CN104911168B - I型胶原蛋白高亲和力多肽及其应用 - Google Patents

I型胶原蛋白高亲和力多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了I型胶原蛋白高亲和力多肽及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基质金属蛋白酶‑2前体中的片段，其内含有基质金属蛋白酶‑14的识别位点。经研究发现，I型胶原蛋白高亲和力多肽与I型胶原蛋白或胶原蛋白模拟(GPO)9以较高亲和力结合，能够非侵袭性在体显示纤维化病变，因此可以作为纤维化成像剂，有望用于纤维化的诊断、监测及疗效评估。

Description

I型胶原蛋白高亲和力多肽及其应用
技术领域
本发明属于多肽领域，具体涉及I型胶原蛋白高亲和力多肽，还涉及该多肽在制备纤维化成像剂中的应用。
背景技术
纤维化是人体组织器官重要的、典型的病理过程之一。它主要表现为组织内实质细胞减少纤维结缔组织增多，可发生在几乎全身任何组织，能够导致器官结构破坏和功能减退。如果得不到有效的控制，最终将导致器官功能衰竭，甚至死亡。纤维化与多种疾病密切相关，主要包括：(1)心血管病：如动脉硬化、充血性心力衰竭；(2)肺病：如特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病；(3)肝病：各种类型的肝炎或肝损伤导致的肝硬化；(4)肾病：如慢性肾小球肾炎、糖尿病肾病、狼疮性肾病等；(5)眼病：如糖尿病视网膜病变和老年黄斑变性；(6)皮肤肌肉疾病：如硬皮病、皮肌炎等。因此，对纤维化的诊断、进展监测、疗效评估显得非常重要，是临床非常关注的问题。
穿刺活检是纤维化检测和定性的金标准，但作为一种侵入性有创检查，不宜反复进行。超声、CT和MRI等传统影像学检查方法主要依靠形态学改变做出诊断，但纤维化病变早期往往缺乏形态学异常。放射性核素显像也是检查纤维化病变的重要手段之一。近年，已有多种放射性核素标记药物用于纤维化显像的实验和临床研究，如18F-FDG葡萄糖代谢显像，18F-脯氨酸显像，68Ga-生长抑素类似物显像以及18F-FBEM标记的白细胞显像等。这些显像方式可用于评估纤维化病变的活动性与预后，为其鉴别诊断提供依据。但是，上述显像方法不具特异性，不是直接显示纤维化病变，而是显示纤维化发展过程中某些阶段的间接征象，只能作为一种补充检查手段。因此，目前临床上缺少一种可靠的纤维化显像方式。
研制能够显示纤维化特征性病理改变的新型分子显像剂可能是解决上述问题的有效途径。纤维化的主要病理特点是细胞外基质中胶原蛋白的大量堆积，而且胶原蛋白堆积量与纤维化的严重程度呈正相关。因此，胶原蛋白可作为纤维化显像的理想靶标。靶向胶原蛋白的多肽分子，因分子量小，血管穿透性好，血浆清除速度快，较抗体或受体等大分子更适合作为体内示踪剂。Muzard筛选出能够与I型胶原蛋白结合的血小板胶原蛋白受体糖蛋白IV模拟肽，但用99mTc标记的该多肽显像剂在正常肝脏组织有高度摄取，不利于在体显示肝纤维化病变。因此，急需一种能够在体显示肝纤维化病变的多肽显像剂，并能用于纤维化的诊断、监测及疗效评估。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供I型胶原蛋白高亲和力多肽；本发明的目的之二在于提供含有所述I型胶原蛋白高亲和力多肽的衍生物；本发明的目的之三在于提供I型胶原蛋白高亲和力多肽的应用；本发明的目的之四在于提供I型胶原蛋白高亲和力多肽的衍生物的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、I型胶原蛋白高亲和力多肽，所述I型胶原蛋白高亲和力多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、含有权利要求1所述I型胶原蛋白高亲和力多肽的衍生物，所述衍生物为I型胶原蛋白高亲和力多肽的氨基端修饰生物素。
或在I型胶原蛋白高亲和力多肽的羧基端通过间隔γ-氨基丁酸连接的能够螯合99mTc的氨基酸序列。
优选的，所述能够螯合99mTc的氨基酸序列为甘氨酸-右旋丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸构成的4氨基序列。
