CN104870654A - 卵子供体妊娠中胎儿非整倍性的无创检测 - Google Patents

卵子供体妊娠中胎儿非整倍性的无创检测 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于确定来自具有卵子供体妊娠的妊娠女性的母体样品中的无细胞DNA的胎儿贡献百分比的测定系统和方法。还提供了利用样品中的确定的胎儿无细胞DNA百分比来确定母体样品中胎儿非整倍性的存在或不存在的统计可能性的测定系统和方法。

Description

卵子供体妊娠中胎儿非整倍性的无创检测
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年12月19日提交的美国专利申请号13/720,273的权益，美国专利申请号13/720,273为于2011年12月28日提交的美国专利申请号13/338,963的继续部分申请，美国专利申请号13/338,963为于2011年12月9日提交的美国专利申请号13/316,154的继续部分申请，美国专利申请号13/316,154要求于2011年1月25日提交的美国临时专利申请号61/436,135的优先权，所有这些专利申请被转让给本发明的受让人并且通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及卵子供体妊娠中的遗传异常的诊断以及用于此类诊断的测定系统。
发明背景
在以下讨论中，为了背景和介绍的目的将描述某些文章和方法。本文包含的任何事物不被理解为对现有技术的“承认”。申请人明确地保留在适当的情况下表明本文引用的文章和方法基于适用的法定条款不构成现有技术的权利。
遗传异常导致大量的病理，包括由染色体非整倍性引起的病理(例如唐氏综合征)、在特定基因上的生殖系突变(例如，镰状细胞性贫血)、和由体细胞突变引起的病理(例如，癌症)。用于确定此类遗传异常的诊断方法已变成用于鉴定特定疾病和紊乱以及提供有关疾病来源和治疗选择的有价值的信息的标准技术。
例如，产前筛选和诊断在产前保健中被常规地提供并且被认为在允许妇女做出关于受遗传状况影响的妊娠的知情选择方面是重要的。产前诊断测试的常规方法目前要求利用通常地在11和14周妊娠之间的绒毛膜绒毛取样(CVS)或通常地在15周之后的羊膜穿刺术从子宫直接地取出胎儿细胞的样品用于遗传分析。但是，这些侵入性操作带有约1％的流产的风险。Mujezinovic和Alfirevic,Obstet Gynecol 2007；110:687-694。
尽管这些获得胎儿DNA的方法目前提供了用于产前诊断的金标准测试，但是很多妇女决定不经受侵入性测试，主要是因为其是令人不愉快的并且带有小但是显著的流产的风险。长期以来已在寻求用于无创产前诊断的可靠且方便的方法来减少该流产风险并允许更早的测试。尽管一些工作已利用从宫颈粘液获得的胎儿细胞研究(Fejgin MD等人,Prenat Diagn2001；21:619-621；Mantzaris等人,ANZJOG 2005；45:529-532)，但是大多数的研究集中于用于检测来自胎儿、存在于母体循环中的遗传元件的策略。已证实在妊娠期间在胎儿和母体之间有双向的流通(Lo等人,Blood1996；88:4390-4395)，并且多个研究已显示，完整的胎儿细胞和无细胞的胎儿核酸两者穿过胎盘并且在母体的血流中循环(参见例如Chiu RW和LoYM,Semin Fetal Neonatal Med.2010年11月11日)。
特别地，鉴定非整倍性的最近的尝试已使用母体血液作为起始材料。此类努力已包括使用无细胞DNA以检测来自怀孕女性的样品中的胎儿非整倍性，包括利用大规模平行鸟枪测序(MPSS)来精确地定量来自三体性染色体的cfDNA片段的增加。但是，来源于胎儿非整倍性的染色体剂量直接地与胎儿cfDNA的比例有关。由于胎儿对母体样品的贡献的水平将改变用于计算胎儿染色体为非整倍体的风险需要检测的量，所以在样品之间胎儿核酸贡献的变化能因此使分析复杂化。
例如，来自患有21三体综合征的胎儿的含4％DNA的cfDNA样品应表现出在来自染色体21(chr21)的读数的比例方面与正常胎儿相比2％的增加。利用具有4％的胎儿核酸百分比的母体样品以高的可信度从正常胎儿区分21三体综合征需要大量(>93K)的染色体21观察，其是有挑战性的并且利用诸如MPSS的非选择性技术是并非成本有效的。
因此对在含有正常和假定的异常DNA的混合样品中筛选包括非整倍体的遗传异常的无创方法存在需求。本发明满足该需求。
发明概述
提供该概述以以简化的形式介绍在以下在详细描述中进一步描述的观念的精选。该概述并非意图标识所要求保护的主题的关键或本质特征，也并非意图用来限制所要求保护的主题的范围。根据以下书写的包括在所附的附图中表明以及在所附的权利要求中限定的那些方面的详细描述，所要求保护的主题的其它特征、细节、效用、和优势将是明显的。
本发明提供了用于确定包括卵子供体妊娠中的基因组材料(例如无细胞DNA)的母体样品中的遗传异常的测定系统和相关方法。可利用多种技术来进行用于确定胎儿非整倍性的分析。
确定来自卵子供体妊娠的母体样品中胎儿DNA的相对百分比提供可指示关于胎儿非整倍性的核酸区域的相对统计存在的重要信息。确定其中胎儿具有不同于载体的等位基因的至少一个等位基因的基因座能允许估计母体样品中的胎儿DNA，并且由此提供用来计算感兴趣的染色体的染色体频率的统计上的显著差异的信息。因此此类基因座在测定中能提供两种形式的信息-等位基因信息能被用于确定母体样品中的胎儿DNA贡献百分比并且来自检测技术的等位基因信息的经验确定(例如，等位基因检测水平的总和)能被用来确定母体样品中的该基因座的相对总体频率。但是，对于确定该基因座的相对总体频率，等位基因信息是不被需要的。
因此，在一些特定的方面，在感兴趣的等位基因处母体DNA的相对胎儿贡献可与该等位基因处的非母体贡献比较以确定样品中的近似胎儿DNA浓度。在特定的方面，在其中胎儿DNA具有不同于母体等位基因的至少一个等位基因的那些基因座处，确定了母体样品中的胎儿DNA的估计。在卵子供体妊娠中，这可包括其中母体或胎儿基因型是纯合的并且另一个是杂合的基因座，以及其中母体和胎儿基因型均是纯合的并且两个胎儿等位基因不同于母体等位基因的基因座。在该情况下，可利用卵子供体提供信息的(informative)基因座的亚组来确定胎儿DNA量。
在一个特定的方面，本发明提供了用于确定来自具有卵子供体妊娠的妊娠女性的母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比，所述方法包括提供含有母体和胎儿的无细胞DNA的母体样品；询问两种或更多种选择的多态的核酸区域；检测询问的核酸区域；确定询问的核酸区域中的多态性的相对频率以鉴定卵子供体提供信息的基因座；利用鉴定的卵子供体提供信息的基因座来计算胎儿无细胞DNA百分比。
在某些特定的方面，由于确定母体样品中胎儿DNA的相对百分比将提供关于胎儿染色体的预期的统计存在的重要信息并且从该预期的偏差可表明胎儿非整倍性，所以确定母体样品中胎儿DNA的相对百分比在执行或优化从测定系统获得的结果中是有益的。能利用很多方法来计算在母体样品中胎儿DNA的相对贡献。
在一个特定的方面，本发明提供了用于提供在具有卵子供体妊娠的妊娠女性中胎儿非整倍性的存在或不存在的统计可能性的测定系统，包括提供含有母体和胎儿的无细胞DNA的母体样品；询问来自第一染色体的两个或更多个核酸区域；定量来自第一染色体的核酸区域的等位基因的相对频率；询问来自第二染色体的两种或更多种选择的核酸区域；比较来自第一染色体的核酸区域的相对频率和来自第二染色体的核酸区域的相对频率；计算母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比；以及利用计算的母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比提供胎儿非整倍性的存在或不存在的统计可能性。
在一个特定的方面，本发明提供了用于提供具有卵子供体妊娠的妊娠女性中胎儿非整倍性的存在或不存在的统计可能性的测定系统，包括提供含有母体和胎儿的无细胞DNA的母体样品；询问来自第一染色体的两个或更多个核酸区域；检测询问的来自第一染色体的核酸区域；定量来自来自第一染色体的核酸区域的等位基因的相对频率：询问来自第二染色体的两个或更多个选择的核酸区域；检测询问的来自第二染色体的核酸区域；定量来自来自第二染色体的核酸区域的等位基因的相对频率；比较来自第一染色体的核酸区域的相对频率和来自第二染色体的核酸区域的相对频率；计算母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比；以及利用计算的母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比来提供胎儿非整倍性的存在或不存在的统计可能性。
在一个特定的方面，本发明提供了用于提供具有卵子供体妊娠的妊娠女性中胎儿非整倍性的存在或不存在的统计可能性的测定系统，包括提供含有母体和胎儿的无细胞DNA的母体样品；询问来自第一染色体的两个或更多个核酸区域；定量来自来自第一染色体的核酸区域的等位基因的相对频率；询问来自第二染色体的两个或更多个选择的核酸区域；定量来自来自第二染色体的核酸区域的等位基因的相对频率；比较来自第一染色体的核酸区域的相对频率和来自第二染色体的核酸区域的相对频率；计算母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比；以及利用计算的母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比来提供胎儿非整倍性的存在或不存在的统计可能性。
在一些方面，母体样品中胎儿DNA贡献百分比通过确定一个或更多个非母体贡献的基因座的水平来计算，所述非母体贡献的基因座包括在性染色体上的基因座和常染色体基因座。在利用常染色体基因座的方面，通常地胎儿DNA贡献百分比通过使非母体基因座上的一个或更多个遗传变异与母体基因座比较来确定。在一些特定的方面，这些遗传变异为拷贝数变异。在其它的特定的方面，这些遗传变异为一个或更多个单核苷酸多态性。
该测定系统优选地针对每个感兴趣的染色体分析至少十个多态的核酸区域，更优选地针对每个感兴趣的染色体分析至少二十个多态的核酸区域，更优选地针对每个感兴趣的染色体分析至少四十个多态的核酸区域，并且甚至更优选地针对每个感兴趣的染色体分析至少九十个多态的核酸区域。
本发明的测定系统可被配置作高度多路的系统，其允许来自单个样品和/或多个样品内的单个或多个染色体的多个核酸区域被同时地分析。在此类多路系统中，样品可被单独地分析，或其可最初被混合入两个或更多个组用于更大量样品的分析。当获得混合数据时，在分析非整倍性之前，优选地针对不同样品鉴定此类数据。但是，在一些方面，可针对潜在的非整倍性分析混合数据，并且如果初始结果指示在混合的组内检测出潜在的非整倍性，则随后地分析来自组的单个样品。
在某些方面，测定系统利用为样品或基因座标识提供信息的一个或更多个标志(index)。例如，在选择性扩增中使用的引物可具有对基因座特异的另外的序列，例如，指示选择的核酸区域或该核酸区域的特定等位基因的核酸序列。在另一个实例中，在选择性或通用扩增中使用指示核酸从其被扩增的样品的标志。在仍然另一个实例中，独特标识标志被用来使特定的扩增产物区别于从检测方法获得的其它的扩增产物。单标志还可与任何其它标志联合以产生为两种特性提供信息的一个标志(例如，样品标识标志、等位基因座标志)。
在某些方面，利用通用扩增方法来扩增核酸区域。例如可在初始选择性扩增或从来自卵子供体妊娠的母体样品富集的步骤之后进行通用扩增。通用扩增的使用允许利用单个或有限数目的扩增引物扩增多个核酸区域，并且在于单个反应中扩增多个选择的核酸区域中是特别有用的。这允许来自单个或多个样品的多个核酸区域的同时处理。
用来分析的母体样品可从具有卵子供体妊娠的任何妊娠妇女获得或衍生。例如，母体样品可来自含有母体和胎儿两者的无细胞DNA的任何母体流体，包括但不局限于母体血浆、母体血清、或母体血液。
在优选的方面，相应于来自染色体的多个核酸区域的靶核酸被检测并且频率被用来确定母体样品中的染色体的相对频率。相应于一个染色体的核酸区域当与相应于母体样品中的另一个染色体的核酸区域的量相比时，频率比预期的高指示胎儿的加倍、缺失或非整倍性。比较可以是在胎儿染色体中假定插入或缺失的感兴趣的基因组区域的比较。比较还可以是每个可为胎儿中的假定的非整倍体的多个染色体(例如，染色体18和21)的比较，其中两者均为非整倍体的可能性是极低的。比较还可以是其中一个为假定的非整倍体(例如，染色体21)并且其他的作为参考染色体(例如，诸如染色体12的常染色体)的多个染色体的比较。在仍然其它的方面，比较可利用假定为非整倍体的两个或更多个染色体和一个或更多个参考染色体。
这些和其它的方面、特征和优势将更详细的被提供，如本文描述的。
附图简述
图1是用于确定母体样品中的胎儿无细胞DNA贡献百分比的一般步骤的简化流程图。
图2是卵子供体妊娠中在特定的基因座处母体、卵子供体和胎儿基因型的组合的表。
图3是对于胎儿比例相关组和胎儿比例无关组的胎儿比例比较的图。
图4A-4C是对于含有来自女性的75％、80％、85％、90％和95％血浆的混合样品利用多态的测定和性染色体测定两者比较估计的贡献百分比的柱形图。
发明详述
