CN104888223A

CN104888223A - 一种含乳糖酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法

Info

Publication number: CN104888223A
Application number: CN201510274437.9A
Authority: CN
Inventors: 朱利民; 潘琪霞; 陶磊; 杨卉卉; 吕瑶
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University; National Dong Hwa University
Priority date: 2015-05-26
Filing date: 2015-05-26
Publication date: 2015-09-09

Abstract

本发明涉及一种含乳糖酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，包括：将氧化石墨烯GO分散在溶剂中，加入EDC和NHS活化，然后加入羧甲基壳聚糖CMC溶液，反应后透析，冷冻干燥，得到GO-CMC；将GO-CMC溶解，加入荧光素异硫氰酸FITC溶液，避光反应2-3h，得到GO-CMC-FI；将乳糖酸LA溶解，加入EDC和NHS活化，然后加入GO-CMC-FI溶液，反应后透析，冷冻干燥，得到GO-CMC-LA-FI；在GO-CMC-LA-FI中加入三乙胺和乙酸酐进行乙酰化，得到GO-CMC-LA-FI-Ac。本发明的方法操作简单、产物易处理。本发明得到的复合材料能被适用于药物缓释和细胞成像，成本低廉。

Description

一种含乳糖酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法

技术领域

本发明属于氧化石墨烯复合材料的制备领域，特别涉及一种含乳糖酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法。

背景技术

石墨烯是由碳六元环组成的两维周期蜂窝状点阵结构，具有石墨和碳纳米管等材料的一些优良性质，如高热导性和高机械强度，以石墨烯制备的纳米材料也表现出许多优良的性质。使得基于石墨烯的复合材料成为石墨烯应用领域被广泛研究的热点，如能量储存，液晶器件，电子器件，生物材料等领域。

氧化石墨烯GO解决了石墨烯活性位点少，难以规模化制备的难题，成为生物医学领域应用较多的石墨烯衍生物。氧化石墨烯的表面存在大量的羟基、羧基和环氧基等含氧官能团，可为化学反应提供反应位点，同时也可提高GO在极性溶剂中的溶解度。

壳聚糖是甲壳素的一种重要衍生物，是甲壳素经脱乙酰化处理后的产物，学名聚氨基葡萄糖，别名甲壳胺，是直链状高分子化合物。具有独特的生物活性和生理功能，因而在药物传递过程中具有极大的优势。然而，壳聚糖水溶性很差，其应用并不广泛。羧甲基壳聚糖是壳聚糖经过化学修饰引入亲水基团所得到的产物，增加了与水之间的氢键，改善了壳聚糖难溶于水的缺陷。因此羧甲基壳聚糖在食品，农业，日化，医药，水处理等多种领域得到了应用。

乳糖酸是第三代果酸，具有抗老、保湿、修护、抗氧化的作用，同时可以促进机体更新等，是一种多功效，最先进的果酸。去唾液酸糖蛋白受体是一种膜蛋白，在肝脏细胞表面特异性表达，具有高效的识别黏附性，有助于与其结合的糖蛋白的内吞。制备安全、高效的肝靶向配体是实现肝靶向治疗的关键之一，但是内源性去唾液酸糖蛋白受体的配体不易获得、产量不高，故其使用受限。半乳糖作为外源性特异性配体，常用来作为高分子材料的靶向基团，提高对肝细胞的主动靶向。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种含乳糖酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，该发明采用化学键合的方法，合成含乳糖酸的氧化石墨烯复合材料，操作简单，实验条件温和；所得材料可作为药物的负载及缓释。

本发明的一种含乳糖酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，包括：

(1)将氧化石墨烯GO分散在溶剂中，加入EDC和NHS，活化2-3h，然后加入羧甲基壳聚糖CMC溶液，室温下反应12-24h，透析，冷冻干燥，得到GO-CMC；其中，GO与EDC的质量比为1:0.5-1:1，EDC与NHS的摩尔比为1:1-1:2，GO与CMC的质量比是1:1-1:2；

(2)将步骤(1)中得到的GO-CMC溶于蒸馏水中，加入荧光素异硫氰酸FITC溶液，避光反应2-3h，得到GO-CMC-FI；其中，GO-CMC与FITC的质量比为40:1-50:1；

(3)将乳糖酸LA溶解在磷酸盐缓冲液中，加入EDC和NHS，活化2-3h，然后加入GO-CMC-FI溶液，室温下反应12-24h，透析，冷冻干燥，得到GO-CMC-LA-FI；其中，LA与EDC和NHS的摩尔比为1:1:1，GO-CMC与LA的摩尔比为1:10-1:20；

(4)在步骤(3)中得到的GO-CMC-LA-FI中加入三乙胺，搅拌混合，然后加入乙酸酐，室温下反应12-24h，透析，冷冻干燥，得到含乳糖酸修饰的氧化石墨烯复合材料GO-CMC-LA-FI-Ac，其中，GO-CMC-LA-FI中氨基与三乙胺的摩尔比为1:1-1:1.5，GO-CMC-LA-FI中氨基与乙酸酐的摩尔比为1:5-1:10。