3、所述I型胶原蛋白高亲和力多肽在制备纤维化成像剂中的应用。
4、权利要求3或4所述的I型胶原蛋白高亲和力多肽的衍生物在制备纤维化成像剂中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了I型胶原蛋白高亲和力多肽，多肽序列为Cys Pro Lys Glu Ser Cys Asn Leu Phe Val Leu Lys Asp(以下简称CBP1495)，CBP1495为基质金属蛋白酶-2前体中的片段，其内含有基质金属蛋白酶-14的识别位点。在对CBP1495的研究发现，该多肽能够与I型胶原蛋白或胶原蛋白模拟(GPO)9以较高亲和力结合。能够用于Western Blot、ELISA及组织化学等体外示踪胶原蛋白，还能以非侵袭性在体显示纤维化病变，有望用于纤维化的诊断、监测及疗效评估；并且CBP1495多肽可以用核素标记，在体内血浆清除速度快，软组织本底低，有利于减少受检者接受的辐射剂量。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为ITC分析结果(A.1mmol/L CBP1495滴定4μmol/L I型胶原蛋白；B.0.8mmol/LCBP1495滴定0.1mmol/L(GPO)9；C.1mmol/L RP1584滴定4μmol/L I型胶原蛋白；D.300μmol/LCBP1495滴定20μmol/L BSA)。
图2为CBP1495与I型胶原蛋白的结合能力分析结果(A.考马斯亮蓝染色、Biotin-CBP1495及Biotin-RP1584的Western Blot分析对I型胶原蛋白溶液的检测；B.不同浓度Biotin-CBP1495及Biotin-RP1584对I型胶原蛋白的ELISA分析；C.大鼠尾皮肤及小鼠肌腱的HE、Masson染色及Biotin-CBP1495和Biotin-RP1584的组织化学染色(放大倍数×100)；注：Biotin-RP1584为阴性对照；****P<0.0001，NS没有统计学差异)。
图3为99mTc-CBP1495理化性质鉴定(A.99mTc-CBP1495室温下放置0、1、2、4、8h的RCP；B.三氯乙酸蛋白沉淀实验结果；C.未标记多肽CBP1495gagg的HPLC分析；D.99mTc-CBP1495经HPLC后的洗脱液T-A曲线)。
图4为99mTc-CBP1495在正常实验动物体内的示踪和分布(A.99mTc-CBP1495示踪动力学实验中实测值T-A曲线与拟合值T-A曲线；B.静脉注射37MBq99mTc-CBP1495后1h大耳兔前位静态显像；C.静脉注射37MBq99mTc-CBP1495后，大耳兔前位动态显像(5min/帧，60min)；D.静脉注射7.4MBq99mTc-CBP1495后，健康小鼠体内主要脏器不同时间对标记多肽的摄取分布)。
图5为肺纤维化、肝纤维化大鼠模型及健康大鼠(正常对照)的肺、肝组织HE、Masson染色结果(放大倍数×100)。
图6为纤维化大鼠99mTc-CBP1495显像(A.静脉注射99mTc-CBP1495后1、2、4h肺纤维化、肝纤维化大鼠模型及健康大鼠(正常对照)平面显像；B.静脉注射99mTc-CBP1495后2h肺纤维化、肝纤维化大鼠模型及健康大鼠断层显像)。
图7为对99mTc-CBP1495摄取的评估(A.肺纤维化、肝纤维化大鼠模型及健康大鼠的肺、肝组织羟脯氨酸含量(Hyp,μg/g)；B.静脉注射99mTc-CBP1495后2h，肺纤维化、肝纤维化大鼠模型及健康大鼠的肺、肝组织对标记多肽的摄取(ID％/g)；C.肺组织Hyp含量与标记多肽摄取量(2h)的线性相关性分析；D.肝组织Hyp含量与标记多肽摄取量(2h)的线性相关性分析；注：****P<0.0001)。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、多肽的合成
