LB液体培养基中，于30 ℃静置培养28h，制成菌种种子液备用；

3.根据权利要求2所述的高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂的制备方法，其特征在于：在所述步骤（1）中，所述的MRS液体培养基包括：牛肉膏10 g·L^-1，蛋白胨10 g·L^-1，酵母膏5 g·L^-1，葡萄糖 5 g·L^-1，柠檬酸二胺2 g·L^-1，吐温80 1 g·L^-1，乙酸钠5 g·L^-1，磷酸氢二钾2 g·L^-1，硫酸镁0.2 g·L^-1、硫酸锰0.05 g·L^-1，碳酸钙20 g·L^-1，将所述MRS液体培养基的pH调节至6.5，经121℃灭菌处理15 min后冷却备用。

4.根据权利要求2所述的高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂的制备方法，其特征在于：在所述步骤（2）中，所述的LB液体培养基为基础富集培养基，包括蛋白胨10 g·L^-1，酵母膏5 g·L^-1，NaCl 10 g·L^-1 ，将所述LB液体培养基的pH调节至7.0，经121℃灭菌处理20min后冷却备用。

5.根据权利要求2所述的高温期间养殖水体降碱脱氮的生物制剂的制备方法，其特征在于：所述的液体发酵培养基，其组份比例按重量份数计包括：糖蜜（糖分含量≥55%）15份、大豆粉5份、鲜鱼膏5份、酵母膏5份、乙酸钠2份、硫酸镁 0.1份、磷酸氢二钾 1.0份、水66.9份，将所有组份于室温条件下在不锈钢发酵罐中溶解混合，将所述液体发酵培养基的pH值调节至6.5~6.8，经121 ℃灭菌处理15 min，冷却后备用。