除非另有说明，本文描述的方法可使用分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学、和微阵列和测序技术的常规技术和说明，其在本领域熟练技术人员能力范围内。此类常规技术包括聚合物阵列合成、寡核苷酸的杂交和连接、寡核苷酸的测序、和利用标记的杂交的检测。可通过参考本文的实例获得合适的技术的特别说明。但是，当然也可使用等价的常规程序。在标准实验室手册中可找到此类常规技术和说明，所述标准实验室手册诸如Green，等人编辑,Genome Analysis:A Laboratory ManualSeries(Vols.I-IV)(1999)；Weiner,等人，编辑，Genetic Variation:A LaboratoryManual(2007)；Dieffenbach,Dveksler,编辑,PCR Primer:A LaboratoryManual(2003)；Bowtell和Sambrook,DNA Microarrays:A Molecular CloningManual(2003)；Mount,Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis(2004)；Sambrook和Russell,Condensed Protocols from Molecular Cloning:ALaboratory Manual(2006)；以及Sambrook和Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(2002)(全部来自Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Stryer,L.,Biochemistry(第四版)W.H.Freeman,New York(1995)；Gait,“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”IRL Press,London(1984)；Nelson和Cox,Lehninger,Principles of Biochemistry,第三版,W.H.FreemanPub.,New York(2000)；和Berg等人,Biochemistry,第五版,W.H.FreemanPub.,New York(2002)，为了所有目的通过引用将其所有并入本文。在描述本组合物、研究工具和方法之前，要理解本发明不局限于描述的特定的方法、组合物、目标和用途，因为这些当然可变化。还要理解，本文使用的术语只是为了描述特定方面的目的并且不是意图限制本发明的范围，本发明的范围将只由所附的权利要求限制。
应注意，如本文以及在所附的权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“和(and)”和“该(the)”包括复数指代对象，除非上下文另有清楚的指示。因此，例如，提及“核酸区域”指一个、多于一个此类区域、或其混合物，并且提及“测定”包括提及本领域技术人员已知的等价步骤和方法，等等。
在提供值的范围的情况下，要理解，在该范围的上限和下限之间的每个介于中间的值以及在该陈述范围中的任何其它陈述或介于中间的值被包括在本发明内。在陈述的范围包括上限和下限的情况下，排除这些包括的限值中的任一个的范围也被包括在本发明中。
为了描述和公开在出版物中描述的制剂和方法的目的，通过引用将本文提到的所有出版物并入，并且其可与本文描述的发明关联使用。
在以下的说明中，列出了很多具体细节以提供本发明的更彻底的理解。但是，对于本领域技术人员来说将清楚的是，本发明可被实施而无这些具体细节中的一个或更多个。在其它的情形中，为了避免模糊本发明，本领域技术人员熟知的特征和程序未被描述。
定义
除非清楚的声明，本文使用的术语意图具有如由本领域普通技术人员所理解的清楚且普通的意义。以下定义意图帮助读者理解本发明，但并非意图改变或者以其他方式限制此类术语的意义，除非另有声明。
术语“扩增的核酸”为其量与其起始量相比已通过体外进行的任何核酸扩增或复制方法增加了至少两倍的任何核酸分子。
术语“怀孕母本”指由于利用来自不同的妇女的人卵母细胞而怀有胎儿的妊娠妇女。
术语“染色体异常”指染色体的全部或部分的任何遗传变异。遗传变异可包括但不局限于诸如加倍或缺失、易位、倒位、和突变的任何拷贝数变异。
术语“互补的”或“互补性”被用来指通过碱基配对原则相关的核酸分子(即，核苷酸序列)。互补的核苷酸通常地为A和T(或A和U)、或C和G。当一条链的核苷酸以最佳的方式对齐并且具有适当的核苷酸插入或缺失，以至少约90％至约95％的互补性、并且更优选地从约98％至约100％的互补性、并且甚至更优选地以100％的互补性配对时，两条单链RNA或DNA分子被称为基本上互补。可选地，当在选择性杂交条件下RNA或DNA链将与其互补物杂交时，存在基本上互补。选择性杂交条件包括但不局限于严格杂交条件。严格杂交条件将通常地包括小于约1M、更通常地小于约500mM并且优选地小于约200mM的盐浓度。杂交温度通常地为比解链温度(Tm)低至少约2℃至约6℃。
术语“修正标志”指可包含允许鉴定和修正扩增、测序或其它实验性错误的另外的核苷酸的标志，所述鉴定和修正包括检测在测序期间一个或更多个碱基的缺失、取代或插入以及可在测序之外诸如寡核苷酸合成、扩增、和测定的任何其它方面发生的核苷酸改变。这些修正标志可以是为单独的序列的独立标志，或其可被嵌入其它标志内以帮助证实所使用的实验技术的准确性，例如，修正标志可以是基因座标志或鉴定标志的一组序列。
如本文使用的术语“诊断工具”指例如如在系统中联合使用的本发明的任何组合物或测定以对患者样品进行诊断测试或测定。
术语“卵子供体妊娠”指由于利用并非来自怀孕母本的人卵母细胞而导致的妊娠。
术语“杂交”通常地意思是互补的核酸链藉以发生配对的反应。DNA通常地是双链的，并且当链是分开的时，在适当的条件下其将重新杂交。杂合体可在DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA之间形成。其可在短链和含有与短链互补的区域的长链之间形成。不完全杂合体也可形成，但是其越不完全，其将越不稳定(并且越不可能形成)。
术语“鉴定标志”通常地指用于核酸区域的扩增产物的独特鉴定的、被并入扩增过程的引物区域的一系列核苷酸。鉴定标志序列优选地长度为6个或更多个核苷酸。在优选的方面，鉴定标志足够长以具有用靶序列独特地标记每个分子的统计概率。例如，如果有3000个拷贝的特定靶序列，则大体上有多于3000个鉴定标志，使得每个拷贝的特定靶序列有可能用独特的鉴定标志标记。鉴定标志可包含允许鉴定和修正测序错误的另外的核苷酸的标志，所述鉴定和修正包括检测在测序期间一个或更多个碱基的缺失、取代或插入以及可在测序之外诸如寡核苷酸合成、扩增、和测定的任何其它方面发生的核苷酸改变。标志可与任何其它标志联合以生成为两种特性提供信息的一个标志(例如，样品鉴定标志、基因座鉴定标志)。
术语“可能性”指通过直接地计算可能性得到的任何值或可以与可能性相关或以其他方式指示可能性的任何值。
如本文使用的术语“基因座(locus)”和“基因座(loci)”指基因组中已知位置的核酸区域。
术语“基因座标志”通常地指与染色体上的已知基因座对应的一系列核苷酸。通常地，基因座标志足够长以独特地标记每个已知的基因座区域。例如，如果方法使用相应于与已知的基因座相关的192个单独序列的192个已知的基因座区域，则有至少192个独特的基因座标志，每个独特地鉴定指示染色体上的特定基因座的区域。在本发明的方法中使用的基因座标志可指示样品中单独染色体上的不同基因座以及在不同染色体上存在的已知基因座。鉴定标志可包含允许鉴定和修正测序错误的另外的核苷酸，所述鉴定和修正包括检测在测序期间一个或更多个碱基的缺失、取代或插入以及可在测序之外诸如寡核苷酸合成、扩增、和测定的任何其它方面发生的核苷酸改变。
如本文使用的术语“母体样品”指取自妊娠哺乳动物含有胎儿和母体两者的无细胞基因组材料(例如，DNA)的任何样品。优选地，用于在本发明中使用的母体样品通过相对地无创的方法例如静脉切开术或用于从受试者提取外周样品的其它标准技术获得。
术语“解链温度”或Tm通常地被定义为双链核酸分子的群体在其处变为半离解成单链的温度。用于计算核酸的Tm的等式是本领域熟知的。如由标准参考文献指示的，Tm值的简单估计可通过以下等式来计算：Tm＝81.5+16.6(log10[Na+])0.41(％[G+C])-675/n-1.0m，其中核酸在具有0.5M或小于0.5M的阳离子浓度的水溶液中，(G+C)含量在30％和70％之间，n为碱基的数目，并且m为碱基对不匹配的百分比(参见，例如，Sambrook J等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring HarborLaboratory Press(2001))。其它的参考文献包括更复杂的计算，其将结构以及序列特征考虑入Tm的计算。
“微阵列”或“阵列”指具有表面的固相支持物，所述表面优选地但不排他地平面的或基本上平面的表面，其载有包含核酸的位点的阵列，使得阵列的每个位点包含寡核苷酸或多核苷酸的基本上相同或相同的拷贝并且被空间上限定且不与阵列的其它成员位点重叠；即，位点是空间上离散的。阵列或微阵列还可包含具有平面的非平面可询结构，诸如珠或孔。阵列的寡核苷酸或多核苷酸可共价地结合至固体支持物，或可非共价地结合。在例如Schena,编辑，Microarrays:A Practical Approach,IRL Press,Oxford(2000)中综述了常规的微阵列技术。“阵列分析”、“通过阵列分析”或“通过微阵列分析”指利用微阵列的分析，诸如例如特定核酸的分离或一种或更多种生物分子的序列分析。
当关于检测选择的核酸区域使用时，通过“非多态的”来指此类核酸区域的检测，此类核酸区域可包含一种或更多种多态性，但是其中检测不依赖于区域内的特定多态性的检测。因此选择的核酸区域可包含多态性，但是利用本发明的测定系统检测区域是基于区域的存在而非在该区域中特定的多态性的存在或不存在。
如本文使用的“核苷酸”指碱基-糖-磷酸组合。核苷酸是核酸序列(DNA和RNA)的单体单元。术语核苷酸包括核糖核苷三磷酸ATP、UTP、CTG、GTP和脱氧核糖核苷三磷酸诸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。此类衍生物包括例如[αS]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP以及在含有其的核酸分子上赋予核酸酶抗性的核苷酸衍生物。如本文使用的术语核苷酸也指双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。双脱氧核糖核苷三磷酸的例证性实例包括但不局限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP、和ddTTP。
根据本发明，“核苷酸”可以是未经标记的或通过熟知的技术可检测地标记的。很多综述中描述了荧光标记及其向寡核苷酸的连接，所述综述包括Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,第9版,Molecular Probes,Inc.,Eugene OR(2002)；Keller和Manak,DNA Probes,第2版,Stockton Press,New York(1993)；Eckstein,编辑,Oligonucleotides andAnalogues:A Practical Approach,IRL Press,Oxford(1991)；Wetmur,CriticalReviews in Biochemistry and Molecular Biology,26:227-259(1991)；等。在以下参考文献的实例中公开了本发明可用的其它的方法：Fung等人,美国专利号4,757,141；Hobbs,Jr.,等人，美国专利号5,151,507；Cruickshank，美国专利号5,091,519；Menchen等人，美国专利号5,188,934；Begot等人，美国专利号5,366,860；Lee等人，美国专利号5,847,162；Khanna等人，美国专利号4,318,846；Lee等人，美国专利号5,800,996；Lee等人，美国专利号5,066,580；Mathies等人，美国专利号5,688,648；等。还可用量子点进行标记，如以下专利和专利公布中公开的：美国专利号6,322,901；6,576,291；6,423,551；6,251,303；6,319,426；6,426,513；6,444,143；5,990,479；6,207,392；2002/0045045；和2003/0017264。可检测的标记包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物性发光标记和酶标记。核苷酸的荧光标记可包括但不局限于荧光素、5-羧基荧光素(FAM)、2'7'-二甲氧基-4'5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、罗丹明、6-羧基罗丹明(R6G)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、4-(4'二甲基氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)、Cascade Blue、俄勒冈绿、德克萨斯红、花青和5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。