根据I型胶原蛋白结构，利用软件设计高亲和力多肽，具体序列为：CPKESCNLFVLKD(以下简称CBP1495)，该多肽是基质金属蛋白酶-2前体中的片段，其内含有基质金属蛋白酶-14的识别位点。为了能够使CBP1495显色，在CBP1495的氨基酸用生物素标记，并在生物素多肽之间加入了3个甘氨酸作为间隔。此外，在CBP1495的羧基端连接了能够螯合99mTc的4氨基酸序列(-G-(D)A-G-G)和作为间隔的γ-氨基丁酸(Aba)。同时设计随机十三肽RP1584作为阴性对照，并设计胶原蛋白模拟肽(GPO)9，具体序列如表1所示。(GPO)9能够在溶液中自发形成类似胶原蛋白的三螺旋结构。然后委托上海强耀生物技术有限公司固相法合成如表1所示的多肽，将合成的多肽经高效液相色谱法(HPLC)纯化，并通过质谱鉴定，结果显示纯化后的多肽纯度均>95％。
表1、合成的多肽
注：Aba代表γ-氨基丁酸；(D)A代表右旋丙氨酸；O代表羟脯氨酸；
实施例2、CBP1495与I型胶原蛋白或胶原蛋白模拟肽(GPO)9的亲和力分析
亲和力分析使用通过等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry，ITC)，ITC仪采用美国GE公司MicroCal iTC200。主要实验参数设置为：温度25℃，补偿热量5μcal/s，连续滴定19次，每次间隔时间为120秒，搅拌速率为1000rpm。I型胶原蛋白溶液(溶剂20mmol/L乙酸，纯度>95％，Sigma公司)用NaOH溶液调pH值至7左右后，通过透析法将溶剂置换成10mmol/L NaCl，其余溶液也使用10mmol/L NaCl作为溶剂。各种多肽或蛋白滴定时的浓度为：(1)1mmol/L CBP1495滴定4μmol/L I型胶原蛋白；(2)0.8mmol/L CBP1495滴定0.1mmol/L(GPO)9；(3)1mmol/L RP1584滴定4μmol/L I型胶原蛋白；(4)300μmol/L CBP1495滴定20μmol/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)，滴定结果如图1和表2所示。结果显示CBP1495能够与I型胶原蛋白或胶原蛋白模拟肽(GPO)9发生相互作用(图1中A和B)。在25℃溶液状态下，CBP1495与I型胶原蛋白结合的Kd值为23.75μM，而与(GPO)9结合的Kd值为0.633μM(表2)，Kd值越小，则亲和力越高。CBP1495与I型胶原蛋白结合的数目比N值推算为34，表示34个CBP1495分子结合一个I型胶原蛋白分子。换言之，1个胶原蛋白分子上可能有34个CBP1495的结合位点；而CBP1495与(GPO)9结合时的N值0.458，接近于0.5，提示1个CBP1495分子可能与2个(GPO)9分子结合(表2)。CBP1495与I型胶原蛋白或(GPO)9发生结合后的自由能变化ΔG均为负值，表明两种结合反应都是自发进行(表2)。作为阴性对照，多肽RP1584与I型胶原蛋白或CBP1495与BSA之间均没有检测到明显的结合反应发生(见图1中C和D)。
表2、ITC实验获得的CBP1495与I型胶原蛋白或(GPO)9结合的热力学参数
实施例3、分析CBP1495与I型胶原蛋白的结合能力
(1)马斯亮蓝染色和Western Blot分析
采用5％浓缩胶与6％分离胶，将0.4μmol/L I型胶原蛋白溶液与上样缓冲液混匀加热变性后，取10μl上样。恒压80V电泳至溴酚蓝进入分离胶时，提升电压至120V电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，然后进行常规考马斯亮蓝染色。Western Blot采用恒压100V，90min，冰浴下转膜，5％脱脂奶粉室温封闭2h，然后分别用10μmol/L Biotin-CBP1495和Biotin-RP1584室温下孵2h。1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(HRP-streptavidin)室温孵育2h后加入显色剂显像，结果如图2中A所示。结果显示，I型胶原蛋白为三条α链形成的三螺旋结构，其凝胶电泳后考马斯亮蓝染色呈4条泳带。通过Western Blot分析，Biotin-CBP1495能够结合其中的三条泳带。
(2)ELISA分析
