CN104910100A - 化合物pac-1或其盐及包含它们的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供无定形形式的化合物PAC-1，包含该无定形形式的化合物PAC-1的口服药物组合物，以及该无定形形式的化合物PAC-1在制备口服药物组合物中的用途。根据本发明，无定形形式的PAC-1显示出明显低于PAC-1晶体的神经毒性，因此更适合开发成药物来治疗例如肿瘤、特别是转移性肿瘤等疾病。

Description

化合物PAC-1或其盐及包含它们的药物组合物

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及ZYS-1（无定形形式的PAC-1）的制备方法、以及包含它的药物组合物及其制药用途。

技术背景

肿瘤是危害人类健康头号杀手，其中恶性肿瘤死亡率位居全部死亡疾病之首。二十世纪中叶以来，人类在肿瘤防治方面投入大量的人力和物力，但其危害仍未能得到有效的控制，其发病率和死亡率仍呈逐年上升趋势。目前肿瘤治疗的三大手段是化疗、放疗及手术治疗，其中化疗是主要手段。随着抗肿瘤药物的不断开发和合理应用，化疗在恶性肿瘤的治疗中占有越来越重要的地位，并呈现从姑息性治疗向根治性治疗的发展趋势。目前常用的抗肿瘤药包括细胞毒类药物、激素药、分子靶向治疗药、生物反应调节剂、肿瘤分化诱导剂、肿瘤血管生成抑制剂以及辅助治疗肿瘤的药物等。其中最常见的是细胞毒类药物，但它在具备高效的同时，也存在毒副反应大、缺乏选择性等缺点。近年来，随着对肿瘤特性和本质的研究深入，抗肿瘤药物治疗正从传统的细胞毒性药物治疗，向针对细胞受体、关键基因和调控分子为靶点的治疗方向发展；抗肿瘤药物临床疗效评价指标也从以往的追求肿瘤瘤体的实质性缩小向延长患者的生存期和/或提高生存质量的转变。而PAC-1正是符合这一发展趋势的靶向型小分子抗肿瘤药物。

PAC-1是美国伊利诺伊大学Quinn P.Peterson教授在对20000多种化合物进行体外筛选中，发现的第一个能够直接激活半胱天冬酶-3酶原（procaspasse-3）的小分子化合物，命名为PAC-1，化学名称是1-Piperazineacetic acid,4-(phenylmethyl)-2-[[2-hydroxy-3-(2-propen-1-yl)phenyl]methylene]，结构如式（I）。研究证明，PAC-1能够选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡，且其诱导凋亡作用与细胞内的procaspasse-3水平呈正相关，而正常细胞的procaspasse-3含量较低，对其杀伤能力就较小，具备了较好的选择性。其作用机理经过研究，证明主要是通过螯合抑制锌离子，使procaspasse-3自体活化为caspase-3，诱导细胞凋亡(Quinn P,et al.,J Mol Biol,2009,388(1):144-158.；Peterson QP,et al.J Med Chem,2009,52(18):5721-5731.)，同时它对多种肿瘤细胞均具有诱导凋亡的作用，且与caspase-3酶原表达呈正相关(Roy S,et al.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(11):6132-6137.)。近期亦有研究显示，高浓度的PAC-1能够从内质网细胞凋亡途径诱导细胞凋亡，表现出独特细胞凋亡的作用特点(West DC,et al.MolPharm.2012,9(5):1425-1434)。

中国专利公开CN101184491A及美国专利公开US2007/0049602A1向大众公开第一个直接激活procaspasse-3的小分子化合物PAC-1，并要求保护PAC-1、PAC-1衍生物文库化合物，包括具有ZZ式、ZZ2式、ZZ3式、ZZ4式的相关化合物及其合成方法；同时对其在癌细胞中选择性诱导细胞凋亡的方法、体外及细胞内直接筛选能修饰procaspasse-3分子的化合物的方法、鉴定或判断癌细胞对于半胱天冬蛋白酶酶原活化化合物处理的潜在敏感性的方法、一种通过鉴定候选癌症患者体内半胱天冬酶原的升高水平来筛选可适用于半胱天冬酶原活化剂治疗的所述候选者的方法进行了保护。国际专利WO2010/091382A1对PAC-1、无神经毒性化合物S-PAC-1及其类似物进行保护。

目前文献报道的PAC-1均是晶体形式。而且，文献报道称已有的PAC-1的晶体形式具有较强的神经毒性（参见Q P.Peterson,D C.Hsu,C J.Novotny,et al.Discovery and Canine Preclinical Assessment of a NontoxicProcaspase-3–Activating Compound，Cancer Res2010;70:7232-7241)，这导致PAC-1开发成药物的前景并不被人看好，例如，其发现者Quinn P.Peterson教授就已经转向了毒性低的PAC-1类似物S-PAC-1的开发。

发明内容

本发明人为解决PAC-1的神经毒性强、在作为药物的应用中受到限制的技术问题进行了深入研究，结果制备得到无定形形式的PAC-1，并发现与已有的PAC-1晶体相比，无定形形式的PAC-1的神经毒性显著降低，从而完成了本发明。