荧光标记的核苷酸的特定实例包括从Perkin Elmer,Foster City,Calif.可得的[R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G]dCTP、[TAMRA]dCTP、[JOE]ddATP、[R6G]ddATP、[FAM]ddCTP、[R110]ddCTP、[TAMRA]ddGTP、[ROX]ddTTP、[dR6G]ddATP、[dR110]ddCTP、[dTAMRA]ddGTP、和[dROX]ddTTP；从Amersham,Arlington Heights,IL可得的FluoroLink脱氧核苷酸(FluoroLinkDeoxyNucleotides)、FluoroLink Cy3-dCTP、FluoroLink Cy5-dCTP、FluoroLink FluorX-dCTP、FluoroLink Cy3-dUTP、和FluoroLink Cy5-dUTP；从Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN可得的荧光素-15-dATP、荧光素-12-dUTP、四甲基-罗丹明-6-dUTP、IR770-9-dATP、荧光素-12-ddUTP、荧光素-12-UTP、和荧光素-15-2'-dATP；以及从Molecular Probes,Eugene,OR可得的染色体标记的核苷酸(Chromosomee Labeled Nucleotides)、BODIPY-FL-14-UTP、BODIPY-FL-4-UTP、BODIPY-TMR-14-UTP、BODIPY-TMR-14-dUTP、BODIPY-TR-14-UTP、BODIPY-TR-14-dUTP、Cascade Blue-7-UTP、Cascade Blue-7-dUTP、荧光素-12-UTP、荧光素-12-dUTP、俄勒冈绿488-5-dUTP、罗丹明绿-5-UTP、罗丹明绿-5-dUTP、四甲基罗丹明-6-UTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、德克萨斯红-5-UTP、德克萨斯红-5-dUTP、和德克萨斯红-12-dUTP。
如本文使用的术语“寡核苷酸(oligonucleotides)”或“寡核苷酸(oligos)”指天然的或修饰的核酸单体的线性寡聚物，包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其异头形式、肽核酸单体(PNA)、锁核苷酸单体(LNA)等，或其组合，其能通过单体与单体相互作用的规则模式的方式特异地与单链多核苷酸结合，所述单体与单体相互作用诸如碱基配对的Watson-Crick类型、碱基堆积、碱基配对的Hoogsteen或反式Hoogsteen类型等。通常地单体通过磷酸二酯键或其类似物连接以形成大小范围从几个单体单位例如8-12个到几十个单体单位例如100-200或更多个的寡核苷酸。合适的核酸分子可通过两者均通过引用被并入的由Beaucage和Carruthers(Tetrahedron Lett.,22:1859-1862(1981))描述的亚磷酰胺方法或通过根据Matteucci,等人(J.Am.Chem.Soc.,103:3185(1981))的三酯方法来制备，或通过诸如利用商业自动化寡核苷酸合成仪的其它化学方法。
如本文使用的术语“聚合酶”指利用另一条链作为模板将单独核苷酸连接在一起成长链的酶。有两种常见类型的聚合酶-合成DNA的DNA聚合酶和合成RNA的RNA聚合酶。在这两种类型中，取决于什么类型的核酸能起模板的作用以及形成什么类型的核酸，有很多亚型的聚合酶。
如本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”指用于体外复制靶DNA的特定片段的技术，甚至在额外的非特异的DNA的存在下。引物被添加至靶DNA，在该处引物利用核苷酸和通常地Taq聚合酶等起始靶DNA的复制。通过循环温度，靶DNA重复地被变性和复制。即使与其它随机DNA混合，靶DNA的单拷贝能被扩增以获得数十亿的复制物。聚合酶链式反应能被用来检测并测量很小量的DNA并被生成DNA的定制片段。在一些实例中，线性扩增方法可被用作PCR的可替代选择。
如本文使用的术语“多态性”指可指示该特定的基因座的基因座中的任何遗传变化，包括但不局限于单核苷酸多态性(SNP)、甲基化差异、短串联重复(STR)等。
通常地，“引物”为诸如在聚合酶链式反应的合成步骤中，或在某些测序反应中使用的引物延伸技术中被用来例如引发DNA延伸、连接和/或合成的寡核苷酸。引物也可在杂交技术中被用作提供核酸区域与捕获寡核苷酸的互补性的方法，用于特定核酸区域的检测。
如本文使用的术语“研究工具”指被用于学术或商业性质的科学探究的本发明的任何组合物或测定，包括药物和/或生物治疗的开发。本发明的研究工具并非意图是治疗性的或要受制于监管机构批准；而是，本发明的研究工具意图有利于研究且有助于此类开发活动，包括目的是产生支持监管机构提交的信息而进行的任何活动。
术语“样品标志”通常地指一系列独特的核苷酸(即，在用于多个样品的分析的多路测定系统中每种样品标志对于样品是唯一的)。样品标志因此可被用来帮助用于单反应容器中的不同样品的多路的核酸区域鉴定，以使得每个样品可基于其样品标志而被鉴定。在优选的方面，对于一组样品中的每个样品有独特的样品标志，并且在测序期间样品被混合。例如，如果12个样品被混合至单个测序反应，有至少12个独特的样品标志以使得每个样品被独特地标记。标志可与任何其它标志联合以生成为两种特性提供信息的一个标志(例如，样品鉴定标志、样品基因座标志)。
如本文使用的术语“选择的核酸区域”指与单独染色体对应的核酸区域。此类选择的核酸区域可被直接地分离并例如基于杂交和/或其它基于序列的技术从用于检测的样品富集，或在检测序列之前其可使用样品作为模板而被扩增。用于在本发明的测定系统中使用的核酸区域可基于以下被选择：个体间的DNA水平变化、基于对特定染色体的特异性、基于CG含量和/或选择的核酸区域的所需的扩增条件、或在阅读本公开内容之后对于本领域技术人员来讲将是清楚的其它特征。
术语“选择性扩增”、“选择地扩增”等指整体上或部分的取决于寡核苷酸与选择的基因组区域中的序列的杂交的扩增过程。在某些选择性扩增中，用于扩增的引物与选择的基因组区域是互补的。在其它的选择性扩增中，用于扩增的引物为通用引物，但是如果用于扩增的核酸区域与感兴趣的基因组区域是互补的，则其只产生一种产物。
如本文使用的术语“测序”、“序列确定”等通常地指可被用来确定核酸中的核苷酸碱基的顺序的任何和所有的生化方法。
当提及在指定的测定条件下导致生成统计上显著的阳性信号的结合配偶体(例如，核酸探针或引物、抗体等)时，如本文使用术语“特异性结合”、“特异的结合”等。通常地，相互作用将随后导致作为不期望的相互作用(背景)的结果生成的任何信号的标准偏差的至少两倍的可检测的信号。
当被用来描述扩增过程时，术语“通用的”指单个引物或一组引物用于多个扩增反应的使用。例如，在检测96种不同的靶序列时，所有的模板可共用相同的通用引发序列，允许利用单组引物多路扩增96种不同的序列。此类引物的使用大大地简化了多路，在于只需要两个引物来扩增多个选择的核酸序列。当被用来描述引发位点时，术语“通用的”为通用引物将与其杂交的位点。
还应注意可使用通用引发序列/引物的“组”。例如，在高度地多路的反应中，使用若干组通用引物可以是有用的，而不是单组；例如，96种不同的核酸可具有第一组通用引物序列，和第二96不同组的通用引发序列等。
发明大概
本发明提供了用于在含有具有卵子供体妊娠的妊娠妇女的无细胞DNA的混合样品中鉴定包括完整的染色体(例如，非整倍体)的特定基因组区域的拷贝数变异的改良的方法。这些方法对于来自个体的任何混合样品是有用的，所述混合样品包括来自两个或更多个不同个体的无细胞基因组材料(例如DNA)，例如，含有母体和胎儿的无细胞DNA的混合样品、含有来自移植物供体和受体的无细胞DNA的混合样品等。
在某些方面，来自卵子供体妊娠的母体样品中的胎儿贡献百分比利用本发明的测定方法来估计。在某些特定的方面且如本文描述的，确定母体样品中无细胞DNA的胎儿贡献百分比可被用来增加用于确定胎儿非整倍性的存在或不存在的可能性的选择的核酸区域的频率计算的准确度。
在某些方面，本发明的测定方法提供了来自感兴趣的染色体和/或用于拷贝数变异检测的参考染色体的核酸区域的选择的富集。本发明的特殊优势是，选择的核酸区域可利用多种检测和定量技术而被进一步分析，所述多种检测和定量技术包括但不局限于杂交技术、数字PCR和高通量测序确定技术。对于任何染色体可针对任何数目的核酸区域设计选择探针。尽管在选择核酸区域的鉴定和定量之前扩增是非强制性的，在检测之前有限的扩增是优选的。
母体样品中胎儿DNA含量的确定
本发明提供了用于鉴定含有来自怀孕母本的母体无细胞DNA和卵子供体妊娠中的胎儿无细胞DNA两者的母体样品中的胎儿染色体非整倍性的方法，以及用于此类鉴定的测定系统。在某些方面，由于确定母体样品中胎儿DNA的相对百分比将提供关于基因组区域的预期的统计存在的重要信息并且从该预期的变化可指示与插入、缺失或非整倍性相关的拷贝数变化，所以其可有益于执行测定系统。由于胎儿贡献百分比可用于确定母体样品中鉴定的核酸区域的水平的变化的定量统计显著性，所以在母体样品中的胎儿DNA的水平低的情况中这是特别地有用的。在其它方面，母体样品中相对胎儿无细胞DNA百分比的确定可有益于估计检测胎儿非整倍性的确定性或功效的水平。胎儿无细胞DNA贡献百分比的不准确估计能造成胎儿非整倍性的存在或不存在的不准确风险确定，导致假阳性或假阴性结果。
本发明的方法包括询问选择的核酸区域中的卵子供体提供信息的基因座，然后选择的核酸区域被检测来确定等位基因的相对频率以鉴定诸如低频率等位基因和高频率等位基因的卵子供体提供信息的基因座。因为在母体样品中母体等位基因天然地更丰富，所以不论这些等位基因是否存在于胎儿基因组中，高频率等位基因为母体等位基因。低频率等位基因是胎儿等位基因，在该处至少一个拷贝的等位基因在母体基因组是不存在的。低频率等位基因的频率和高频率等位基因的频率被用来计算样品中的胎儿无细胞DNA百分比，例如，低频率等位基因的总和可除以高和低频率等位基因的总和。
图1是在确定来自卵子供体妊娠的母体样品中无细胞DNA的胎儿贡献百分比中使用的一般步骤的简化的流程图。图1显示了方法100，其中在第一步骤101中，从具有卵子供体妊娠的妊娠妇女提供含有母体和胎儿的无细胞DNA的母体样品。母体样品可以是全血、血浆、或血清的形式。任选地，在进一步分析之前将无细胞DNA从样品分离。在步骤103，在来自样品的无细胞DNA中，两种或更多种多态的核酸区域被询问。询问可包括选择的多态的核酸的测序，随后是这些核酸区域的选择性扩增，以允许保留起始样品中选择的核酸区域的相对量的方式增加选择的核酸区域的拷贝数。任选地，然后核酸区域可被通用地扩增，例如通过使用通用引物序列。可在确定步骤之前或期间进行通用扩增。在步骤105，经询问的核酸区域被检测。检测可包括诸如序列确定或杂交的检测方法。选择的核酸序列的检测可通过检测与选择的多态的区域有关的一个或更多个标识例如基因座标志或等位基因标识来进行。在步骤107，确定经询问的核酸区域中的多态性的相对频率以鉴定卵子供体提供信息的基因座。在步骤109中，利用鉴定的卵子供体提供信息的基因座来计算胎儿无细胞DNA百分比。胎儿百分比的计算可包括使低频率等位基因的总和除以组合的低和高频率等位基因的总和。这些概念将在以下被更详细的讨论。
在确定母体样品中的胎儿贡献百分比方面，考虑到怀孕母本和胎儿不共用母本的接近一半的遗传信息，卵子供体妊娠不同于传统妊娠。在其中胎儿是母本的遗传后代的母体样品中，尽管由于例如突变某些等位基因可不同，但是母体DNA和胎儿DNA通常地在任何特定的基因座处具有至少一个共同的等位基因。但是，在卵子供体妊娠中，母体DNA和胎儿DNA在特定的基因座处可不具有任何共同的等位基因。例如，母体基因组和胎儿基因组两者可在相同的基因座处包含纯合的等位基因，但是母体等位基因两者可与胎儿等位基因不同。
用于在本发明中使用的卵子供体提供信息的基因座为其中至少一个胎儿等位基因与母体等位基因不同的基因座。例如，母体基因组可在特定的基因座处包含纯合的等位基因而胎儿基因组包含杂合的等位基因，其中母体和胎儿基因组具有一个共同的等位基因。可选地，母体基因组可在特定基因座处包含杂合的等位基因且胎儿基因组可包含纯合的等位基因，其中母体和胎儿DNA具有一个共同的等位基因。在仍然另一个实例中，如以上描述的，母体基因组可在特定的基因座处包含纯合的等位基因并且胎儿基因组可在特定的基因座处包含纯合的等位基因，其中母体等位基因两者与胎儿等位基因不同。
