CN104887718A - 一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于包括下述步骤：羊栖菜粉末在循环超声仪中加入蒸馏水超声提取，然后离心，取上清液，真空旋转蒸发浓缩至原体积的五分之一，加入无水乙醇使溶液中静置、离心，取沉淀物真空下冷冻干燥；将冷冻干燥后的沉淀物溶于水中，配成上样液，将上样液注入到D311大孔树脂中吸附，去除蛋白质和色素，得到第一洗脱液；将得到的第一洗脱液在DEAE-52阴离子交换纤维柱进行吸附洗脱，使用NaCl浓度为0-3M的NaCl-Tris-HCl缓冲液体系等梯度洗脱；在波长为215nm收集到0.5M-1M NaCl下的洗脱液，在3.5KD切向流超滤膜下膜浓缩脱盐至原体积的五分之一，真空冷冻干燥即得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。
Description
技术领域
本发明涉及到一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法。
背景技术
α-葡萄糖苷酶是存在于小肠刷状缘膜的近腔上皮细胞内的一组水解酶，寡糖经小肠刷状缘上皮细胞上各种酶的作用生成葡萄糖及其他单糖，经小肠黏膜细胞吸收而被机体利用。研究表明，高血糖状态不仅降低胰岛B胞的功能和胰岛素的敏感性，产生胰岛素抵抗，而且与糖尿病的慢性并发症密切相关而在空腹血糖和餐后血糖两个指标中，餐后血糖水平增加是与血管并发症相关的一个重要因素。因此，通过降低α-萄糖苷酶活性，延缓或限制碳水化合物在消化道内分解，达到预防和治疗这类疾病。α-葡萄糖苷酶抑制剂可抑制葡萄糖苷酶的活性，使葡萄糖的生成和吸收减缓，从而减低餐后血糖峰值，调整血糖水平，减少血糖对胰腺的刺激，提高胰岛素的敏感性，保护胰腺的功能，预防并改善并发症的发生和发展。ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂是上世纪70年代研发的治疗2型糖尿病的新药，现已上市的有伏格列波糖(Voglibose)，米格列醇(Miglitol)，阿卡波糖(拜糖平、Acarbose)，经临床应用，均取得了较好的疗效，被认为是2型糖尿病的首选药和1型糖尿病的胰岛素治疗的辅助药物。但长时间使用会出现胃肠胀气、腹痛、腹泻等消化道副反应，且制药成本高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种抑制效果好且来源于天然植物、副反应少、成本低的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
羊栖菜粉末在循环超声仪中加入蒸馏水超声提取，超声时间为12-18min，超声温度为55-65℃，羊栖菜粉末与蒸馏水的比例为1:15-25g/ml，功率900-1100W；然后在离心机中9500-10500rpm下离心，取上清液，55-65℃下真空旋转蒸发浓缩至原体积的五分之一，加入无水乙醇使溶液中醇量达60-70wt％，静置22-26小时，在4500-5500rpm下离心12-18min，取沉淀物；
将沉淀物在真空下冷冻干燥,，真空冷冻条件为：真空度125-135Pa，温度为-85～-75℃，时间为46-50h；
将冷冻干燥后的沉淀物溶于水中，配成浓度为0.9-1.1wt％的水溶液作为上样液，将上样液注入到D311大孔树脂中吸附，去除蛋白质和色素，得到第一洗脱液；上样液与大孔树脂用量体积比为1:1；
将得到的第一洗脱液在DEAE-52阴离子交换纤维柱进行吸附洗脱，洗脱所使用的：缓冲体系为NaCl-Tris-HCl缓冲液，pH为7.0-7.2；用含NaCl 0-3M的缓冲液等梯度洗脱DEAE-52阴离子交换纤维柱，流速为1mL/min；在波长为215nm收集到0.5M-1M NaCl下的洗脱液，在3.5KD切向流超滤膜下膜浓缩脱盐至原体积的五分之一，在125-135Pa、温度-85～-75℃下真空冷冻干燥46-50h，即得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。‘
较好的，DEAE-52阴离子交换纤维柱吸附洗脱NaCl-Tris-HCl缓冲液中，NaCl浓度为1M。该浓度下得到的抑制剂抑制效果更好。
与现有技术相比，本发明所制备的α-葡萄糖苷酶活性抑制对α-葡萄糖苷酶的活性具有很好的抑制作用，与现有的α-葡萄糖苷酶抑制剂比较，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的IC50为30mg/mL，而本发明提取物I的IC50为30mg/mL，提取物II的IC50为0.65mg/mL，提取物III的IC50为0.25mg/mL；提取物Ⅰ的抑制率达99.2％；提取物Ⅱ的抑制率达到99.8％，提取物Ⅲ的抑制率达到97.8％，抑制效果明显高于阿卡波糖。
附图说明
图1为本发明实施例中提取物I浓度对α-葡萄糖苷酶活性抑制的关系；
图2为本发明实施例中提取物II浓度对α-葡萄糖苷酶活性抑制的关系；
图3为本发明实施例中提取物III浓度对α-葡萄糖苷酶活性抑制的关系。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、制备α-葡萄糖苷酶抑制剂，具体制备方法如下：
取市售羊栖菜粉末，也可以使用现有的方法自己制备，具体方法为：羊栖菜购于浙江省温州洞头县，5-6月新鲜藻体，清水冲洗表面泥沙、盐粒，50－60℃烘干，大型粉碎机粉碎过80目筛，干燥，即得羊栖菜粉末。
羊栖菜在循环超声仪中加20倍重量份蒸馏水超声提取，超声时间为15min、温度60℃、固液比1:20g/ml、功率1000W。然后在离心机中10000rpm下离心，取上清液，60℃下浓缩至原体积的五分之一，加入无水乙醇使含醇量达65wt％，静置24小时，在5000rpm下离心15min，取沉淀物；
将沉淀物在真空下冷冻干燥,，真空冷冻条件为真空130Pa，温度为-80℃，时间为48h；