即，本发明如下。

1.下述式（I）表示的化合物PAC-1，其为无定形形式：

2.一种口服药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1所述的化合物PAC-1，以及药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的口服药物组合物，其为片剂、胶囊剂、滴丸剂或丸剂。

4.根据权利要求2或3所述的口服药物组合物，其还包含PAC-1或其盐的晶体形式，且相对于PAC-1或其盐的晶体形式与PAC-1的无定形形式的总量，PAC-1的无定形形式的含量为10重量%以上，优选50重量%以上、更优选80重量%以上、更优选90重量%以上、更优选95重量%以上、更优选97重量%以上、更优选99重量%以上。

5.根据权利要求2～4中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述口服药物组合物用于肿瘤、优选转移性肿瘤的治疗。

6.根据权利要求2～4中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述口服药物组合物用于抑制肿瘤转移。

7.权利要求1所述的化合物PAC-1的无定形形式在制备口服药物组合物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述口服药物组合物用于肿瘤、优选转移性肿瘤的治疗。

9.根据权利要求7所述的用途，其中，所述口服药物组合物用于抑制肿瘤转移。

根据本发明，无定形形式的PAC-1显示出明显低于PAC-1晶体的神经毒性，因此更适合开发成药物来治疗例如肿瘤、特别是转移性肿瘤等疾病。

附图说明

图1.PAC-1及其类似物的化学结构。

图2.PAC-1针晶与ZYS-1的显微镜照片对比。

图3.PAC-1针晶与ZYS-1的扫描电镜照片对比。

图4.PAC-1针晶与ZYS-1的X射线衍射结果对比。其中，图4a为PAC-1针晶的X射线衍射结果，图4b为ZYS-1的X射线衍射结果。

图5.ZYS-1与PAC-1针晶对HGC-27细胞增殖的影响

图6.ZYS-1与PAC-1针晶对K562/A02细胞增殖的影响

图7.ZYS-1与PAC-1针晶对A549细胞增殖的影响

图8.ZYS-1与PAC-1针晶对HT-1080细胞增殖的影响

图9.不同剂量ZYS-1对HGC-27细胞二维迁移的影响（细胞划痕实验）

图10.不同剂量ZYS-1对HGC-27和HT-1080细胞三维迁移的影响（Transwell实验）

图11.不同剂量ZYS-1对HT-1080细胞侵袭的影响（Transwell实验）

图12.ZYS-1对HUVEC细胞增殖及小管生成的影响。A：ZYS-1对HUVEC细胞增殖的影响；B、C：ZYS-1对小管生成的影响。

图13.不同剂量ZYS-1对Caspase-3,NF-κB,VEGF，IXAP蛋白表达的影响。

具体实施方式

在不与本说明书中的定义发生冲突的情况下，本说明书中的术语具有本领域技术人员通常理解的含义，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。

PAC-1

在本说明书中，PAC-1是指一种能够直接激活半胱天冬酶-3酶原（Procaspase-3）的小分子化合物，其化学名称是1-Piperazineacetic acid,4-(phenylmethyl)-2-[[2-hydroxy-3-(2-propen-1-yl)phenyl]methylene]（(E)-N’-(3-烯丙基-2-羟基苯亚甲基)-2-(4-苄基哌嗪-1-基)乙酰肼），结构如式（I），其被认为能够选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡，因而能够作为抗肿瘤药物。

无定形形式的PAC-1

现有技术中报道的PAC-1均以晶体形式存在，且具有较强的神经毒性，这在很大程度上限制了PAC-1作为药物的应用。本发明人意外地发现，无定 形形式的PAC-1显示出明显低于PAC-1晶体的神经毒性。需要说明的是，通常来说，无定形态的药物相对晶型药物具有更高的分散性，因而更有利于药物的吸收，相应地表现出的毒性也应更强，但在本发明中，意外地发现无定形态的PAC-1(即ZYS-1)却表现出更低的毒性。因此，无定形形式的PAC-1的低神经毒性是本领域技术人员无法依据现有技术预料得到的技术效果。

在说明书中，无定形形式的PAC-1也称为ZYS-1，ZYS-1具有典型的无定形物质的特征——无明显的X射线衍射峰。与此相对，在一些情况下，本说明书中的PAC-1也用来特指PAC-1晶体。

所述ZYS-1可以采用例如下述方法来制备，但其制备方法不限于此。所述方法包括：

步骤（1）：将PAC-1的晶体溶于有机溶剂中，得到PAC-1的第一溶液；

步骤（2）：在搅拌下，向步骤（1）中所得的PAC-1的溶液中加入水，得到PAC-1的第二溶液；

步骤（3）：持续搅拌，待析出的固体呈白色或乳白色时，过滤，除去溶剂，得到析出物；

步骤（4）：对所得析出物进行干燥，得到无定形形式的PAC-1。

步骤(1)中，相对于PAC-1的晶体1g，有机溶剂用量可以是例如1～20mL，优选2～10mL，更优选4～6mL。可以采用超声波处理、搅拌、振荡等手段来促进PAC-1晶体的溶解。所述有机溶剂可以是例如选自无水乙醇、95%乙醇、乙腈、乙醚、乙酸乙酯、丙酮和DMSO中的一种或多种，但不限于此。