图2是例证在特定的基因座处卵子供体妊娠中母体基因型、卵子供体基因型和胎儿基因型的14种可能的组合的表，并且还显示了其作为提供信息的基因座相对不提供信息的基因座的分类。在图2中，A被用来表示第一类型的等位基因而B被用来表示不同类型的等位基因。例如，在组合201中，母体基因型为AA，卵子供体基因型为AA且胎儿基因型为AA。在该情况下，因为胎儿DNA不包含与母体DNA不同的至少一个等位基因，所以对于评价胎儿贡献百分比的目的，基因座是不提供信息的。在另一个实例中，组合204包含AA的母体基因型，和AB的卵子供体基因型，和AB的胎儿基因型。因为胎儿DNA在该基因座处具有与母体等位基因不同的至少一个等位基因，所以这是卵子供体提供信息的基因座。在仍然另一个实例中，组合105包含母体基因型AA、卵子供体基因型AB和胎儿基因型BB。因为胎儿来源具有与母体来源的等位基因不同的至少一个等位基因，所以这是卵子供体提供信息的基因座，并且事实上在该基因座处胎儿DNA的等位基因两者与母体DNA不同。
在一些特定的方面，在感兴趣的等位基因处的母体DNA的相对胎儿贡献可与在该等位基因处的非母体贡献比较，以确定样品中的近似胎儿DNA浓度。
利用胎儿常染色体多态性和遗传变化来确定母体样品中的胎儿DNA含量
如以上描述的，在来自卵子供体妊娠的母体样品中，来自胎儿的DNA在特定的基因座处可不具有与怀孕母本共同的任何等位基因。确定其中胎儿具有不同于怀孕母本的等位基因的至少一个等位基因的基因座，能允许估计母体样品中的胎儿DNA百分比，并且由此提供用来对感兴趣的染色体计算染色体频率的统计上的显著差异的信息。
在某些方面，确定胎儿多态性需要靶向SNP和/或突变分析以鉴定母体样品中胎儿DNA的存在。在一些方面，可进行使用父本和母本的先前的基因分型。例如，亲本可已经历用于鉴定疾病标志物的此类基因型确定，例如，用于诸如囊性纤维化、肌肉萎缩症、脊髓性肌萎缩或甚至RhD基因的状态的紊乱的基因型的确定可被确定。此类在多态性、拷贝数变化或突变上的不同可被用来确定母体样品中的胎儿贡献百分比。
在一个优选的方面，母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比可利用多路的SNP检测来定量，而不利用母体或亲本基因型的先前知识。在该方面，利用每个区域中具有已知的SNP的两个或更多个选择的多态的核酸区域。在优选的方面，选择的多态的核酸区域位于不可能为非整倍性的常染色体例如1-12号染色体上。扩增来自母体的选择的多态的核酸区域。在优选的方面，扩增是通用的。
在优选的实施方案中，在一个容器中的一个反应中扩增选择的多态的核酸区域。然后确定并定量母体样品中选择的多态的核酸区域的每个等位基因。在优选的方面，高通量测序被用于此类确定和定量。在序列确定之后，鉴定其中母体和胎儿基因型不同的基因座，例如，母体基因型是纯合的且胎儿基因型是杂合的，或母体和胎儿两者的基因型均是纯合的并且胎儿等位基因两者与母体等位基因不同。可通过针对特定的选择的核酸区域观察一个等位基因的高相对频率(>60％)和另一个等位基因的低相对频率(<20％且>0.15％)来进行该鉴定。由于多个基因座在等位基因的丰度的测量中减少变化的量，其的使用是特别地有优势的。满足该要求的所有的基因座或其子集被用来通过统计分析确定胎儿浓度。
通过考虑其中胎儿等位基因两者均与母体等位基因不同的卵子供体提供信息的基因座，来确定卵子供体妊娠中的胎儿浓度。检测额外的多态的核酸可导致胎儿贡献百分比的过高估计，在确定步骤之前或之后此类基因座不被考虑。在特定的方面，只有两者均与母本的等位基因不同的胎儿等位基因在确定中被使用。在其它的方面，在确定之前或之后，两者均与母本的等位基因不同的胎儿等位基因被排除。在更特别的方面，其中只有一个等位基因与母本等位基因不同的胎儿等位基因以及等位基因。在一个方面，通过确定来自两个或更多个基因座的低频率等位基因的相对频率，确定高频率等位基因的相对频率，并且将低频率等位基因的相对频率与低和高频率等位基因两者的频率比较来估计胎儿浓度。
在一个方面，通过分析基因座的子集来确定胎儿浓度百分比，所述子集诸如其中母本或胎儿的基因型是纯合的并且另一个基因型是杂合的子集。在特定的方面，利用来自两个或更多个选择的基因座的低频率等位基因的频率以及高和低频率等位基因的频率来确定胎儿浓度。在一个方面，通过将来自两个或更多个基因座的低频率等位基因加和并且除以高和低频率等位基因的和来确定胎儿浓度。在另一个方面，通过对来自两个或更多个基因座的低频率等位基因求平均值，除以高和低频率等位基因的平均值并乘以2来确定胎儿无细胞DNA百分比。可在确定等位基因的相对频率之前或在确定等位基因的相对频率之后进行基因座的子集的分离。
在另一个方面，通过分析其中母本和胎儿基因型均为纯合的且胎儿等位基因两者均与母本等位基因不同的基因座的子集来确定胎儿浓度百分比。在特定的方面，利用来自两个或更多个选择的基因座的低频率等位基因的频率以及高和低频率等位基因的频率来确定胎儿浓度。在某些特定的方面，通过对来自两个或更多个基因座的低频率等位基因求和，并除以高和低频率等位基因的和来确定胎儿无细胞DNA百分比。在另一个方面，通过对来自两个或更多个基因座的低频率等位基因求平均值，并除以高和低频率等位基因的平均值来确定胎儿贡献百分比。可在确定等位基因的相对频率之前或在确定等位基因的相对频率之后进行基因座的子集的分离。
在仍然另一个方面，通过分析含有多态的核酸的所有卵子供体提供信息的基因座来确定胎儿贡献百分比。例如，使用其中母本或胎儿的基因型是纯合的且另一个是杂合的所有基因座，以及其中母本和胎儿的基因型是纯合的且胎儿等位基因两者均与母本等位基因不同的所有基因座。在一方面，利用计算的组合来确定胎儿贡献百分比：对于其中母本和胎儿的基因型两者是均是纯合的并且胎儿等位基因两者均与母本等位基因不同的基因座，通过利用来自两个或更多个选择的基因座的低频率等位基因的频率以及高和低频率等位基因的频率；以及对于其中母本或胎儿基因型是纯合的且另一个是杂合的基因座，通过利用来自两个或更多个基因座一起的低频率等位基因的频率以及高和低频率等位基因的频率。
对于很多等位基因，母本和胎儿序列可以是纯合且是相同的，并且由于该信息在母本和胎儿DNA之间无区别，其在确定母本样品中的胎儿DNA百分比中是没有用的。在胎儿百分比的计算中，本发明利用其中胎儿和母本DNA(例如，含有与母本等位基因不同的至少一个等位基因的胎儿等位基因)之间有可区别的差异的等位基因的信息。因此与对于母本和胎儿DNA来讲相同的等位基因区域有关的数据不被选择用于分析，或在确定胎儿DNA百分比之前被从相关数据移除，以使得不使有用的数据无效。
在Chu等人,Prenat Diagn 2010；30:1226-1229中可找到用于定量母本血浆中的胎儿DNA的示例性方法，通过引用将其并入本文。
在一个方面，如果由于实验性错误、或来自特定样品内的先天的遗传倾向使得区域的量或频率表现为是异常值，选择的核酸区域可被排除。在另一个方面，选择的核酸可在确定低和高频率等位基因的频率之前经历统计的或数学的调整，诸如归一化、标准化、聚类或转化。在另一个方面，选择的核酸可在确定低和高频率等位基因的频率之前经历归一化和数据实验性错误排除两者。
在优选的方面，12个或更多个基因座被用于分析。在另一个优选的方面，24个或更多个基因座被用于分析。在另一个优选的方面，48个或更多个基因座被用于分析。在另一个方面，一个或更多个标志被用来鉴定样品、基因座、等位基因或核酸的鉴定。
在一个优选的方面，可利用母本和胎儿等位基因中的串联SNP检测来定量母本样品中的胎儿贡献百分比。在Mitchell等人,美国专利号7,799,531和美国专利申请号12/581,070、12/581,083、12/689,924和12/850,588中公开了用于鉴定从母本样品提取的DNA中的串联SNP的技术。这些通过检测在胎儿和母本基因组之间具有不同的单倍型的母本样品中的至少一个串联单核苷酸多态性(SNP)来描述了胎儿和母本基因座的区别。这些单倍型的鉴定和定量可对母本样品直接地进行，如在Mitchell等人的公开内容中描述的，并被用来确定母本样品中的胎儿贡献百分比。
检测染色体非整倍性
在某些方面，本发明的方法提供了用于鉴定来自卵子供体妊娠、含有母本和胎儿DNA两者的母本样品中的胎儿染色体非整倍性的机制。在某些方面，可通过任何合适的方法来进行胎儿非整倍性的鉴定，如在阅读本说明书后对本领域技术人员来讲将是明显的。方法包括多态检测，诸如特定核酸的SNP检测、或优选地基于胎儿和母本序列的非多态检测、和优选地母本和胎儿之间的保守的非多态序列。示例性方法如下：
在一些方面，在检测之前，核酸可从母本样品选择，即，在检测之前利用扩增或诸如杂交的捕获技术从母本样品选择性地分离。在另一个特定的方面，在卵子供体妊娠中在胎儿非整倍性检测中使用的核酸可在检测后被选择，例如通过过滤从诸如母本样品内的核酸的大量地平行的鸟枪法测序的技术生成的频率数据。
在一些特定的方面，卵子供体妊娠中的胎儿非整倍性检测使用询问染色体特异的基因座的选择性测序方法，使能够高度地多路测序来自感兴趣的特定染色体的选择的基因座。染色体选择性测序可被用来在单个反应中同时地测定多态的和非多态的基因座，使能够确定母体样品中的胎儿非整倍性和胎儿核酸贡献百分比。随后地，可使用本发明的新颖的风险计算，其借助胎儿非整倍性和胎儿贡献评价来计算每个受试者中胎儿非整倍性(例如胎儿三体性)的可能性。
在一个方面，本发明利用诸如在例如Quake等人,美国专利号8,008,018、7,888,017和Shoemaker等人中描述的随机DNA区段分析来确定胎儿非整倍性。简单来讲，可利用选择的核酸序列来区别地检测诸如母体样品的混合样品内的核酸的量。核酸可以是基因组DNA或RNA，并且优选地为mRNA。在mRNA的情况中，人们可选择与在胎儿中高表达的基因对应的靶序列。用针对核酸中的两个靶序列中的至少一个的一个或更多个序列特异的探针来检测每个样品中的核酸，以获得可检测的反应产物。将对所询问的染色体特异的探针与反应样品、连同对另一条(例如，未询问的)染色体特异的对照探针组合。在大多数情况中，反应产物将来自母体核酸，但是少量的反应产物将来自胎儿核酸。为了区别随机变化和胎儿结果，运行大量的反应，并且对结果进行统计处理。本过程中的标记和检测被用来区别区别单靶序列的存在或不存在，被称作“数字分析”，尽管其可用区别离散样品中的一个和多于一个的靶序列的灵敏的核酸检测过程来进行。
在另一个实例中，核酸(例如，随机地选自样品的DNA片段)的大量地平行测序被用来确定母体样品中的核酸的序列，以确定母体样品内的核酸的选择的频率。用于进行核酸序列的大量地平行测序的示例性技术包括在美国专利号8,318,430、8,296,076和8,195,415，以及在美国申请US20090029377、20090087847、20100112590、20110312503、20110319272、20110246083、20110318734、20120003635、20120003636、20120003637、20120190559和20120208708中公开的那些。对于染色体频率异常(例如，三体性)的检测，测序的核酸被标识为来自第一染色体，并且将来自母体样品中的至少一个第一染色体的核酸的总量与来自母体样品中的至少一个第二染色体的核酸的总量比较。总的核酸量包括母本样品中来自胎儿和母本两者的核酸，并且来自胎儿的核酸在确定与染色体频率对应的核酸的频率方面与母体是无区别的。在一个第一染色体被推测为整倍体，并且第二染色体被怀疑为非整倍体的情况下，比较第一和第二染色体的核酸的总数目以确定所述非整倍性的存在或不存在。
在更特别的方面，用于核酸的大量地平行测序的样品富含多态区域。用于进行富集的示例性技术包括在例如WO2011091063、WO2011091046和美国专利申请号20110230358中公开的那些。简单来讲，扩增含有无细胞DNA的母体样品的部分以增大样品中一个或更多个多态序列的拷贝数目，并且然后将核酸的扩增部分添加回用于测序的原始样品。可选地，样品经受全基因组测序以获得多个序列标签，并且将标签的序列与多个参考多态性的序列比较。
在一些方面，利用基于阵列的杂交过程来测序核酸，基于阵列的杂交过程诸如在美国专利公布号2011/0172111中描述的那些。在其它的方面，利用纳米孔技术检测来检测生物分子，纳米孔技术检测诸如在美国专利公布号2011/0124518中描述的那些。
在另一个方面，利用诸如在美国专利号7,727,720、7,718,370、7,598,060、7,442,506、7,332,277、7,208,274和6,977,162中描述的那些的方法，利用样品中在母体和胎儿等位基因之间不同的多态性来测序并比较核酸。简单来讲，方法利用多态的检测以鉴定染色体异常。于在母本中是纯合的且在胎儿中是杂合的等位基因处确定序列，并确定杂合等位基因的比率。杂合等位基因的比率被用来指示染色体异常的存在或不存在。
在仍然另一个方面，胎儿非整倍性的确定利用串联多态性的鉴定，诸如在例如美国专利号7,799,531以及美国公布号2011/0117548、2011/0059451、2010/0184044、2010/184043和2008/0020390中描述的。简单来讲，串联SNP被检测并被用来区别母体样品中的母体和胎儿等位基因以通过将母体DNA与胎儿DNA比较来检测胎儿染色体异常。
在优选的方面，胎儿非整倍性的确定利用代表性基因座的选择的扩增。在例如美国申请号13/013,732、13/205,490、13/205,570和13/205,603中公开了此类技术，将其所有的全部内容并入本文。这些技术利用基因组区域的检测，所述基因组区域的检测使用固定序列寡核苷酸并通过连接和/或延伸将固定序列寡核苷酸加入。这可利用连接和扩增的组合来实现，例如，两个或更多个固定序列寡核苷酸以及任选地与固定序列寡核苷酸之间的区域互补的桥接寡核苷酸的连接。在另一个实例中，这可利用延伸、连接和扩增的组合来实现。