所述步骤(1)中溶剂和CMC溶液的溶剂均为蒸馏水。

所述步骤(3)中磷酸盐缓冲液的的pH值为5-6。

所述步骤(3)中FITC溶液的溶剂为二甲基亚砜DMSO。

所述步骤(4)中加入三乙胺的混合时间为15-30min。

所述步骤(1)、步骤(3)和步骤(4)中透析均采用透析袋，先在pH＝6-7的缓冲液中透析，再在水中透析，时间均为3-5d。

所述透析袋的规格为MW＝8,000～14,000。

乳糖酸LA是一种肝细胞靶向配体，使材料具有主动靶向的作用，有利于药物有效释放。具有应用其做后续相关实验分析的潜力。

有益效果

(1)本发明采用化学键合的方法，合成含乳糖酸的氧化石墨烯复合材料，制备方法操作简单、实验条件温和；

(2)本发明的氧化石墨烯复合材料克服了石墨烯容易团聚以及定位靶向的问题，羧甲基的修饰，提高了氧化石墨烯在水中的溶解性，改善了材料的生物相容性，并降低了材料的毒性。

附图说明

图1是实施例1中得到的GO-CMC-LA-FI-Ac的透射电镜图；

图2为实施例2所得的GO、GO-CMC、GO-CMC-LA-FI-Ac的¹H-NMR图谱。其中2-a为GO的¹H-NMR图谱、2-b为GO-CMC的¹H-NMR图谱，2-c为GO-CMC-LA-Ac的¹H-NMR图谱；

图3为实施例3所得的GO、GO-CMC及含GO-CMC-LA-FI-Ac的UV-Vis图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)将70mg氧化石墨烯GO溶解在30ml蒸馏水中，加入活化剂EDC(45mg)、NHS(30mg)于常温下搅拌反应2h。在反应的同时，逐滴加入20mL含CMC(105mg)的水溶液，于室温搅拌反应24h。采用透析袋(MW＝100,000)将反应所得溶液进行透析，先用2L的PBS透析两次后，再用2L的蒸馏水透析7次，去除溶液中的杂质和副产物。所得产物冷冻干燥，合成GO-CMC。

(2)称取8mgLA于磷酸缓冲液中，加入活化剂EDC(18mg)、NHS(12mg)活化3h。

(3)称取20mgGO-CMC于水中加入含0.6mgFITC的DMSO溶液，避光反应2h，合成GO-CMC-FI。将步骤(2)中反应后的LA溶液逐滴加入GO-CMC-FI溶液中，搅拌反应24h后，合成GO-CMC-FI-LA。

(4)在上述产物中加入180uL三乙胺混合搅拌30min后加入100uL乙酸酐混合，于室温下反应24h。反应后用透析袋(MW＝14,000)将溶液进行透析。先用2L的PBS透析两次后，再用2L的蒸馏水透析7次，去除溶液中的杂质和副产物。所得产物冷冻干燥，合成GO-CMC-LA-FI-Ac。

(5)对最终产物GO-CMC-LA-FI-Ac的TEM表征如图1所示，可以看出氧化石墨烯经过功能修饰过后依然保持其片层状结构，即修饰仅发生在氧化石墨烯的表面，并不改变氧化石墨烯本身的结构。

实施例2

(1)将100mg氧化石墨烯GO溶解在30ml蒸馏水中，加入活化剂EDC(48mg)、NHS(36mg)于常温下搅拌反应2h。在反应时，逐滴加入30mL含CMC(100mg)的水溶液，于室温搅拌反应24h。采用透析袋(MW＝100,000)将反应所得溶液进行透析，先用2L的PBS透析两次后，再用2L的蒸馏水透析7次，去除溶液中的杂质和副产物。所得产物冷冻干燥，合成GO-CMC。

(2)称取10mgLA于磷酸缓冲液中，加入活化剂EDC(20mg)、NHS(15mg)活化3h。

(3)称取50mgGO-CMC于水中加入含1.2mgFITC的DMSO溶液，避光反应2h，合成GO-CMC-FI。将步骤(2)中反应后的LA溶液逐滴加入GO-CMC-FI溶液中，搅拌反应24h后，合成GO-CMC-FI-LA。

(4)在上述产物中加入200uL三乙胺混合搅拌30min后加入125uL乙酸酐混合，于室温下反应24h。反应后用透析袋(MW＝14,000)将溶液进行透析。先用2L的PBS透析两次后，再用2L的蒸馏水透析7次，去除溶液中的杂质和副产物。所得产物冷冻干燥，合成GO-CMC-LA-FI-Ac。