步骤(2)中，水的用量与步骤(1)中的有机溶剂的用量之比可以是例如1:1～1:50，优选3:1～20:1，更优选5:1～15:1，但不限于此。搅拌速度可以是例如100～5000r/分钟，优选200～1000r/分钟，更优选400～600r/分钟，但不限于此。

步骤(3)中，可以采用抽滤，这样可以加快过滤速度，但不限于此。所述抽滤可以利用真空隔膜泵或水泵、油泵等来实现。

步骤(4)中，所述干燥在常压或减压下进行。

所得ZYS-1可以通过X射线衍射分析来确认。

包含ZYS-1的口服药物组合物

本发明人发现，ZYS-1在口服给药的情况下，显示出明显低于PAC-1晶体的神经毒性。因此，本发明的ZYS-1优选可以被开发成口服药物组合物。

本发明提供一种口服药物组合物，其包含作为活性成分（优选作为唯一活性成分）的ZYS-1，以及药学上可接受的载体。本发明的口服药物组合物中可以包含或不包含PAC-1或其盐的晶体形式，所述PAC-1或其盐的晶体形式例如可以作为活性成分。在包含PAC-1或其盐的晶体形式的情况下，相对于PAC-1的无定形形式、PAC-1或其盐的晶体形式的总量，PAC-1的无定形形式的含量优选为10重量%以上，更优选为50重量%以上，更优选为90重量%以上，更优选为95重量%以上，更优选为97重量%以上，更优选为99重量%以上。所述PAC-1或其盐的晶体形式可以有意添加至本发明的口服药物组合物中，也可以作为所述PAC-1的无定形形式中夹带的杂质添加至本发明的口服药物组合物中。

本发明的口服药物组合物可用于肿瘤的治疗和/或肿瘤转移的治疗，特别是本发明的口服药物组合物可用于转移性肿瘤的治疗。在该用途中，本发明的ZYS-1优选作为唯一活性成分。

在本说明书中，“肿瘤的治疗”是指：对原位肿瘤的治疗。“肿瘤转移的治疗”是指对转移瘤以及转移过程的治疗，例如抑制肿瘤转移。“转移性肿瘤”是指：肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管，血管或其他途经被带到其它组织、器官处继续生长，形成与原发部位肿瘤具有相同类型的肿瘤或异质瘤，该过程称为转移，所形成的同质或异质肿瘤称为转移瘤或转移癌，在该过程中，由于转移瘤处于初期，急需大量的新生血管以供应其迅速生长所需的营养等，因此抑制血管新生能够有效抑制肿瘤的转移。我们把该过程及其过程中新形成的肿瘤统称为转移性肿瘤。

因此，本发明还提供ZYS-1在制备口服药物组合物，优选是用于肿瘤的治疗和/或肿瘤转移的治疗的口服药物组合物，特别是用于转移性肿瘤的治疗的口服药物组合物中的用途。在该用途中，本发明的ZYS-1作为活性成分，优选作为唯一活性成分。

作为所述的药学上可接受的载体，可以由本领域技术人员根据剂型的需要等常规地进行选择。例如，在制备口服液体制剂（液体药物组合物）时，可以将活性成分溶解或悬浮于适当的液体（例如水）中。在制备口服固体制剂（固体药物组合物）时，可以在向活性成分中加入赋形剂以及视需要的粘合剂、崩解剂、滑润剂、着色剂、矫味剂等后，按照常规方法制成片剂、包衣片剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、胶囊剂或丸剂等。作为赋形剂，可使用例如乳糖、玉米淀粉、白糖、葡萄糖、山梨糖醇、结晶纤维素、二氧化硅等；作为粘合剂，可使用例如聚乙烯醇、乙基纤维素、甲基纤维素、阿拉伯胶、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素等；作为滑润剂，可使用例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅等；作为着色剂，可使用允许在医药品中添加的着色剂；作为矫味剂，可使用可可末、薄荷脑、芳香酸、薄荷油、龙脑、桂皮粉等。当然，也可以在上述片剂、颗粒剂上包覆糖衣、明胶衣、以及其它的必要外衣。

治疗方案

本发明还提供一种治疗肿瘤、特别是转移性肿瘤的方法、以及治疗肿瘤转移（例如抑制肿瘤转移）的方法，该方法包括给肿瘤患者施用上述本发明ZYS-1、或者上述包含ZYS-1的口服药物组合物的步骤。所述ZYS-1优选以口服的形式施用。在施用ZYS-1、或者上述的包含ZYS-1的口服药物组合物的情况下，ZYS-1的施用量因症状程度、患者年龄、性别、体重、敏感性差异、施用方法、施用时间、施用间隔、制剂的性质及种类、有效成分的种类等而异，没有特殊限制，但通常成人(体重60kg)每日为0.1～2000mg、优选0.2～1000mg、更优选1～500mg，上述用量通常可每日分1～6次施用。

实施例

实施例1：ZYS-1的制备

取PAC-1针晶1g（参照Quinn P.Peterson等，J.Med.Chem.2009,52,5721–5731的方法制备），经超声溶于DMSO（5mL）中，于500r/min的速率搅拌下，加入50mL水，持续搅拌10min，至析出物呈乳白色，减压滤过，真空干燥，得白色固体。