以0.05mol/L pH 9.6的Na2CO3-NaHCO3缓冲液(CBS)将胶原蛋白溶液稀释成0.04μmol/L后，取100μl/孔，加入96孔酶联板，37℃包埋2h。PBST(0.5％Tween-20)清洗后，分别加入200μmol/L、20μmol/L和2μmol/L的Biotin-CBP1495和Biotin-RP1584(0.5％BSA稀释)，100μl/孔，37℃反应1h。PBST(0.5％Tween-20)清洗后，加入1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-streptavidin)，100μl/孔，37℃反应30min。PBST(0.5％Tween-20)清洗后，加入TMB显色液，100μl/孔，室温避光反应15min后，加入终止液，50μl/孔。最后使用酶标仪于450nm读取每孔吸光值，结果如图2中B所示。结果显示，Biotin-CBP1495能够与包埋于酶联板的I型胶原蛋白结合而呈阳性，结合数量随浓度增加而增多。
(3)组织学染色分析
对富含I型胶原蛋白的大鼠尾皮肤及小鼠肌腱用福尔马林固定后行石蜡包埋与切片。石蜡切片常规脱蜡至水后，分别行苏木精-伊红(HE)、Masson及组织化学染色分析。HE与Masson染色均采用常规标准方法。组织化学染色主要步骤为：3％H2O2去除内源性过氧化物酶及2％EDTA沸水高温修复抗原后，滴加20μmol/L的Biotin-CBP1495和Biotin-RP1584覆盖切片组织，4℃过夜。然后滴加HRP-streptavidin工作液(SP-9000，中杉金桥)，室温孵育15min后，DAB显色，苏木素复染，温水返蓝，常规脱水后封片。然后观察，结果如图2中C所示。结果显示，Biotin-CBP1495可以在富含I型胶原蛋白的大鼠尾皮肤及小鼠肌腱中阳性显示组织中的胶原纤维，与Masson染色显示的胶原纤维分布基本一致，而Biotin-RP1584组织化学染色结果为阴性。
在上述三个实验中，Biotin-RP1584均为阴性结果，证明了CBP1495与I型胶原蛋白具有较强的结合能力。
实施例4、99mTc-CBP1495的在正常实验动物体内分布
(1)99mTc-CBP1495的制备
99mTc标记方法：向乙酸缓冲液(50mmol/L，pH 4.6)溶解的20μg/20μl多肽CBP1495gagg中，依次加入HCl溶液(200mmol/L，pH 1.0)溶解的SnCl2·H2O 10μg/10μl，Na3PO4溶液(67mmol/L，pH 13～14)150μl，222MBq新鲜高锝酸钠淋洗液100μl，总反应体积280μl。充氮10s后密封，25℃，200rpm振荡30min后完成标记。再加入1mmol/L NaH2PO4溶液15μl调节pH至7.0～7.2。
标记率的测量：分别以氨水展开剂(30％氨水v︰无水乙醇v︰水v为1:2:5)和丙酮展开剂作为移动相进行纸层析。薄层扫描仪(TLC Scanner，B-AR2000-1，德国Eckert&Ziegler公司)测量纸条放射性活度分布并计算标记率。
标记率(％)＝100％－氨水展开剂原点放射性计数占层析条总放射性计数的百分比－丙酮展开剂远端放射性计数占层析条总放射性计数的百分比。
结果显示，99mTc-CBP1495记率为95.06％±1.08％。
(2)99mTc-CBP1495理化性质鉴定
体外稳定性实验：将标记多肽于室温下密封放置，分别于0、1、2、4、8h通过上述纸层析法测定各时相点的放化纯度(RCP)，结果如图3中A所示。结果显示，在室温下放置8h后标记多肽的RCP仍高达93.61％±0.84％，且0、1、2、4、8h各组间RCP无显著差异(P>0.05，图3中A)。表明99mTc-CBP1495标记率高，体外稳定性好，无需纯化即可直接使用。
三氯乙酸蛋白沉淀实验：将99mTc-CBP1495稀释为18.5MBq/ml，分别取25μl、50μl、100μl、200μl、400μl和800μl加入试管中，对照组加入11.1MBq高锝酸钠淋洗液。用生理盐水将各管补充至1ml后，加入100μl正常人血清，混匀后37℃孵育2h。然后，各管加入5％三氯乙酸溶液500μl，充分混匀后各取50μl混悬液，剩余溶液3500rpm室温离心10min，各取50μl上清液。测量混悬液与上清液放射性(cpm)，计算上清液/混悬液放射性比值(NB/T)，并与对照组进行比较，结果如图3中B所示。结果显示，显示加入不同体积99mTc-CBP1495的各组NB/T值无明显差异(P>0.05)，均接近于1，表明标记多肽与血清蛋白没有明显结合。