在一些方面，正常群体的变化从具有胎儿DNA的相似比例的正常样品确定。例如，可通过加入来自非整倍体染色体的贡献百分比来计算具有特定的胎儿无细胞DNA百分比的DNA样品中的三体性的预计的染色体剂量。然后可将样品的染色体剂量与正常胎儿的染色体剂量比较以及如果待统计地确定的三体则与预计的染色体剂量比较，利用染色体剂量的变化，是否样品更可能是正常的或三体，以及其是一个或另一个的统计可能性。
在优选的方面，在单个反应中被选择用于在母体样品中分析的核酸区域包括用于确定胎儿贡献百分比的核酸区域以及与被用来检测染色体剂量异常的两个或更多个染色体对应的核酸区域两者。单个反应的使用有助于使利用单独的反应可能引入的污染或偏倚的风险最小化，单独的反应可能引入的污染或偏倚可以另外的方式使结果出现偏斜。事实上，本发明的方法优选地作为多路的或者甚至高度地多路的反应进行，其中在单个反应中对于每个样品询问多态的和非多态的基因座(分别地用于确定胎儿贡献百分比和胎儿非整倍性)两者。在优选的实施方案中，由于在美国申请号13/013,732、13/205,490、13/205,570和13/205,603中描述的多路测定在单个多路的反应中询问母体样品中的多态的和非多态的基因座两者，所以使用这些测定。
在其它的方面，对于确定胎儿核酸比例以及检测胎儿染色体异常两者，可询问一个或更多个选择的核酸区域。对于胎儿贡献百分比和检测胎儿非整倍性两者，使用相同的区域还有助于使由实验性错误或污染造成的偏倚最小化。
扩增方法
很多扩增方法可被用来提供在本发明的测定系统中分析的扩增的核酸，并且此类方法优选地被使用以增加来自卵子供体妊娠的母体样品中的感兴趣的核酸区域的拷贝数，其方式允许保留关于母体样品中的核酸区域的初始含量的信息。尽管本文未详细描述扩增和分析的所有组合，但是利用与该说明书一致的不同的扩增方法和/或分析工具来分离和/或分析区域的核酸充分在本领域技术人员能力范围内，并且在阅读本公开内容后此类变化形式对本领域技术人员将是明显的。
此类扩增方法包括但不局限于聚合酶链式反应(PCR)(美国专利号4,683,195和4,683,202；PCR Technology:Principles and Applications for DNAAmplification,编辑H.A.Erlich,Freeman Press,NY,N.Y.,1992)、连接酶链式反应(LCR)(Wu和Wallace,Genomics 4:560,1989；Landegren等人,Science241:1077,1988)、链置换扩增(SDA)(美国专利号5,270,184和5,422,252)、转录介导的扩增(TMA)(美国专利号5,399,491)、连锁的线性扩增(linkedlinear amplification，LLA)(美国专利号6,027,923)等，自主序列复制(Guatelli等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87,1874(1990)和WO90/06995)、靶多核苷酸序列的选择性扩增(美国专利号6,410,276)、共有序列引发的聚合酶链式反应(CP-PCR)(美国专利号4,437,975)、随机引发的聚合酶链式反应(AP-PCR)(美国专利号5,413,909、5,861,245)和基于核酸的序列扩增(NASBA)。(参见，美国专利号5,409,818、5,554,517和6,063,603，通过引用将其每一个并入本文)。可被使用的其它扩增方法包括：在PCT专利申请号PCT/US87/00880中描述的Q-β复制酶；在Walker等人1992,NucleicAcids Res.20(7):1691-6,1992中描述的诸如SDA的等温扩增方法；以及在美国专利号5,648,245中描述的滚环扩增。在美国专利号5,242,794、5,494,810、4,988,617以及在美国序列号09/854,317以及美国公布号20030143599中描述了可使用的其它扩增方法，通过引用将其每个并入本文。在一些方面，通过多路基因座特异的PCR扩增DNA。在优选的方面，利用适配体连接和单引物PCR来扩增DNA。扩增的其他可得的方法包括平衡PCR(Makrigiorgos,等人(2002),Nat Biotechnol,20卷,936-9页)和自主序列复制(Guatelli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874,1990)。基于此类方法，本领域技术人员能容易地在对感兴趣的核酸区域5'和3'的任何合适区域中设计引物。此类引物可被用来扩增任何长度的DNA，只要DNA在其序列中含有感兴趣的核酸区域。
扩增的来自感兴趣的基因组区域的选择的核酸的长度通常足够长以提供足够的序列信息，来区别其与扩增和/或选择的其他核酸。通常地，扩增的核酸长度为至少约16个核苷酸，并且更通常地，扩增的核酸长度至少为约20个核苷酸。在本发明的优选的方面，扩增的核酸长度为至少约30个核苷酸。在本发明的更优选的方面，扩增的核酸长度为至少约32、40、45、50或60个核苷酸。在本发明其它方面，扩增的核酸长度可以是约100、150或多达200。
在某些方面，选择性扩增利用一轮或几轮扩增，所述一轮或几轮扩增用含有与选择的核酸互补的核酸的引物对。在其它的方面，选择性扩增包括初始的线性扩增步骤。如果DNA的起始量是很有限的，则这些方法可以是特别地有用的，例如，在样品中的无细胞DNA以有限量可得的情况中。这种机制增加代表原始DNA含量的DNA分子的量，并且在需要DNA或DNA的一部分的精确定量(例如，母体样品中的胎儿DNA贡献)的情况中有助于降低取样误差。
因此，在一个方面，对含有无细胞DNA的起始母体样品进行有限的循环数的序列特异的扩增。循环数通常地小于用于通常PCR扩增的循环数，例如5-30个循环或更少。可设计引物或探针以扩增特定的基因组区段或区域。可用末端标签在5’端处(例如，用生物素)或沿着引物或探针的其它位置修饰引物或探针，以使得扩增产物能被纯化或附接至固体基质(例如，珠或阵列)，用于进一步的分离或分析。在优选的方面，引物是多路的，使得单个反应从不同的区域产生多个DNA片段。然后来自线性扩增的扩增产物能用标准PCR方法或用另外的线性扩增而被进一步扩增。
例如，无细胞DNA能从来自妊娠妇女的血液、血浆、或血清分离，并用针对与感兴趣的染色体相应的一组数量的核酸区域的引物孵育。优选地，用于初始扩增的引物对的数目将为12对或更多、更优选地24对或更多、更优选地36对或更多、甚至更优选地48对或更多、并且甚至更优选地96对或更多。引物中的每个与单个核酸区域对应，并且任选地被加标签用于鉴定和/或分离。进行有限的循环数，优选地10个或更少。随后地分离扩增产物，例如，当引物被连接至生物素分子时，扩增产物能经由在固体基质上与亲和素或链霉亲和素结合而被分离。然后对产物进行进一步的生化过程，诸如用其它引物(例如，通用引物)进一步扩增和/或诸如序列确定和杂交的检测技术。
扩增的效率在位点之间和在循环之间可变化，以使得在某些系统中，归一化可被用来确保来自扩增的产物代表核酸含量起始材料。执行本发明的测定系统的人能使用来自多个样品的信息来确定在有限的初始线性扩增之后在核酸水平上的变化，包括在个体样品中的不同核酸区域中的变化和/或不同样品中的相同核酸区域之间的变化。可在归一化中使用此类信息以阻止DNA含量的初始水平的偏斜。
通用扩增
在本发明的优选的方面，在核酸区域检测技术之前或期间，选择性扩增或富集后，选择性地扩增的核酸区域被优选地扩增。在本发明的另一个方面，在核酸区域检测技术期间，核酸区域被选择性地扩增，而无任何先前扩增。在多路的测定系统中，通过利用待使用本发明的测定系统分析的多个核酸区域的通用扩增来优选地进行该扩增。在选择性扩增期间或之后，通用引物序列被添加至选择性地扩增的核酸区域，以使得其可在单个通用扩增反应中被进一步扩增。例如，在选择性扩增过程期间，这些通用引物序列可被添加至核酸区域，即，用于选择性扩增的引物具有位于基因座两侧的通用引物序列。可选地，含有通用扩增序列的适体可被添加至选择的核酸的末端，作为来自母体样品的选择的核酸的扩增和分离之后的适体。
在一个示例性方面，使用含有与感兴趣的染色体的选择的区域互补的区域和通用引发位点的引物从母体样品初始地扩增核酸。在初始的选择性扩增之后进行通用扩增步骤以增加用于分析的核酸区域的数目。这种将引物区域引入到初始扩增产物允许在分析例如序列确定之前或期间，所有的或部分的选择的核酸的随后的可控的通用扩增。
在DNA扩增期间能引入偏倚和变化性，诸如在聚合酶链式反应(PCR)期间所观察到的。在其中扩增反应是多路的情况中，存在基因座将以不同的速率或效率扩增的可能性。该可能性的一部分可归因于多路反应中的引物的多样性，由于碱基组成使得在特定的实验条件下一些比其它的具有更好的效率(即杂交)，或者一些更好地工作。对于给定的基因座的每组引物可基于引物的序列环境和模板DNA、缓冲条件和其他条件而表现不同。用于多路的测定系统的通用DNA扩增将通常地引入较少的偏倚和变化性。
因此，在优选的方面，进行多路混合反应中的少的循环数(例如1-10、优选地3-5)的选择性扩增或核酸富集，随后利用引入的通用引发位点的通用扩增。使用通用引物的循环数将是变化的，但将优选地为至少10个循环、更优选地至少5个循环，甚至更优选地20个循环或更多。一个或几个选择性扩增循环之后，通过移至通用扩增，某些基因座以比其它的更大的速率扩增的偏倚被减少。
任选地，测定系统将包括选择性扩增和通用扩增之间的步骤以移除在选择性扩增中非特异地扩增的任何多余的核酸。
来自选择性扩增的整个产物或产物的等份可被用于通用扩增。在扩增步骤中可使用相同或不同的条件(例如，聚合酶、缓冲液等)以例如确保偏倚和变化性不因为实验条件而被非故意地引入。另外，引物浓度的变化可被用来有效地限制序列特异扩增的循环数。
在某些方面，在测定系统中使用的引物或适体的通用引物区域被设计为与利用一般的引发机制的常规多路测定方法相容，以在一个容器中的一个反应中同时地分析大量的核酸。此类“通用的”引发方法允许存在于来自卵子供体妊娠的母体样品中的核酸区域的数量的有效、高容量分析，并且允许在用于确定非整倍性的此类母体样品内核酸区域的存在的综合定量。
此类测定方法的实例包括但不局限于用来同时地扩增和/或基因分型多个样品的多路方法，诸如在Oliphant等人，美国专利号7,582,420中描述的那些，通过引用将其并入本文。
一些方面利用用于核酸序列的多路检测的偶联反应，其中来自每个过程的早期阶段的寡核苷酸包含可被来自过程的晚期阶段的寡核苷酸使用的序列。可单独或组合使用用于扩增和/或检测样品中的核酸的示例性过程，所述示例性过程包括但不局限于以下描述的方法，通过引用将其每个的全部并入本文，为了教导可在本发明的测定系统中使用的多种要素的目的。
在某些方面，本发明的测定系统使用以下组合的选择性和通用扩增技术中的一种：(1)偶联至PCR的LDR；(2)偶联至第二PCR的第一PCR，所述第二PCR被偶联至LDR；和(3)偶联至第二PCR的第一PCR。本发明的这些方面的每个在检测某些核酸特征方面具有特别的应用。但是，每个要求利用用于核酸序列差异的多路检测的偶联反应，其中来自每个过程的早期阶段的寡核苷酸含有可被来自过程的晚期阶段的寡核苷酸使用的序列。
Barany等人，美国专利号6,852,487、6,797,470、6,576,453、6,534,293、6,506,594、6,312,892、6,268,148、6,054,564、6,027,889、5,830,711、5,494,810描述了连接酶链式反应(LCR)测定用于检测多个核酸样品中的核苷酸的特定序列的用途。
Barany等人，美国专利号7,807,431、7,455,965、7,429,453、7,364,858、7,358,048、7,332,285、7,320,865、7,312,039、7,244,831、7,198,894、7,166,434、7,097,980、7,083,917、7,014,994、6,949,370、6,852,487、6,797,470、6,576,453、6,534,293、6,506,594、6,312,892和6,268,148描述了与聚合酶链式反应(“PCR”)偶联的带有检测反应的连接酶检测反应(“LDR”)用于核酸检测的用途。
Barany等人，美国专利号7,556,924和6,858,412描述了挂锁探针(也称“预环探针(precircle probe)”或“多倒置探针(multi-inversion probes)”)连同偶联的连接酶检测反应(“LDR”)和聚合酶链式反应(“PCR”)用于核酸检测的用途。
Barany等人,美国专利号7,807,431、7,709,201和7,198,814描述了组合的核酸内切酶裂解和连接反应用于核酸序列的检测的用途。
Willis等人，美国专利号7,700,323和6,858,412描述了预环探针在多路核酸扩增、检测和基因分型中的用途。
Ronaghi等人，美国专利号7,622,281描述了用于使用含有独特的引物和条形码的适体来标记和扩增核酸的扩增技术。