经显微镜、扫描电镜、X-粉末衍射鉴别，显然得到的是无定形的PAC-1(ZYS-1)的粉末。在显微镜及扫描电镜下可以看到无定形与针晶二者的形态完全不同，针晶表面比较光滑，呈典型的针晶状，而ZYS-1则呈现疏松、多孔的结构，结果见图2-3。对比二者的X-粉末衍射图可知，ZYS-1无明显的特征峰，参见图4。

实施例2：ZYS-1与PAC-1针晶溶解度对比

取适量的ZYS-1与PAC-1针晶分别溶于适量甲醇、无水乙醇、95%乙醇、乙腈、乙醚、乙酸乙酯、丙醇、丙酮中，超声1小时，室温静置24小时，制成过饱和溶液。4000r/min离心5min，取上清液适当稀释，用0.45μm针头滤器过滤，HPLC测定浓度，计算溶解度。

实验结果表明：ZYS-1溶解度高于PAC-1针晶，结果见表1。

表1ZYS-1与PAC-1针晶溶解度对比

实施例3：ZYS-1与PAC-1针晶的体内药代动力学比较

将12只雄性Wistar大鼠随机分为ZYS-1组和PAC-1组，给药前禁食12h，自由饮水。按60mg/Kg计量分别灌胃给予ZYS-1与PAC-1针晶后，于0、5、20、30、45、60、120、180、240、360、480、720min眼眶取血0.5mL，5000r/min离心5min，取血浆200μL，加入丙酮3mL，涡旋1min。在15000r/min离心5min，取上清液，37℃下氮气吹干，加入200μL乙腈复溶，超声10min后，涡旋1min，0.45微孔滤膜过去，取续滤液HPLC检测，计算各时间点血药浓度，绘制血药浓度经时曲线。结果见表2。

结果表明：ZYS-1较PAC-1的大鼠体内生物利用度更高。

表2大鼠体内药动学参数（n=6）

实施例4：ZYS-1普通片的制备

取ZYS-120g，乳糖60g，淀粉58g，糊精58g，微粉硅胶2g，硬脂酸镁2g，混合均匀，压片，得ZYS-1普通片1000片。

实施例5：ZYS-1缓释微球的制备

首先配制含1.5%的海藻酸钠（W/V）、1.5%的淀粉（W/V）、ZYS-110g，的混合水溶液500mL，加入1000mL液体石蜡作为油相，30mL的司盘-80和吐温-80的混合液（7：1）作为乳化剂，搅拌，形成乳液A。

同样，配制100mL8%的CaCl₂溶液，加入300mL液体石蜡，10mL乳化剂（司盘-80：吐温-80—7：1）及适量乙醇，搅拌，形成乳液B。

待二者均形成稳定的乳液后，将乳液B加入乳液A进行交联反应15min，离心得ZYS-1微球，依次用乙酸乙酯、无水乙醇、去离子水洗涤，室温放置干燥。得ZYS-1缓释微球，可用于制备片剂或胶囊等药剂学可接受的其他制剂形式。

实施例6：PAC-1经口给药小鼠急性毒性实验

实验材料：PAC-1针晶（参照Quinn P.Peterson等，J.Med.Chem.2009,52,5721–5731的方法制备），批号：20090818。

试验动物及饲养情况：ICR小鼠，雌雄各半。体重20±2g，由北京维通利华试验动物技术有限公司提供，SPF级饲养，合格证号：SCXK（京）2006-0009；北京科澳协力饲料有限公司提供小鼠繁殖颗粒饲料；动物饲养于北京安贞医院的屏障级（二级）动物室内，日光灯照明，12h明暗周期，室内温度22～24℃，湿度40-47%，送风10-12次/h，实验室许可证号：SYXK（京）2005-0028.小鼠饲养于透明的塑料盒内，按性别分笼饲养，每笼5只。

受试药物配制方法：PAC-1针晶，置研钵中研细，精密称取适量，用0.5%CMC-Na配制成所需浓度。

动物分组：动物禁食（不禁水）11h后，按体重随机分组，每组10只，雌雄各5只，试验共分8组。Ⅰ～Ⅶ为PAC-1不同剂量给药组，药物的组间距为0.7，第Ⅷ组为0.5%CMC-Na阴性对照组。给药剂量分别为1000、700、490、343、240.1、168.1、117.1mg/kg。各给药组分别按动物体重给药，给药体积为0.4mL/10g体重，试验采用一次性灌胃给药法，阴性对照组灌胃等体积的0.5%CMC-Na，给药后3h动物开始喂食。

观察指标：给药后立即观察动物对药物的反应情况（如：一般表现、呼吸、活动、有无惊厥、翻正反射、疼痛反射、对外界刺激的反应性等多项指标）。观察记录动物给药后毒性反应的症状和出现毒性反应的时间、持续时间、恢复时间以及动物发生死亡的时候，立即进行大体解剖，肉眼观察各主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、胃）有无充血、体积增大、变硬、变色等，对于存活动物逐日观察记录7d内有无迟发性死亡和迟发性毒性反应，每隔2d称体重、饲料1次。观察7d结束后，对存活动物进行大体解剖，贯彻各主要脏器情况。将各剂量组动物死亡数用Bliss法计算LD₅₀（95%可信限）。