高效液相(HPLC)分析实验：HPLC设备为美国Waters公司e2695SeparationModule，使用X bridge C18色谱柱(4.6×150mm，填料粒径3.5μm)。主要实验条件：柱温：25℃，波长220nm，上样体积50μl，流速0.6ml/min；流动相A液为水溶解的0.1％三氟乙酸(TFA)，B液为乙腈溶解的0.1％TFA；B液洗脱梯度为0～11min，15％～40％，线性递增；分析时间共16min。同时用EP管收集洗脱液，每管12滴，γ免疫计数仪测量每管放射性计数(cpm)，绘制洗脱液时间-放射性(T-A)曲线，结果如图3中C和D所示。结果显示，99mTc-CBP1495在99mTc标记前后的亲水性无明显变化，保留时间与洗脱液放射性峰时间基本一致，且仅有一个放射性主峰，表明标记多肽成分单一。
油水分配实验：将74MBq(10μl)99mTc-CBP1495、400μl PBS及500μl辛醇混匀后，常温离心12000rpm，4min。分别从有机相和水相中移取10μl和100μl至EP管中，然后γ免疫计数仪测定放射性计数(cpm)。经体积校正后，油/水分配系数＝lg(有机相放射性计数/水相放射性计数)。计算得99mTc-CBP1495的油水分配系数为-3.473±0.014，表明99mTc-CBP1495标记多肽有很强的亲水性。
(3)99mTc-CBP1495在健康小鼠体内分布实验
用生理盐水将99mTc-CBP1495稀释至7.4MBq/200μl，然后取200μl稀释成500ml，取3管1ml测量放射性计数(cpm)，3管放射性计数均值乘以500即得参考源的放射性计数。昆明小鼠35只(购自第三军医大学实验动物中心)，雌性17只，雄性18只，体重18～20g，使用Excel 2010随机分为7组，每组5只。每只小鼠经尾静脉注射99mTc-CBP14957.4MBq/200μl后，分别于1min、5min、10min、30min、60min、120min、240min断头处死。收集血、脑、心、肺、肝、脾、肾、小肠、肌肉、骨，分别称重并测放射性计数(cpm)，经参考源校正后计算每克组织百分注射剂量率(％ID/g)，结果如图4中D所示。结果显示，99mTc-CBP1495在健康小鼠体内肺组织在早期有一过性的短暂高摄取，2h后，除肾脏外，标记多肽在其余主要脏器的分布都基本稳定在低水平，表明该标记多肽仅通过泌尿系统排泄。
(4)99mTc-CBP1495在健康家兔体内的示踪动力学实验
用生理盐水将99mTc-CBP1495稀释至37MBq/200μl。取6只日本大耳兔(购自第三军医大学实验动物中心)，雌雄各半，体重3.2～3.6Kg。每只经耳缘静脉注射37MBq/200μl标记多肽分别于注射后1.5min、3min、5min、10min、30min、60min、120min、240min及480min从对侧耳缘静脉抽血0.1ml，称重后测量放射性计数(cpm)。按血密度1g/ml，计算血样放射性浓度(KBq/L)。应用药物代谢动力学分析软件(DAS 3.1.6)，对6只大耳兔的平均血液放射性浓度-时间数据进行智能化分析，结合I型胶原蛋白在体内分布的实际情况，得出最佳房室模型、拟合曲线及示踪动力学参数，结果如图4中A所示。结果显示99mTc-CBP1495在健康大耳兔体内的示踪动力学过程符合权重为1/C的三室模型，拟合推算的血液放射性浓度C(KBq/L)与注射标记多肽后的时间t(min)关系式为：C(t)＝1474.001e0.57t+358.843e0.028t+92.985e0.004t，获得的示踪动力学参数见表3。
表3、99mTc-CBP1495在健康大耳兔体内的示踪动力学参数
由表3可知，实测值T-A曲线与拟合值T-A曲线非常接近。然后对经静脉注射99mTc-CBP1495后的大耳兔SPECT显像，结果如图4中B和C所示。结果显示，该标记多肽能够较快的从血液中清除进入肾和膀胱，而胆囊及肠道未见显影，表明该99mTc-CBP1495不通过胆道系统排泄。
实施例5、99mTc-CBP1495在纤维化大鼠模型的显像实验
(1)纤维化大鼠模型的构建