(5)GO、GO-CMC、GO-CMC-LA-FI-Ac的¹H-NMR图谱如图2所示，由于GO本身没有核磁峰，图2-b中产生的质子峰均为CMC上氢原子，图2-c相比图2-b，δ＝3.9ppm处，为LA中特异性的氢原子，说明LA成功与GO-CMC相连接。在δ＝1-2ppm处出现了一个比较大的峰，那是在乙酰化的时候形成了甲基峰，证明材料乙酰化的成功。

实施例3

(1)将120mg氧化石墨烯GO溶解在40ml蒸馏水中，加入活化剂EDC(53mg)、NHS(45mg)于常温下搅拌反应2h。在反应时，逐滴加入30mL含CMC(145mg)的水溶液，于室温搅拌反应24h。采用透析袋(MW＝100,000)将反应所得溶液进行透析，先用2L的PBS透析两次后，再用2L的蒸馏水透析7次，去除溶液中的杂质和副产物。所得产物冷冻干燥，合成GO-CMC。

(2)称取14mgLA于磷酸缓冲液中，加入活化剂EDC(25mg)、NHS(18mg)活化3h。

(3)称取65mgGO-CMC于水中加入含1.5mgFITC的DMSO溶液，避光反应2h，合成GO-CMC-FI。将步骤(2)中反应后的LA溶液逐滴加入GO-CMC-FI溶液中，搅拌反应24h后，合成GO-CMC-FI-LA。

(4)在上述产物中加入250uL三乙胺混合搅拌30min后加入140uL乙酸酐混合，于室温下反应24h。反应后用透析袋(MW＝14,000)将溶液进行透析。先用2L的PBS透析两次后，再用2L的蒸馏水透析7次，去除溶液中的杂质和副产物。所得产物冷冻干燥，合成GO-CMC-LA-FI-Ac。

(5)GO、GO-CMC、GO-CMC-LA-FI-Ac的UV-Vis图谱如图3所示，GO-CMC-LA-FI-Ac在501nm处存在吸收峰，该吸收峰为FITC的特征吸收峰，说明FITC已经成功接入到氧化石墨烯复合材料中。

实施例4

(1)将200mg氧化石墨烯GO溶解在50ml蒸馏水中，加入活化剂EDC(60mg)、NHS(48mg)于常温下搅拌反应2h。在反应时，逐滴加入50mL含CMC(300mg)的水溶液，于室温搅拌反应24h。采用透析袋(MW＝100,000)将反应所得溶液进行透析，先用2L的PBS透析两次后，再用2L的蒸馏水透析7次，去除溶液中的杂质和副产物。所得产物冷冻干燥，合成GO-CMC。

(2)称取12mgLA于磷酸缓冲液中，加入活化剂EDC(25mg)、NHS(20mg)活化3h。

(4)在上述产物中加入220uL三乙胺混合搅拌30min后加入130uL乙酸酐混合，于室温下反应24h。反应后用透析袋(MW＝14,000)将溶液进行透析。先用2L的PBS透析两次后，再用2L的蒸馏水透析7次，去除溶液中的杂质和副产物。所得产物冷冻干燥，合成GO-CMC-LA-FI-Ac。

(5)GO、GO-CMC、GO-CMC-LA-FI-Ac的Zeta电势如表1所示，可以发现当带负电荷的GO上连接带正电荷的CMC时电位变大，而GO-CMC连接上LA后乙酰化电位又变小，说明CMC和LA成功连接在GO上，而且成功乙酰化。

表1实施例4所得的GO、GO-CMC及含GO-CMC-LA-FI-Ac的Zeta电势

样品	Zeta电势(mV)
		GO	-42.3±1.42
GO-CMC	-37.1±0.3
		GO-CMC-LA-FI-Ac	-45.3±0.12

Claims

1.一种含乳糖酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，包括：

(4)在步骤(3)中得到的GO-CMC-LA-FI中加入三乙胺，搅拌混合，然后加入乙酸酐，室温下反应12-24h，透析，冷冻干燥，得到含乳糖酸修饰的氧化石墨烯复合材料GO-CMC-LA-FI-Ac；其中，GO-CMC-LA-FI中氨基与三乙胺的摩尔比为1:1-1:1.5，GO-CMC-LA-FI中氨基与乙酸酐的摩尔比为1:5-1:10。

2.根据权利要求1所述的一种含乳糖酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中溶剂和CMC溶液的溶剂均为蒸馏水。

3.根据权利要求1所述的一种含乳糖酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中磷酸盐缓冲液的的pH值为5-6。

4.根据权利要求1所述的一种含乳糖酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中FITC溶液的溶剂为二甲基亚砜DMSO。

5.根据权利要求1所述的一种含乳糖酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中加入三乙胺的混合时间为15-30min。

6.根据权利要求1所述的一种含乳糖酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)、步骤(3)和步骤(4)中透析均采用透析袋，先在pH＝6-7的缓冲液中透析，再在水中透析，透析时间为3-5d。

7.根据权利要求6所述的一种含乳糖酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，所述透析袋的规格为MW＝8,000～14,000。