实验结果：PAC-1一次性灌胃给药对小鼠急性毒性（LD₅₀）剂量为551.61mg/kg，95%的可信限C.L=674.9703～450.8035mg/kg（结果见表3）。1000mg/kg剂量组灌胃给药后动物出现毒性反应的时间为给药后10min，出现明显的神经毒性症状，主要表现为自发活动明显减少，俯卧、腹部贴地、并伴有阵发性跳跃、运动失调、尾巴上翘、流口水症，并继而出现阵挛性抽搐直至角弓反张，呼吸衰竭后死亡，死亡时间主要发生在给药后30～60min内；不死亡动物的主要毒性反应与高剂量组症状相同，但毒性程度相对较低，认为是神经毒性症状，存活动物大部分在给药后3h内恢复正常。100%死亡剂量大于1000mg/kg；0%的死亡剂量为240.1mg/kg；无明显毒性反应的剂量为117.7mg/kg。对死亡动物进行解剖肉眼观察各主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、胃等）未见明显异常。实验小鼠除当天给药死亡的动物外，其他时间均无死亡记录。存活动物观察至给药后7天，动物体重增长、摄食量、外观、行为、分泌物等与对照组比较，均无明显差异；观察结束后对于存活的小鼠进行大体解剖，肉眼观察可见1000、700、490、343mg/kg给药组的部分动物肾脏有不同程度颜色变浅的现象，推测该药物可能造成一定的肾毒性有关，且呈剂量依赖性，但各给药组肾脏系数与对照组比较无统计学差异，其余各主要脏器均未见明显异常。

表3PAC-1一次性灌胃给药对小鼠急性毒性（LD₅₀）影响

实施例7：ZYS-1经口给药小鼠急性毒性实验

实验材料：ZYS-1

试验动物及饲养情况：ICR小鼠，雌雄各半。体重20±2g，由北京维通利华试验动物技术有限公司提供，SPF级饲养，合格证号：SCXK（京）2006-0009；北京科澳协力饲料有限公司提供小鼠繁殖颗粒饲料；动物饲养于北京安贞医院的屏障级（二级）动物室内，日光灯照明，12h明暗周期，室内温度22～24℃，湿度40-47%，送风10-12次/h，实验室许可证号：SYXK（京）2005-0028.小鼠饲养于透明的塑料盒内，按性别分笼饲养，每笼5只。

受试药物配制方法：ZYS-1，白色粉末状。置研钵中研细，药物临用前精密称取，用0.5%CMC-Na配制成所需浓度。

动物分组：动物禁食（不禁水）11h后，按体重随机分组，每组10只，雌雄各5只，试验共分8组。Ⅰ～Ⅷ为PAC-1不同剂量给药组，药物的组间距为0.7，第Ⅸ组为0.5%CMC-Na阴性对照组。给药剂量分别为4164.9、2915.4、2040.8、1428.6、1000、700、490、343mg/kg。各给药组分别按动物体重给药，给药体积为0.4mL/10g体重，试验采用一次性灌胃给药法，阴性对照组灌胃等体积的0.5%CMC-Na，给药后3h动物开始喂食。

观察指标：给药后立即观察动物对药物的反应情况（如：一般表现、呼吸、活动、有无惊厥、翻正反射、疼痛反射、对外界刺激的反应性等多项指标）。观察记录动物给药后毒性反应的症状和出现毒性反应的时间、持续时间、恢复时间以及动物死亡时间，动物死亡后立即进行大体解剖、肉眼观察各主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、胃）有无充血、体积增大、变硬、变色等。对于存活动物逐日观察记录7d内有无迟发性死亡和迟发性毒性反应，每隔2d称体重、饲料1次。观察7d结束后，对存活动物进行大体解剖，观察各主要脏器情况。将各剂量组动物死亡数计算LD₅₀。

实验结果：给药当天，4164.9mg/kg剂量组灌胃给药后动物出现毒性反应的时间为给药后15min，主要症状表现为自发活动明显减少，俯卧、腹部贴地、并伴有阵发性跳跃、运动失调、尾巴上翘、流口水症，并继而出现阵挛性抽搐直至角弓反张，呼吸衰竭后死亡，其毒性反应为明显的神经毒性症状，死亡时间主要发生在给药后6h内。无明显毒性反应剂量为343mg/kg。其它各个剂量组试验动物的主要毒性反应与高剂量组症状相同，但毒性程度相对较低，主要表现为神经毒性症状，存活动物大部分在给药后12h内恢复正常。对死亡动物进行解剖，肉眼观察各主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、胃等）未见明显异常。存活动物观察至给药后7天，动物体重增长、摄食量、外观、行为、分泌物等与对照组比较，均无明显差异；观察结束后对于存活的小鼠进行大体解剖，各主要脏器未见明显异常，结果