除了多种扩增技术之外，很多序列确定方法与本发明的测定系统是相容的。优选地，此类方法包括“下一代”测序方法。用于序列确定的示例性方法包括但不被局限于包含但不局限于基于杂交的方法，诸如在Drmanac,美国专利号6,864,052、6,309,824和6,401,267，以及Drmanac等人，美国专利公布2005/0191656中公开的，通过引用将其并入本文；通过合成测序方法，例如，Nyren等人，美国专利号7,648,824、7,459,311和6,210,891，Balasubramanian，美国专利号7,232,656和6,833,246，Quake，美国专利号6,911,345，Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,100:414-419(2003)；如在Ronaghi等人，美国专利号7,648,824、7,459,311、6,828,100和6,210,891中描述的焦磷酸测序；以及基于连接的测序确定方法，例如Drmanac等人，美国专利申请号20100105052，和Church等人，美国专利申请号20070207482和20090018024。
可选地，可利用杂交技术选择和/或鉴定感兴趣的核酸区域。用于进行用于检测的多核苷酸杂交测定的方法在本领域已被充分开发。杂交测定过程和条件将根据应用而不同并且依照已知的一般结合方法而被选择，所述一般结合方法包括在以下中提及的那些：Maniatis等人Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第二版Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)；Berger和Kimmel Methods in Enzymology,152卷,Guide to Molecular CloningTechniques(Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.,1987)；Young和Davis,P.N.A.S,80:1194(1983)。在美国专利号5,871,928、5,874,219、6,045,996和6,386,749、6,391,623中已描述了用于进行重复和控制的杂交反应的方法和设备。
在某些优选的方面本发明还涵盖了配体之间的杂交的信号检测。参见，美国专利号5,143,854、5,578,832、5,631,734、5,834,758、5,936,324、5,981,956、6,025,601、6,141,096、6,185,030、6,201,639、6,218,803和6,225,625，在美国专利申请60/364,731中以及在PCT申请PCT/US99/06097(作为WO99/47964公布)中。
例如在美国专利号5,143,854、5,547,839、5,578,832、5,631,734、5,800,992、5,834,758；5,856,092、5,902,723、5,936,324、5,981,956、6,025,601、6,090,555、6,141,096、6,185,030、6,201,639；6,218,803；和6,225,625中，在美国专利申请60/364,731中和在PCT申请PCT/US99/06097(作为WO99/47964公布)中公开了用于强度数据的信号检测和处理的方法和设备。
标志在本发明的测定系统中的使用
在某些方面，利用描述的技术例如序列确定或杂交来直接地检测感兴趣的核酸的全部或部分。但是，在某些方面，感兴趣的核酸与鉴定选择的核酸区域或正被分析的特定样品的一个或更多个标志有关。一个或更多个标志的检测可作为选择的核酸区域的替代检测机制，或如果标志的序列和核酸区域自身的序列两者均被确定则作为特定的选择的核酸区域的存在的确认。在使用含有标志和与核酸区域特异地杂交的序列区域两者的引物的扩增步骤期间，这些标志优选地与选择的核酸有关。
在一个实例中，用于核酸区域的选择性扩增的引物被设计为在与感兴趣的基因座互补的区域和通用扩增引发位点之间提供基因座标志。基因座标志对于每个选择的核酸区域是独特的并代表感兴趣的染色体或参考染色体上的基因座，以使得样品中基因座标志的定量提供基因座和含有基因座的特定染色体的定量数据。
在另一个实例中，用于选择的核酸区域的扩增的引物被设计为在与感兴趣的基因座互补的区域和通用扩增引发位点之间提供等位基因标志。所述等位基因标志对于选择的核酸区域的特定等位基因是独特的并代表感兴趣的染色体或参考染色体上存在的基因座变化，以使得样品中等位基因标志的定量提供等位基因的定量数据，并且针对特定基因座的等位基因标志的相对频率提供该基因座和含有该基因座的特定染色体两者的定量数据。
在另一个方面，用于来自卵子供体妊娠的母体样品的待分析的选择的核酸区域的扩增的引物被设计为在与感兴趣的基因座互补的区域和通用扩增引发位点之间提供鉴定标志。在此方面，展示足够数量的鉴定标志以独特地鉴定样品中的每个选择的核酸区域。待分析的每个核酸区域与独特的鉴定标志相关，以使得鉴定位点独特地与选择的核酸区域相关。样品中鉴定标志的定量提供相关的选择的核酸区域和与选择的核酸区域相应的染色体的定量数据。鉴定标志还可被用来检测在来自样品的选择的核酸区域的初始分离的下游出现的任何扩增偏倚。
在某些方面，只有基因座标志和/或鉴定标志(如果存在)被检测并被用来定量样品中的选择的核酸区域。在另一个方面，进行每个基因座标志与独特的鉴定标志一起出现的次数的计数来确定样品中选择的核酸区域的相对频率。
在一些方面，代表核酸从其分离的样品的标志被用来鉴定多路测定系统中核酸的来源。在此方面，用样品标志使核酸被独特地鉴定。然后在测序之前，那些被独特地鉴定的寡核苷酸可被汇合入具有来自其它样品的核酸的单个反应容器中。在确定每个样品的每个靶基因座的频率之前，且在确定每个样品是否有染色体异常之前，测序数据首先由每个独特的样品标志分开。对于检测，样品标志、基因座标志和鉴定标志(如果存在)被测序。
在本发明使用标志的方面，优选地设计选择性扩增引物以使得在引物的一端或两端编码含有鉴定信息的标志。可选地，在初始的选择性扩增之后，标志和通用扩增序列可被添加至选择性地扩增的核酸。
标志是在引物内使用的非互补但独特的序列以提供与利用引物分离和/或扩增的选择性核酸区域有关的信息。这的优势是，能获得关于选择的核酸区域的存在和量的信息而不需要确定实际序列自身，尽管在某些方面确定实际序列自身可以是期望的。但是，通常地，由于基因座信息在所分离的选择的核酸区域的3'或5'端被捕获，所以通过鉴定一个或更多个标志来鉴定并定量选择的核酸区域的能力将减少所需的测序的长度。因为较长的测序读取更容易引入或出错，所以标志鉴定作为选择的核酸区域的鉴定的替代的使用还可减少错误。
除了基因座标志、等位基因标志和鉴定标志之外，另外的标志可被引入至引物以助于样品的多路。例如，鉴定实验性错误(例如，在扩增或序列确定期间引入的错误)的修正标志可被用来鉴定测定系统中实验步骤和/或检测方法中的潜在偏差(discrepancies)。这些标志的顺序和布置以及这些标志的长度可变化，并且其可以多种组合的形式被使用。
用于鉴定并定量选择的核酸区域的引物可与和选择的核酸区域的5'互补的区域相关，或在某些扩增方案中标志可存在于含有与选择的核酸区域的序列互补的序列的一组扩增引物中的一个或两者上。引物可被用来多路样品内待分析的多个选择的核酸区域的分析，并且可在溶液中或在固体基质上例如在微阵列上或在珠上被使用。这些引物可被用于线性复制或扩增，或其可生成环状结构用于进一步分析。
样品内和样品间的变化最小化
检测来自卵子供体妊娠的母体样品中的染色体异常的一个挑战是，经常来自具有假定的染色体异常的细胞类型的DNA以比来自正常细胞类型的DNA低得多的丰度存在。在含有胎儿和母体的无细胞DNA的混合母体样品的情况下，作为总的无细胞DNA的百分比的无细胞胎儿DNA可从小于百分之一到百分之四十变化，并且最通常地以百分之二十或小于百分之二十并且经常地以百分之十或小于百分之十存在。在检测此类混合母体样品的胎儿DNA中的诸如21三体综合征(唐氏综合征)的非整倍性中，胎儿DNA中染色体21的相对增加是50％，并且因此作为母体样品中总DNA的百分比，例如其中胎儿DNA为总DNA的5％，染色体21作为总的百分比的增加为2.5％。如果某人将通过本文描述的方法稳健地检测该区别，染色体21的测量中的变化必须比染色体21的增加百分比小的多。
在分析方法的组合中，在样品间和/或针对样品内的核酸区域发现的水平间的变化可被最小化，本申请中描述了很多所述分析方法。例如，通过在测定中使用内部参考，变化被减少。内部参考的实例是利用以“正常”丰度(例如，常染色体的二体性)存在的染色体与相同样品中的以假定异常的丰度诸如非整倍性存在的染色体比较。虽然使用一个此类“正常”染色体作为参考染色体可以是足够的，但是还可能使用很多正常染色体作为内部参考染色体以增加定量的统计功效。
使用内部参考的一个方法是计算样品中的假定异常的染色体的丰度与正常染色体的丰度的比率，称为染色体比率。在计算染色体比率时，对于每个染色体每个核酸区域的丰度或计数被定量以计算每个染色体的总计数。然后一个染色体的总计数除以不同的染色体的总计数以生成那两个染色体的染色体比率。
可选地，每个染色体的染色体比率可通过首先对每个染色体定量每个核酸区域的相对频率(例如求和)，并且然后将一个染色体的相对频率与两个或更多个染色体的相对频率比较(例如，一个染色体的和除以两个或更多个染色体的总和)。计算后，然后将染色体比率与来自正常群体的平均染色体比率比较。
平均值可以是带有或不带有归一化和离群数据的排除的平均值(mean)、中值、众数或其它平均数(average)。在优选的方面，使用平均值。在从正常群体建立染色体比率的数据集时，计算测量的染色体的标准变化。该变化可以很多方式表示，最通常地为变异系数，或CV。当来自样品的染色体比率与来自正常群体的平均染色体比率比较时，如果样品的染色体比率统计上落在正常群体的平均染色体比率之外，则样品含有非整倍性。用于设定表明非整倍性的统计阈值的标准取决于在染色体的测量上的变化以及对于期望的测定的可接受的假阳性和假阴性。通常，该阈值可以是在染色体比率中观察到的多倍的变化。在一个实例中，该阈值为染色体比率的变化的三倍或更多倍。在另一个实例中，其为染色体比率的变化的四倍或更多倍。在另一个实例中，其为染色体比率的变化的五倍或更多倍。在另一个实例中，其为染色体比率的变化的六倍或更多倍。在以上实例中，通过确定每染色体的核酸区域的相对频率(例如通过对计数求和)来估计染色体比率。通常地，对每个染色体使用相同数目的核酸区域。用于生成染色体比率的可选方法将是计算每个染色体的核酸区域的平均相对频率。虽然通常地使用平均数，但是平均数可以是平均值、中值或众数的任何估算。平均数可以是所有的相对频率的平均值或一些变化诸如微调的或加权的平均数。已计算每个染色体的平均相对频率之后，每个染色体的平均相对频率可与其它染色体比较以获得两个染色体之间的染色体比率，每个染色体的平均相对频率可与所有测量的染色体的相对频率比较以获得如以上描述的每个染色体的染色体比率。如以上强调的，在测定中，检测来自卵子供体妊娠的母体样品中的非整倍性的能力极大地取决于不同的核酸区域的测量中的变化，在所述母体样品中假定的DNA是以低的相对丰度。很多分析方法可被使用，所述很多分析方法减少该变化并且因此提高该方法检测非整倍性的灵敏度。
用于减少测定的变化性的一种方法是增加用来计算染色体的丰度的核酸区域的数目。通常地，如果染色体的单个核酸区域的测量的变化为X％并且在相同的染色体上测量Y个不同的核酸区域，则通过对该染色体上的每个核酸区域的丰度求和或求平均值来计算的染色体丰度的测量变化将大约为X％除以Y1/2。换句话说，染色体丰度的测量变化将大约为每个核酸区域的丰度的测量的平均变化除以核酸区域的数目的平方根。
在本发明优选的方面，对于每个染色体测量的核酸区域的数目为至少24。在本发明另一个优选的方面，对于每个染色体测量的核酸区域的数目为至少48。在本发明另一个优选的方面，对于每个染色体测量的核酸区域的数目为至少100。在本发明另一个优选的方面，对于每个染色体测量的核酸区域的数目为至少200。测量每个核酸区域有增加的成本并且因此使每个核酸区域的数目最小化是重要的。在本发明优选的方面，对于每个染色体测量的核酸区域的数目为少于2000。在本发明优选的方面，对于每个染色体测量的核酸区域的数目为少于1000。在本发明最优选的方面，对于每个染色体测量的核酸区域的数目为至少48且少于1000。在一个方面，测量每个核酸区域的丰度之后，核酸区域的子集可被用来确定非整倍性的存在或不存在。存在用于选择核酸区域的子集的很多标准方法。这些方法包括离群值排除，其中具有低于和/或高于某个百分位数的检测水平的核酸区域被从分析丢弃。在一个方面，百分位数可以是最低和最高的5％，如通过丰度测量的。在另一个方面，百分位数可以是最低和最高的10％，如通过丰度测量的。在另一个方面，百分位数可以是最低和最高的25％，如通过丰度测量的。
用于选择核酸区域的子集的另一种方法包括除去落在一些统计限值之外的区域。例如，落在平均丰度的一个或更多个标准偏差之外的区域可被从分析移除。用于选择核酸区域的子集的另一种方法可以是将核酸区域的相对丰度与健康群体中相同的核酸区域的预计丰度比较，并丢弃期望值测试不合格的任何核酸区域。为了进一步使测定中的变化最小化，可增加每个核酸区域被测量的次数。如所讨论的，与其中基因组被测量平均少于一次的检测非整倍性的随机方法相对，本发明的测定系统有意地测量每个核酸区域多次。通常地，在计数事件时，通过泊松统计来确定计数中的变化，并且计数变化通常地等于一除以计数的数字的平方根。在本发明优选的方面，核酸区域各自被测量平均至少100次。在本发明优选的方面，核酸区域各自被测量平均至少500次。在本发明优选的方面，核酸区域各自被测量平均至少1000次。在本发明优选的方面，核酸区域各自被测量平均至少2000次。在本发明优选的方面，核酸区域各自被测量平均至少5000次。