22只SD雄性大鼠(购自第三军医大学实验动物中心)，体重180～200g，随机分为3组，肺纤维化模型组8只，肝纤维化模型组8只，正常对照组6只，所有动物常规SPF饲养。由于建模过程中肺纤维化组死亡1只大鼠，肝纤维化组死亡2只大鼠，最终成模的肺纤维化大鼠7只，肝纤维化大鼠6只。
肺纤维化模型构建：以5％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.7ml/100g)，将大鼠固定在鼠板上。颈部皮肤剪毛、消毒后，沿着颈部中央将皮肤切开，用小镊子钝性分离筋膜及肌肉，暴露气管，将1.375mg/mL博莱霉素溶液(日本化药)按5mg/kg经气管注入大鼠肺内。注药后立即使大鼠呈直立位，左右来回旋转并按摩双肺，尽量使药液在双肺内均匀分布。最后缝合皮肤，包扎伤口。术后肌注青霉素2万单位/200g，连续3日，预防感染，4周后成模。
肝纤维化模型构建：体积分数40％的CCL4橄榄油溶液腹腔注射，每周2次，每次0.5ml/200g，10周后成模。
将肺纤维化、肝纤维化大鼠模型及健康大鼠(正常对照)的肺、肝组织进行HE和Masson染色，然后观察，结果如图5所示。结果显示，肺纤维化模型和肝纤维化模型构建成功。
(2)99mTc-CBP1495在实验动物体内的SPECT显像
SPECT显像使用德国SIEMENS公司Symbia T6 SPECT/CT。实验动物经5％水合氯醛腹腔注射麻醉(大耳兔6ml/Kg，大鼠0.7ml/100g)后，取仰卧位固定，静脉给药。能峰140KeV，低能高分辨探头平面静态显像使用矩阵128×128，Zoom 1.0～1.45，采集计数500K；动态显像使用矩阵64×64，Zoom 1.0，1min/帧，采集60min；断层显像使用矩阵128×128，Zoom1.0，18s/帧，双探头各采集16帧。CT参数设置为20mA，80KV，层厚1.0mm。针孔探头使用矩阵256×256，Zoom 2.0，采集计数300K，结果如图6所示。结果显示，与健康大鼠(正常对照)进行比较，肺纤维化大鼠的肺脏及肝纤维化大鼠的肝脏对99mTc-CBP1495的摄取都有明显增加。并且从CT上可以看到肺纤维化大鼠的肺部有纤维条索带，融合图像显示该部位浓聚标记多肽。
(3)大鼠肝肺组织对99mTc-CBP1495的摄取及羟脯氨酸含量的测定
每只大鼠经尾静脉注射29.6MBq的99mTc-CBP1495后2h处死，分别收集肺、肝组织称重并测量放射性计数(cpm)，经参考源校正后计算每克组织百分注射剂量率(％ID/g)。另称取80～110mg肺或肝组织，按照羟脯氨酸测试说明书(中国南京建成生物工程研究所)，采用化学比色法检测组织中羟脯氨酸含量，结果如图7所示。结果显示，肺纤维化大鼠的肺脏及肝纤维大鼠的肝脏的Hyp含量较健康大鼠有显著增加(P<0.0001)，并且定量分析显示，静脉注射99mTc-CBP1495后2h，前两者对标记多肽的摄取(ID％/g)也显著高于健康大鼠(P<0.0001)。而且，肺、肝组织Hyp含量分别与肺、肝组织对标记多肽的摄取量(2h)具有明显的直线正相关性(E P<0.0001)，提示肺、肝组织中胶原蛋白含量的增加，标记多肽的摄取量也随之增加。
本发明使用GraphPad Prism 6.04作统计图与统计学分析，组间比较采用方差分析，P<0.05时差异具有统计学意义。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.I型胶原蛋白高亲和力多肽在制备纤维化成像剂中的应用，其特征在于：所述I型胶原蛋白高亲和力多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含有I型胶原蛋白高亲和力多肽的衍生物在制备纤维化成像剂中的应用，其特征在于：所述衍生物为氨基端修饰生物素的I型胶原蛋白高亲和力多肽；或在羧基端通过间隔γ-氨基丁酸连接的能够螯合99mTc的I型胶原蛋白高亲和力多肽；
所述I型胶原蛋白高亲和力多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述能够螯合99mTc的氨基酸序列为甘氨酸-右旋丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸构成的4氨基序列。
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