见表4。

表4ZYS_-1一次性灌胃给药对小鼠急性毒性（LD50）影响

ZYS-1一次性灌胃给药对小鼠急性毒性（LD₅₀）剂量为1665.7mg/kg，95%的可信限C.L=1091.8～2285.3mg/kg；0%死亡剂量为343mg/kg；无明显毒性反应剂量为343mg/kg。

对比ZYS-1及PAC-1急性毒性实验结果可以看出，ZYS-1具有更低的神经毒性。

实施例8：ZYS-1与PAC-1针晶的抗肿瘤药效学比较

实验细胞：胃癌细胞株HGC-27、非小细胞肺癌A549、人慢性髓系白血病细胞阿霉素耐药株K562/A02、人纤维肉瘤HT-1080、人慢性髓系白血病细胞K562。

实验材料：PAC-1针晶（参照Quinn P.Peterson等，J.Med.Chem.2009,52,5721–5731的方法制备）、MTT溶液（Amresco规格：1g批号：2035B358）、DMSO（分析纯，北京化工厂）、96孔板（Corning）、CCK-8（日本同仁化学研究所规格：500test，批号：DJ706）、胎牛血清为美国GIBCO公司产品，批号：608759、RPMI-l640Hyclone公司产品，批号：NWK0492、0.25%Trypsin-EDTA美国GIBCO公司产品，批号：10T774768、DMSO美国Sigma公司产品。

取对数生长期细胞，消化调整细胞密度为1-5×10⁵cells/mL，每孔100μL接种于96孔培养板内，置37℃，5%CO₂的饱和湿度培养箱中培养。细胞贴壁后，给药组加入含有不同浓度的PAC-1及ZYS-1，设6个剂量组，每组至少设三个平行孔；另设阴性对照组（含0.05%的DMSO的培养基）、阳性对照组（20μM的依托泊苷）以及空白对照组（不加细胞，只加培养基）。置37℃，5%CO₂的饱和湿度培养箱中培养。分别于48h后，每孔加20μL MTT（5mg/mL）或10μL CCK-8溶液。37℃孵育，振荡10min使甲瓒完全溶解。用酶标仪，在相应的检测波长条件下测定光密度值(OD)，用下面公式计算药物对细胞的抑制率，并计算IC₅₀：抑制率=(阴性对照组OD值-给药组OD值)/(阴性对照组OD值-空白组OD值)×100％，实验重复3次。

实验结果见图：5-8，结果表明：ZYS-1抗肿瘤药效作用强于PAC-1针晶。

实施例9：ZYS-1抑制HGC-27细胞二维迁移作用

实验材料：同实施例8。

取对数生长期的HGC-27细胞，将细胞密度调整为5×10⁵cells/mL，铺于24孔板（每孔0.5mL）上，加入含10％胎牛血清的RMPI-1640培养液，培养24h，使形成单层细胞。用20μL移液枪枪头在单层细胞上呈“一”字划痕，用PBS清洗3次，然后加入含2%胎牛血清的含药培养基，浓度分别为2、4μM，放入37℃5%CO₂的饱和湿度培养箱中培养。按0，4，8，12h取样，拍照。软件统计在同一视野内细胞由划痕边缘向划痕内迁移的面积。

实验结果见图9及表5，划痕试验结果表明：ZYS-1具有明显抑制HGC-27细胞迁移的作用。

表5ZYS-1对HGC-27细胞二维迁移的影响

与对照组比较*P<0.05，**P<0.01

实施例10：ZYS-1抑制HGC-27及HT-1080细胞三维迁移作用

实验材料：Transwell(corning Incorporated costar货号：3422，批号：27911039规格)；其余同上。

消化收集饥饿处理的细胞，用无血清培养基悬浮细胞，调整浓度为3×10⁵cells/mL，每孔100μL的细胞悬液加入上室，在下室加入700μL含10％血清的培养基。按照试验设计对照组每孔加入50μL无血清培养基，给药组加入含药的无血清培养基50μL，继续在孵箱培养24h。取出上室，甲醇固定30min，姬姆萨染液染色30min，清水漂洗2次，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，晾干。底面朝上，移至载玻片上用中性树胶封片。显微镜下取9个随机视野计数穿膜细胞，统计计算平均值。

实验结果见图10及表6-7。ZYS-1能够明显抑制HGC-27及HT-1080细胞的三维迁移能力且呈现剂量依赖关系，且ZYS-1对HT-1080的抑制作用较强。

表6ZYS-1对HGC-27细胞三维迁移能力的影响

与对照组比较*P<0.05，**P<0.01

表7ZYS-1对HT-1080细胞三维迁移能力的影响

与对照组比较*P<0.05，**P<0.01

实施例11：ZYS-1抑制HT-1080细胞侵袭作用

实验材料：Transwell(corning Incorporated costar货号：3422，批号：27911039规格：8.0μm24孔板)；Matrigel TM基质胶（BD公司批号：31425，规格5ml货号：356234）；其余同上。