在另一个方面，在确定染色体异常是否存在时，利用足够的数目，基因座的子集能被随机地选择以获得统计上显著的结果。在母体样品内可进行基因座的不同子集的多重分析以获得更大的统计功效。在该实例中，在随机分析之前，可需要或可不需要移除或消除任何的基因座。例如，如果对于染色体21有100个选择的区域且对于染色体18有100个选择的区域，则对染色体中的每一个可进行评价少于100个区域的一系列分析。
除了用于减小测定中的变化的以上方法之外，其它的分析技术可被组合使用，在该申请中所述其它的分析技术中的很多在前面被描述。通常，当每个样品的所有核酸区域在单个容器中的单个反应中被询问时，测定中的变化可被减少。相似地，当使用通用扩增系统时，测定中的变化可被减少。而且，当扩增的循环数是有限的时，测定的变化可被减少。
使用胎儿无细胞DNA百分比以优化非整倍性检测
胎儿无细胞DNA百分比已被计算之后，该数据可与用于非整倍性检测的方法组合以确定母体样品可含有非整倍性的可能性。在一方面，使用利用随机DNA区段的分析的非整倍性检测方法，所述非整倍性检测方法诸如在例如Quake,美国专利申请号11/701,686；Shoemaker等人，美国专利申请号12/230,628中描述的。在优选的方面，使用利用选择的核酸区域的分析的非整倍性检测方法。在该方面，计算样品的胎儿无细胞DNA百分比。该样品的染色体比率、正常群体的染色体比率和正常群体的染色体比率的变化被确定，如本文描述的。
在一个优选的方面，从具有相似的胎儿DNA百分比的正常样品确定正常群体的染色体比率及其变化。通过加入来自非整倍性染色体的贡献百分比来计算具有该胎儿无细胞DNA百分比的DNA样品的预计的非整倍性染色体比率。然后可将样品的染色体比率与正常群体的染色体比率以及与预计的非整倍性染色体比率比较，以利用染色体比率的变化来统计地确定，来确定是否样品更可能是正常的或非整倍性，以及其是一个或另一个的统计可能性。
在优选的方面，来自卵子供体妊娠的母体样品的选择的区域包括用于确定胎儿DNA含量的区域以及来自两个或更多个染色体的非多态的区域两者以在单个反应中检测胎儿染色体异常。当利用胎儿DNA含量以助于确定染色体异常的存在或不存在时，单个反应有助于使在测定系统中的多个步骤期间可能被引入的污染或偏倚的风险最小化，所述污染或偏倚否则可使结果出现偏差。
在其它的方面，可利用一个或多个选择的区域用于确定胎儿DNA含量以及检测胎儿染色体异常两者。选择的区域的等位基因可被用来确定胎儿DNA含量，并且然后这些相同的选择的区域可被用来检测胎儿染色体异常，忽略等位基因信息。对于胎儿DNA含量和检测染色体异常两者利用相同的区域还可助于使由实验性错误或污染造成的任何偏倚最小化。
在某些方面，胎儿无细胞DNA百分比可在胎儿非整倍性的存在或不存在的确定中被用作质量控制工具。确定卵子供体妊娠中母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比可提供用于确定可对样品进行什么(如果有的话)另外的分析的机制。在一些母体材料中，样品中的胎儿无细胞DNA的水平是低的，并且在一些实例中可以如此低以致某些分析不能在样品上可靠地进行，诸如确定胎儿非整倍性的存在或不存在的分析。
在胎儿非整倍性中，诸如在21三体综合征的情况中，胎儿DNA中的染色体21与二体性21相比相对增加50％。作为母体样品中的总DNA的百分比，其中例如胎儿DNA为样品中的总DNA的5％，染色体21的增加作为总的百分比为2.5％。因为样品中的胎儿无细胞DNA百分比的水平变得较低，所以染色体21作为样品中的总DNA的百分比的增加减小并且可能难以检测到。为了保证胎儿非整倍性的存在或不存在的精确确定，胎儿无细胞DNA百分比的阈值水平可被用作质量控制工具。“阈值水平”为对于对样品的另外的分析的表现被认为是可接受的胎儿无细胞DNA的最小水平，例如只有具有为阈值水平或高于阈值水平的胎儿无细胞DNA水平的来自卵子供体妊娠的母体样品被用于确定胎儿非整倍性的存在或不存在。阈值水平可以是在确定胎儿百分比之前设定的预定水平，或可在测试表现的分析和/或关于胎儿异常所需的测试的另外的分析之后设定。
在来自卵子供体妊娠的母体样品的分析中阈值水平使用提供保证样品分析的质量和可靠性的标准。在某些特定的实例中，可在能被证实包含在阈值水平或高于阈值水平的胎儿无细胞DNA的样品中确定胎儿非整倍性的存在或不存在的可能性。
在某些方面，可在确定胎儿非整倍性的存在或不存在之前进行母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比的计算。在这些方面，如果胎儿无细胞DNA百分比不满足阈值，可做出决定：样品不应被提交用于另外的分析。可选地，可对样品进行进一步的分析，但是结果可不被使用或可被描述为不可靠的。在某些方面，可与确定胎儿非整倍性的存在或不存在同时地进行母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比的计算。在这些方面，如果样品中的胎儿无细胞DNA低于阈值，胎儿非整倍性的存在或不存在的确定可不被使用或可被描述为不可靠的。
在某些方面，母体样品中的胎儿无细胞DNA的阈值水平可在1％和5％胎儿无细胞DNA之间，诸如在1.5％和4.5％胎儿无细胞DNA之间，或更特别地在2％和4％胎儿无细胞DNA之间。在某些特定的方面，胎儿无细胞DNA百分比的阈值水平可以是1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％或5.0％胎儿无细胞DNA，或其中包含的任何中间的数字。
遗传突变的检测
在某些方面，本发明的测定系统检测感兴趣的特定基因座中的胎儿非整倍性和其它遗传改变(包括染色体异常)两者。此类另外的遗传改变包括但不局限于缺失突变、插入突变、拷贝数多态性、拷贝数变化、染色体22q11缺失综合征、染色体11上的11q缺失综合征、染色体8上的8p缺失综合征等。通常地，分析存在于相同或不同的染色体上的至少两个靶核酸序列，并且靶序列中的至少一个与胎儿等位基因异常有关。然后比较两个靶序列的序列和两个靶序列的拷贝数以确定染色体异常是否存在，并且如果是，确定该异常的性质。
虽然本文包含的很多说明描述了通过计数一个或更多个假定的非整倍性染色体上的核酸区域的丰度和一个或更多个正常染色体上的核酸区域的丰度来检测非整倍性，但是相同的技术可被用来检测拷贝数变化，其中此类拷贝数变化只在一部分的染色体上出现。在拷贝数变化的该检测中，将假定的拷贝数变化位置内的多个核酸区域与假定的拷贝数变化位置之外的多个核酸区域比较。然后对于非整倍性描述的本发明的其它方面可被用于检测拷贝数变化。例如，人们可通过选择22q11缺失内的两个或更多个核酸区域以及22q11缺失之外的两个或更多个核酸区域来在混合母体样品中检测胎儿中的染色体22q11缺失综合征。22q11缺失之外的核酸区域可在染色体22的另一个区域上或可在完全地不同的染色体上。通过本申请中描述的方法来确定每个核酸区域的丰度。
然后定量缺失内的核酸区域以确定相对频率，缺失之外的核酸区域也一样。然后将这些相对频率相互比较以确定缺失的存在或不存在。任选地，将相对频率表达为比率并且可将该比例与从正常群体生成的平均比率比较。当样品的比率统计地落在预期的比率之外时，检测到缺失。用于检测缺失的阈值可为在正常群体中计算的变化的四倍或更多倍。
其它胎儿检测方法的使用
在本发明的某些方面，本发明的方法可连同其它已知风险因素(例如，母体年龄、家族史、母体或亲本遗传信息)的检测和/或用于检测胎儿异常的方法，并且优选地连同胎儿异常的其它相对地无损诊断机制(例如，测量母体样品中的一个或更多个生物标志物和/或从超声波扫描测量或结构检测)使用。这些风险因素和诊断机制与本发明的方法的组合使用可提供胎儿异常的改良的风险确定，并且特别是诸如三体性的已知的遗传突变的存在或不存在。
因此，在一些优选的方面，将在本发明的测定系统中获得的结果与来自风险因素的生物化学检测、风险因素的超声波检测、或胎儿异常的其它风险决定因素的结果组合。
在一些特定的方面，将在本发明的测定系统中获得的结果与和增加的胎儿异常风险有关的生物化学标志物的检测组合。生物化学标志物可基于含有母体血液、血清、血浆或尿的样品来确定。此类生物化学标志物包括但不局限于游离βhCG、妊娠相关血清蛋白A(PAPP-A)、母体血液α-胎蛋白、母体血液hCG、母体血液未轭合雌三醇、母体血液二聚抑制素A、母体尿总雌三醇、母体尿β核心片段、母体尿高糖基化hCG、母体血液高糖基化hCG和抑制素A(优选地二聚抑制素A)。在一些方面，另外的评价机制是多标志物分析，诸如在Orlandi等人，美国专利号7,315,787或Wald等人美国专利号6,573,103中描述的。这些和其它标志物的存在和/或水平的检测可与来自本发明的测定系统的结果组合，以为患者提供最终结果。
在其它特定的方面，将在本发明的测定系统中获得的结果与从超声波成像获得的结果组合，从超声波成像获得的结果包括但不局限于：颈半透明度(NT)厚度或水肿、颈褶皱厚度、静脉系统(包括静脉导管、门静脉和肝静脉以及下腔静脉)的异常、缺失或发育不全的鼻骨、股骨长度、肱骨长度、肠管强回声、肾肾盂扩张、心脏中的回声焦点、胎儿心率、和某些心脏异常。在特定的方面，胎儿异常的另外的评价通过形状分析来进行，诸如在美国专利号7,780,600和7,244,233中描述的。在特定的方面，另外的评价是基于解剖学标志(landmark)的确定，所述解剖学标志的确定基于成像，诸如在美国专利号7,343,190中描述的。这些和其它物理参数的检测可与来自本发明的测定系统的结果组合，以为患者提供最终结果。
已知大多数筛选标志物和物理特征随孕龄变化。为了考虑该变化，每个标志物水平可被表示为相同孕龄的自然妊娠的中位水平(MoM)的倍数。特别地，对于源自超声波扫描的标志物，顶臀长度(CRL)或双顶径(BPD)测量是孕龄的替代量度。可以已知的方式调整MoM以考虑已知影响标志物水平的因素，诸如母体重、种族、糖尿病状态和怀有胎儿的数目。
可在妊娠的单个阶段进行以上技术的使用或在妊娠的两个或更多个不同的阶段顺序地获得以上技术的使用。还可与母体变量诸如母体年龄、重量、种族等组合来解释这些标志物水平以得出风险估计。利用标准统计技术进行风险估计。例如，在Wald NJ等人,BMJ(1992)；305(6850):391-4；Wald N J等人(1988)BMJ 297:883-887中以及在Royston P,Thompson S GStat Med.(1992)11(2):257-68中描述了已知方法。
来自卵子供体妊娠的母体样品中的其它因子(agent)或风险因素的检测
考虑到本发明的测定系统的多路的性质，在某些方面利用所述测定检测能对受试者的健康构成风险或以其他方式影响关于受试者的治疗或预后结果的临床决定的其它的核酸可以是有益的。此类核酸可包含但不局限于疾病或风险的指示物，诸如已知对母体或胎儿健康展示风险的母体等位基因、多态性或体细胞突变。此类指示物包括但不局限于与Rh状态有关的基因；与诸如糖尿病、高血脂、高胆固醇血、诸如镰状细胞性贫血、血友病或地中海贫血的血液紊乱、心脏的状况等的疾病有关的突变或多态性；与活动性或潜伏性感染有关的外源核酸；与自身免疫性紊乱或恶性肿瘤(例如，乳腺癌)有关的体细胞突变或拷贝数变化；或可影响受试者，并且特别是影响临床选择的任何其它健康问题，基于测定结果的成果在治疗和/或预防受试者中的健康风险中所述临床选择是可得的。
因此，由于本发明的优选的测定系统是高度地多路的并且可询问母体样品中的数百或甚至数千的核酸，所以在某些方面，需要针对母体样品内的核酸标志物询问样品，例如与遗传风险有关或鉴定传染性有机体的存在或不存在的核酸。因此，在某方面，测定系统提供此类核酸的检测连同用于母体样品内的拷贝数确定的核酸的检测。
例如，在来自卵子供体妊娠的某些母体样品、来自具有自身免疫性疾病的受试者的样品、和来自经历化学疗法的患者的样品中，由于受试者的免疫系统中的改变，所以受试者的免疫抑制可增加疾病的风险。检测母体样品中的外源性因子可指示暴露至致病因子(infectious agent)并被致病因子感染，并且该发现对患者护理或传染性疾病的管理具有影响，针对所述传染性疾病受试者对此类致病因子测试阳性。
特别地，妊娠期间在免疫和生理上的变化可使妊娠妇女更容易受到或更严重地被传染性疾病影响。事实上，对于获得诸如弓形体病、汉森氏病和李氏杆菌病的某些传染性疾病，妊娠自身可以是风险因素。另外，对于妊娠妇女或具有受抑制的免疫系统的受试者，诸如流行性感冒和水痘的某些传染性疾病可具有更严重的临床过程、增加的并发症率和更高的病死率。因此鉴定传染性病原可允许在妊娠期间更好的治疗母体疾病，导致对于母体和胎儿两者更好的总体结果。
另外，某些致病因子可通过垂直传递被传递至胎儿，即传染病从母体传播至婴儿。当胎儿还在子宫中时、在阵痛和分娩期间、或在分娩后(诸如在母乳哺育时)，这些感染可发生。
因此，在一些优选的方面，测定系统可包括检测外源性序列例如，来自可对胎儿或婴儿的健康和/或生存能力具有不利影响的传染性有机体的序列以保护母体、胎儿和/或婴儿健康。
能经由垂直传递传播，并且能利用本发明的测定方法测试的示例性感染包括但不局限于先天性感染、围产期感染和产后感染。