将冷冻干燥后的沉淀物溶于水中，配成浓度为1wt％的水溶液作为上样液，将上样液注入到D311大孔树脂中吸附，去除蛋白质和色素，得到第一洗脱液；其中上样液与大孔树脂用量体积比为1:1；
将得到的第一洗脱液在DEAE-52阴离子交换纤维柱进行吸附洗脱，洗脱条件为：缓冲体系为pH7.2的Tris-HCl缓冲液，用含0-3M的NaCl溶液等度洗脱DEAE-52阴离子交换纤维柱，流速为1mL/min，在波长为215nm下监测洗脱液液中提取物含量，见峰收集。分别收集到0.5M NaCl下的洗脱液，即提取物I；0.75M NaCl下的洗脱液即提取物II；1M NaCl下的洗脱液即提取物III；分别在3.5KD切向流超滤膜下膜浓缩脱盐至原体积的五分之一，真空冷冻干燥，真空度130Pa，温度为-80℃，时间为48h；即得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。
验证制得的α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制作用
试剂：α-葡萄糖苷酶，购于Sigma公司；对硝基苯酚-α-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，购于国药集团化学试剂有限公司；蒸馏水；阿卡波糖，北京百灵威科技有限公司(批号：298087)；
仪器：日本岛津UV-2600可见光分光光度计；TLE104E电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Q2-861微型旋转混合仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；SB-3200超声波清洗机，宁波新芝生物技术股份有限公司；海尔BCD-215DC冰箱，青岛海尔股份有限公司；ILB-008-04低温恒温循环器，施都凯仪器设备(上海)有限公司。
α-葡萄糖苷酶活性测定
α-葡萄糖苷酶可催化对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)形成4-硝基酚(pNP)，而pNP在400nm波长处有最大吸收峰。因此通过测定酶催化反应体系A400下测定体系的吸光值与时间的关系，作图得到一直线，该直线的斜率即为α-葡萄糖苷酶的活力。即以pNPG为底物通过分光光度法在波长400nm处测定pNP的产生速度来计算α-葡萄糖苷酶活力的大小。
具体测定方法：在1mL用50mM磷酸缓冲液(pH7.4)配制的10mM pNPG底物体系中，加入5μLα-葡萄糖苷酶溶液，迅速混匀，通过岛津公司UV-2600紫外可见分光光度计检测400nm处每分钟吸光值变化来指示反应速度ν值，从而表征酶活力的大小。测定温度为37℃。
本实施例制备的抑制剂对α-葡萄糖苷酶抑制作用的测定
将制备的提取物I、提取物II和提取物III分别溶于水中配制成浓度为50mg/mL溶液，用50mM pH 6.5的PBS缓冲液分别稀释成提取物浓度为10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL和50mg/mL的提取物I抑制液；0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL和1.0mg/mL提取物II抑制液；0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL和0.4mg/mL的提取物III抑制液。取各浓度的抑制液10μL与等体积的α-葡萄糖苷酶液混合，制成酶活体系，25℃保温2h后测定酶活力。酶活力测定方法同上。测定时α-葡萄糖苷酶的终浓度为0.2u/mL，底物pNPG浓度为10mM。
根据测定结果计算各酶活体系的相对酶活力。
相对酶活力＝各酶活体系的酶活力/α-葡萄糖苷酶的酶活力×100％。
各酶活体系的相对酶活力与抑制剂浓度关系如图1、图2和图3所示，其中图1为提取物Ⅰ，图2为提取物Ⅱ，图3为提取物Ⅲ。
据文献记载，现有技术中使用的阿卡波糖，30mg/mL下其阳性对照抑制率为51.34％。
由图1至图3可以得知，本发明所制备的抑制剂对α-葡萄糖苷酶具有非常好的抑制作用，优于现有技术中所使用的抑制剂，可替代阿卡波糖等现有抑制剂作为α-葡萄糖苷酶抑制剂使用。
Claims (2)
1.一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
羊栖菜粉末在循环超声仪中加入蒸馏水超声提取，超声时间为12-18min，超声温度为55-65℃，羊栖菜粉末与蒸馏水的比例为1:15-25g/ml，功率900-1100W；然后在离心机中9500-10500rpm下离心，取上清液，55-65℃下真空旋转蒸发浓缩至原体积的五分之一，加入无水乙醇使溶液中醇量达60-70wt％，静置22-26小时，在4500-5500rpm下离心12-18min，取沉淀物；
将沉淀物在真空下冷冻干燥,，真空冷冻条件为：真空度125-135Pa，温度为-85～-75℃，时间为46-50h；
将冷冻干燥后的沉淀物溶于水中，配成浓度为0.9-1.1wt％的水溶液作为上样液，将上样液注入到D311大孔树脂中吸附，去除蛋白质和色素，得到第一洗脱液；上样液与大孔树脂用量体积比为1:1；
将得到的第一洗脱液在DEAE-52阴离子交换纤维柱进行吸附洗脱，洗脱所使用的缓冲体系为NaCl-Tris-HCl缓冲液，pH为7.0-7.2；用含NaCl 0-3M的缓冲液等梯度洗脱DEAE-52阴离子交换纤维柱，流速为1mL/min；在波长为215nm收集到0.5M-1M NaCl下的洗脱液，在3.5KD切向流超滤膜下膜浓缩脱盐至原体积的五分之一，在125-135Pa、温度-85～-75℃下真空冷冻干燥46-50h，即得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于DEAE-52阴离子交换纤维柱吸附洗脱NaCl-Tris-HCl缓冲液中，NaCl浓度为1M。
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