Matrigel在4℃过夜融化，4℃预冷的无血清培养基1:2稀释；在chamber上室底部中央垂直加入30μL稀释后的Matrigel，室温放置20min，然后放入37℃孵育60min，显微镜下观察至成胶，无血清培养基水化后备用。消化收集药物处理48h的肿瘤细胞，用无血清培养基悬浮细胞，调整浓度为2.5×10⁵cells/mL，放入培养箱中继续培养24h。取出上室，甲醇固定30min，姬姆萨染液染色30min，清水漂洗2次，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，晾干。底面朝上，移至载玻片上用中性树胶封片。显微镜下取9个随机视野计数穿膜细胞，统计计算平均值。

实验结果，ZYS-1能够明显抑制HT-1080细胞的侵袭能力且呈现剂量相关关系，HT-1080对照组有大量细胞侵袭到下室，2μM和4μM给药组侵袭细胞数小于对照组侵袭细胞数，8μM给药组在同样的条件下无细胞侵袭至下室，如图11所示。

实施例12：ZYS-1对HUVEC活力及小管生成的影响

实验材料：、ECM培养基(Sciencell公司，批号：9391，规格500mL，货号：1001)、Matrigel基质胶（BD公司，批号：31425，规格5mL，货号：356234）、0.25%Trypsin-EDTA（美国GIBCO公司产品，规格5mL，批号：10T774768）、重组人血管内皮抑制素注射液（山东先声麦得津生物制药有限公司，批号：201205015，规格：3mL）、MTT（Amresco，规格：1g，批号：2035B358）、DMSO（分析纯，北京化工厂）、96孔板（Corning）、三蒸水、多聚赖氨酸（PLL）；其余同上。

实验方法：MTT法测定ZYS-1对HUVECs活力的影响：取对数生长期的HUVECs用0.25%胰蛋白酶消化，离心，ECM完全培养基重悬，配成1×10⁵cells/mL的单细胞悬液，以1×10⁴cells/孔细胞量接种于96孔培养板中，每孔体积为100μL。置于37℃，5%CO₂培养箱中培养。培养24h后，加入6个不同浓度的ZYS-1溶液，使药物的终浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100μM；同时设阳性对照组为终浓度10μM的依托泊苷，阴性对照组为等量的0.1%DMSO溶液，实验组各个浓度、对照组均设5个复孔，每孔加药100μL。另设空白对照组为200μL完全培养基。置于37℃，5%CO₂培养箱中培养。培养48h后，每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），继续培养4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μL的DMSO，振荡10min，使结晶充分溶液。酶联免疫检测仪上测定各个孔的光吸收值，测定波长为570nm，记录结果。实验重复三次。

小管生成实验：Matrigel胶于4℃过夜融化，用无血清ECM培养基1：1稀释包被96孔板，预冷的枪头吸取稀释后的Matrigel胶加入到预冷的96孔板中，每孔50μL，在冰上放置5min使Matrigel液面水平，然后将96孔板放入37℃细胞培养箱放置1h使胶凝固。胰酶消化细胞，计数并分别用ECM培养基稀释，调整细胞密度为3×10⁵cells/mL，接种于包被好的96孔板中，每孔100μL。根据MTT实验结果，配成不同浓度的ZYS-1溶液，取100μL加入接种细胞的孔中，使终浓度为2、1、0.5μM；同时设阳性对照为重组人血管内皮抑制素（恩度）；阴性对照为不加药只加培养基。实验组各浓度、对照组均设3个复孔，置于培养箱中培养。18h显微镜下观察并照相，以生成管的周长、面积及结点数为指标观察记录小管的生成情况。实验重复三次。

结论：MTT实验结果显示ZYS-1对HUVECs细胞有明显的抑制作用，IC₅₀为2.542μM，且呈明显的剂量依赖关系，结果见图12A；小管生成实验结果显示，ZYS-1对体外诱导的内皮细胞小管生成实验有较强的抑制作用，2μM ZYS-1给药组与阳性对照组2.5μg/mL恩度比较抑制作用相似，结果见图12B和12C。

实施例13：ZYS-1对NF-κB、XIAP、Caspase-3、VEGF表达的影响

实验材料：兔抗XIAP多克隆抗体（批号：909098W）购自(BIOS)北京博奥森生物技术有限公司；兔抗VEGF多克隆抗体（批号：10CM199）、兔抗Caspase-3多克隆抗体、兔抗NF-κB多克隆抗体（批号：D-C1-O7C14B）、SABC-FITC试剂盒（批号：06F10AN）均购自武汉博士德生物技术有限公司；多聚甲醛(北京化学试剂公司，批号：060221)；其余同上。

取灭菌的细胞转移膜，置于24孔板的板孔中，接种1mL（1×10⁵cells/mL）的细胞悬液，培养至24h，加入含药培养基，设置阴性对照组和给药组，实验组干预24-48h。PBS冲洗，4%多聚甲醛固定15min。0.1%TritonX-100破膜，PBS冲洗，1:10稀释的正常血清封闭液封闭15min。1:100稀释的一抗，放置4℃过夜。PBS冲洗，1:100稀释的二抗，室温孵育30min。PBS冲洗，1:100稀释的SABC-FITC，室温下再孵育30min，PBS洗掉没有结合的FITC。荧光显微镜下观察并照相，Bioflux Montage软件分析荧光强度。各组在显微镜下随即取6个视野，计算细胞的积分光密度值。

实验结果表明：ZYS-1能够显著抑制NF-κB和XIAP的表达，并增加caspase-3的表达。因此ZYS-1诱导HGC-27细胞凋亡可能是通过下调NF-κB蛋白表达，从而转录调节降低XIAP蛋白的表达，减少其对caspase家族成员的抑制作用，从而增加caspase途径依赖的细胞凋亡。此外，ZYS-1明显抑制VEGF蛋白的表达，提示ZYS-1具有抑制转移性肿瘤发生、发展的作用。见图13及表8。

表8ZYS-1对HGC-27细胞NF-κB、XIAP、caspase-3、VEGF蛋白表达影响

与对照组比较*P<0.05

实施例14：ZYS-1抑制小鼠自发性转移癌实验

实验材料：鼠源Lewis肺癌细胞株，C57BL/6小鼠，SPF级，雌雄各半，18-22g

实验方法：调整细胞悬液浓度为5×10⁶cells/mL，小鼠右前肢腋下接种0.2mL/只，肿瘤长至1000mm³，随机分组给药，三周后处理。共设置ZYS-1高、中、低（100、50、25mg/kg/d，灌胃给药）以及阳性对照组（吉非替尼100mg/kg/d，灌胃给药）4组。分别从动物一般生存状态（饮食、活动、毛发等）和抑瘤率及抑制转移率方面对ZYS-1进行药效评价。

其中抑瘤率的计算方法为：以游标尺量瘤体长、宽，计算体积（一周一次）瘤体积=长×宽²×0.52，绘制肿瘤生长曲线。治疗周期完成后次日称重、取血后处死，剥取瘤组织，称重，计算抑瘤率，-80℃保存。抑瘤率(％)=(1-实验组平均瘤重／对照组平均瘤重)×100％，其中抑制转移率的计算方法为：取肺脏，称重，记录肺正反面及肺叶间的转移灶数目，计算抑制转移率。

转移率=有转移小鼠数/小鼠总数×100％

转移灶抑制率=(对照平均转移灶数-实验组平均转移灶数)/对照组平均转移灶数×100％

实验结果：

1、动物一般状况观察

成瘤率：接种瘤细胞液约3天时，部分小鼠腋下可触摸到结节，接种一周后，所有接种小鼠均可观察到块状肿瘤，成瘤率100%。

饮食状况：荷瘤小鼠饮食均减少，低、中剂量与模型组相当，高剂量优于模型组。

活动状况：荷瘤小鼠活动量均下降，其中模型组与低剂量小鼠倦怠少动，高、中剂量组情况较好。

毛发状况:ZYS-1高、中剂量给药组皮毛有光泽，竖毛现象不明显，低剂量次之，模型组和阳性对照组小鼠毛发均无光泽，竖毛现象明显。

各组荷瘤小鼠瘤体状况及抑瘤率结果见表9-10。

表9各组小鼠肿瘤质量及抑瘤率

P<0.001，即与模型组比较有极显著性差异；P<0.01，即与模型组比较有显著性差异

表10ZYS-1对小鼠肿瘤转移抑制作用

P<0.001，即与模型组比较有极显著性差异；P<0.01，即与模型组比较有显著性差异

上述结果表明，ZYS-1具有较好的抗肿瘤及抑制肿瘤抗转移效果，例如100mg/kg剂量下，其抑制肿瘤转移率超过70%，并呈现出良好的剂量依赖关系。

本领域技术人员在阅读了本说明书公开的内容后，可以很容易地想到PAC-1的类似物或其衍生物（例如盐、酯、溶剂合物等）的无定形形式也可能是低神经毒性的。在本说明书的教导下，本领域技术人员完全有动机去获得上述PAC-1的类似物或其衍生物，并验证它们的生物毒性，由此获得低神经毒性的PAC-1的类似物或其衍生物，这是显而易见的。作为上述PAC-1的类似物，可以列举出例如中国专利公开CN101184491A公开的那些化合物，例如PAC-1衍生物文库化合物、ZZ式、ZZ2式、ZZ3式、ZZ4式化合物（参见图1）。

Claims (9)

1.下述式（I）表示的化合物PAC-1，其为无定形形式：

2.一种口服药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1所述的化合物PAC-1，以及药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的口服药物组合物，其为片剂、胶囊剂、滴丸剂或丸剂。

4.根据权利要求2或3所述的口服药物组合物，其还包含PAC-1或其盐的晶体形式，且相对于PAC-1或其盐的晶体形式与PAC-1的无定形形式的总量，PAC-1的无定形形式的含量为10重量%以上，优选50重量%以上、更优选80重量%以上、更优选90重量%以上、更优选95重量%以上、更优选97重量%以上、更优选99重量%以上。

5.根据权利要求2～4中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述口服药物组合物用于肿瘤、优选转移性肿瘤的治疗。

6.根据权利要求2～4中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述口服药物组合物用于抑制肿瘤转移。

7.权利要求1所述的化合物PAC-1的无定形形式在制备口服药物组合物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述口服药物组合物用于肿瘤、优选转移性肿瘤的治疗。

9.根据权利要求7所述的用途，其中，所述口服药物组合物用于抑制肿瘤转移。