先天性感染通过穿过胎盘以传染胎儿来在子宫内传递。很多传染性微生物能引起先天性感染，导致胎儿发育的问题或甚至死亡。TORCH是几种更普遍的先天性感染的首字母缩略词。这些是：弓形体病、其他感染(例如，梅毒、乙型肝炎病毒、柯萨奇病毒、Epstein-Barr病毒、水痘-带状疱疹病毒(水痘)、和人类细小病毒B19(第五病))、风疹、巨细胞病毒(CMV)和单纯性疱疹病毒。
围产期感染指由于婴儿在分娩期间移动通过被感染的产道或通过具有粪便物的污染物而出现的感染。这些感染可包括但不局限于性传播疾病(例如，淋病、衣原体、单纯性疱疹病毒、人乳头状瘤病毒等)、CMV、和B族链球菌(GBS)。
分娩后从母本传播至婴儿的感染被称为产后感染。这些感染可在母乳哺育期间通过见于母本的母乳中的传染性微生物传播。产后感染的一些实例为CMV、人体免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)和GBS。
实施例
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供如何进行和利用本发明的完整的公开内容和说明，并且不意图限制发明人视为其发明的内容的范围，也不意图表示或暗示以下实验是进行的全部实验或仅有的实验。本领域技术人员将领会，可对本发明进行很多变化和/或修饰，如在特别的方面显示的，而不偏离如广泛地描述的本发明的精神或范围。因此本方面将被认为在所有的方面为例证性的且非限制性的。
在以下实施例中证明了利用本发明的方法鉴定胎儿贡献百分比的效率和精确度，其中在24个个体的组中，方法准确地确定了混合样品中每个个体的贡献百分比。
实施例1：受试者和样品
在提供对由机构审查委员会批准的方案的知情同意后，受试者被预期地登记。受试者被要求年龄至少18岁。由16个个体组成的登记的受试者的子集被选择包含在该研究中，所述16个个体由来自第一种族群体的8个个体和来自第二种族群体的8个个体组成。为了模拟其中母体样品包含来自不共用另一个的大约一半的遗传信息的两个不同的个体的DNA的来自卵子供体妊娠的混合样品，混合样品被制备为包含从来自第一种族群体的一个个体和来自第二种族群体的一个个体得来的血浆。为了个体的各配对，以从来自第一种族群体的个体得来的血浆的100％、95％、90％、85％、15％、10％、5％和0％的体积比例来混合样品。
实施例2：分析多态的基因座以评价不相关个体的贡献百分比
为了评价混合样品中每个个体的贡献百分比，针对染色体1至12上的一组192个含SNP的基因座设计测定，其中一个碱基不同的两个中间寡核苷酸被用来询问每个SNP。在HapMap 3数据集中针对次要等位基因频率优化SNP。Duan,等人,Bioinformation,3(3):139-41(2008)；Epub 2008Nov9。
通过IDT(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA)来合成寡核苷酸并且汇集在一起以生成单个多路的测定池。从每个混合样品生成测定产物并且来自混合样品的产物被汇集并被用作用于TruSeq v2流动滑块(flowslide)(Illumina,San Diego,CA)的单个道上的簇扩增的模板。滑块在Illumina HiSeq 2000上处理以生成平均1.18M的原始测序读取/样品。平均1.15M的读取具有少于3个的有预期的测定结构的错配，导致平均854个读取/基因座/样品。
提供信息的多态的基因座被限定为其中混合样品的第一个体的至少一个等位基因与混合样品的第二个体的等位基因不同的基因座。因为测定表现出等位基因特异性超过99％，所以当具有较低比例的个体的基因座的等位基因比例被测量为在1％和20％之间时，卵子供体提供信息的基因座容易被鉴定。为了比较的目的，两组卵子供体提供信息的基因座被用来分析混合样品的测定。本文中被称为‘贡献百分比非相同的、纯合、不包含的’组的第一基因座组中，二项式模型被用来从考虑中移除测定的至少重要的部分，在所述第一组基因座中来自第一个体的等位基因是纯合的并且来自第二个体的等位基因是纯合的，但是来自第一个体的等位基因与第二个体的等位基因不同。本文中被称作‘贡献百分比非相同的、纯合、包含的’组的第二基因座组中，卵子供体提供信息的基因座未被从测定池移除。对于两个基因座组，诸如在共同待审的申请61/509,188中描述的，利用二项分布来估计最大可能性，以基于从几个卵子供体提供信息的基因座的测量来确定最可能的胎儿比例。结果与由Chu和合作者(参见,Chu,等人,Prenat.Diagn.,30:1226-29(2010))提出的加权平均法良好地相关(R2>0.99)。
实施例3：结果
图3为对于贡献百分比非相同的、纯合、包含的组和贡献百分比非相同的、纯合、不包含的组，贡献百分比估计比较的图。由于检测到另外的多态的等位基因的存在，所以预期贡献百分比非相同的、纯合、包含的组会比贡献百分比非相同的、纯合、不包含的组估计更高的贡献百分比估计。以低于方法的可检测的限值(大约3.5％)的样品的例外，贡献百分比非相同的、纯合、不包含的组的分析显示出比贡献百分比非相同的、纯合、包含的组较低的胎儿比例估计。
实施例4：性能验证受试者和样品
在提供对由机构审查委员会批准的方案的知情同意后，受试者被预期地登记。受试者被要求年龄至少18岁。由8个个体组成的登记的受试者的子集被选择包含在该研究中，所述8个个体由4个女性和4个男性组成。为了模拟来自其中胎儿为男性的卵子供体妊娠的混合样品，混合样品被制备为包含来自一个女性和一个男性的血浆。为了各女性-男性配对，以来自女性的血浆的100％、95％、90％、85％、15％、10％、5％和0％的体积比例来混合样品。
实施例5：多态的基因座的性能验证分析以评价不相关个体的贡献百分比
为了评价混合样品中每个个体的贡献百分比，针对染色体1至12上的一组192个含SNP的基因座设计测定，其中一个碱基不同的两个中间寡核苷酸被用来询问每个SNP。在HapMap 3数据集中针对次要等位基因频率优化SNP。Duan,等人,Bioinformation,3(3):139-41(2008)；Epub 2008Nov9。
通过IDT(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA)来合成寡核苷酸并且汇集在一起以生成单个多路的测定池。从每个混合样品生成测定产物并且来自8个混合样品的产物被汇集并被用作用于TruSeq v2流动滑块(Illumina,San Diego,CA)的单个道上的簇扩增的模板。滑块在IlluminaHiSeq 2000上处理以生成平均1.18M的原始测序读取/样品。平均1.15M的读取具有少于3个的有预期的测定结构的错配，导致平均854个读取/基因座/样品。
提供信息的多态的基因座被限定为其中混合样品的第一个体的至少一个等位基因与混合样品的第二个体的等位基因不同的基因座。因为测定表现出等位基因特异性超过99％，所以当具有较低比例的个体的基因座的等位基因比例被测量为在1％和20％之间时，卵子供体提供信息的基因座容易被鉴定。为了比较的目的，两组卵子供体提供信息的基因座被用来分析混合样品的测定。本文中被称为胎儿比例相关组的第一基因座组中，二项功能被用来从考虑中移除测定，在所述第一组基因座中来自第一个体的等位基因是纯合的并且来自第二个体的等位基因是纯合的，但是来自第一个体的等位基因与第二个体的等位基因不同。本文中被称作胎儿比例不相关组的第二基因座组中，卵子供体提供信息的基因座未被从测定池移除。对于两个基因座组，诸如在共同待审的申请61/509,188中描述的，利用二项分布来估计最大可能性，以基于从几个卵子供体提供信息的基因座的测量来确定最可能的胎儿比例。结果与由Chu和合作者(参见,Chu,等人,Prenat.Diagn.,30:1226-29(2010))提出的加权平均法良好地相关(R2>0.99)。
实施例6：性染色体上的基因座的性能验证分析以评价不相关个体的贡献百分比
为了利用多态的基因座验证贡献百分比的估计，通过混合样品中的每个个体的性染色体上的基因座的分析来估计贡献百分比，并且比较两种估计的结果。测定被设计为一组，8个测定被设计在性染色体上，并且其它的测定被设计在染色体13、18和21上。
通过IDT(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA)来合成寡核苷酸并且汇集在一起以生成单个多路的测定池。从每个混合样品生成测定产物并且来自混合样品的产物被汇集并被用作用于TruSeq v2流动滑块(Illumina,San Diego,CA)上的单个道上的簇扩增的模板。滑块在IlluminaHiSeq 2000上处理以生成平均1.18M的原始测序读取/样品。平均1.15M的读取具有少于3个的有预期的测定结构的错配，导致平均854个读取/基因座/样品。
利用Y测定的中位数计数与染色体13、18和21上的测定的中位数计数的比来估计使用Y的未归一化的贡献百分比(FPY)。
因为使用Y的贡献百分比是未归一化的，所以预计利用多态的测定的估计的贡献百分比会强烈地相关，但是会不相同。
实施例7：性能验证结果
图4A-4C是对于含有来自女性的75％、80％、85％、90％和95％血浆的混合样品，比较利用多态的测定和性染色体测定两者估计的贡献百分比的柱形图。在这些情况中的每一种，虽然对每个混合样品的估计是不相同的，但是在利用多态的测定的贡献百分比估计和利用性染色体测定的估计之间有强的相关性。
虽然本发明由以很多不同形式的方面满足，如结合本发明优选的方面详细的描述的，但是应理解本公开内容应被视为是本发明的原则的示范且不意图将本发明限制为本文例证和描述的特定方面。本领域技术人员可做出很多变化而不偏离本发明的精神。本发明的范围将通过所附的权利要求和其等价物来判断。摘要和题目不被理解为限制本发明的范围，因为它们的目的是使有关当局以及公众能够快速地确定本发明的一般性质。在以下的权利要求中，除非使用术语“方法”，否则本文提及的特征或要素不应根据35 U.S.C.§112,被理解为功能限定方法的限制。

Claims (44)

1.一种用于确定来自具有卵子供体妊娠的妊娠女性的母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比的方法，所述方法包括：
提供含有母体无细胞DNA和胎儿无细胞DNA的母体样品；
询问两个或更多个选择的多态的核酸区域；
检测所述询问的核酸区域；
确定所述询问的核酸区域中的多态性的相对频率以鉴定卵子供体提供信息的基因座；
利用所述鉴定的卵子供体提供信息的基因座来计算胎儿无细胞DNA百分比。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述卵子供体提供信息的基因座包括其中在至少一个等位基因中所述母体DNA和所述胎儿DNA不同的基因座。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述卵子供体提供信息的基因座包括其中在两个等位基因二者中所述母体DNA和所述胎儿DNA不同的基因座。
4.根据权利要求1所述的方法，其中计算所述胎儿无细胞DNA百分比包括将低频率等位基因的相对频率与高频率等位基因和低频率等位基因两者的相对频率比较。
5.根据权利要求1所述的方法，其中询问两个或更多个选择的多态的核酸区域的步骤包括：
将第一组固定序列寡核苷酸引入所述母体样品，其在允许所述固定的寡核苷酸与第一多态的核酸区域的互补区域特异地杂交的条件下进行；
将第二组固定序列寡核苷酸引入所述母体样品，其在允许所述固定的寡核苷酸与第二多态的核酸区域的互补区域特异地杂交的条件下进行；和
连接杂交的寡核苷酸以生成与所述核酸互补的连续的连接产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述固定序列寡核苷酸包含通用引物区域。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一组固定序列寡核苷酸和所述第二组固定序列寡核苷酸包含相同的通用引物区域。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一组固定序列寡核苷酸包含第一通用引物区域，并且所述第二组固定序列寡核苷酸包含第二通用引物区域。
9.根据权利要求6所述的方法，所述方法还包括利用所述通用引物区域来扩增所述连续的连接产物以生成扩增产物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述扩增包括对连续的连接产物模板进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述母体样品为母体血浆或血清。
12.根据权利要求1所述的方法，其中询问两个或更多个选择的多态的核酸区域包括询问至少十个核酸区域。
13.根据权利要求12所述的方法，其中询问两个或更多个选择的多态的核酸区域包括询问至少二十个核酸区域。
14.根据权利要求13所述的方法，其中询问两个或更多个选择的多态的核酸区域包括询问至少四十个核酸区域。
15.根据权利要求14所述的方法，其中询问两个或更多个选择的多态的核酸区域包括询问至少九十个核酸区域。
16.根据权利要求15所述的方法，其中询问两个或更多个选择的多态的核酸区域包括询问至少300个核酸区域。
17.一种用于提供具有卵子供体妊娠的妊娠女性中胎儿非整倍性的存在或不存在的统计可能性的测定系统，所述测定系统包括
提供含有母体无细胞DNA和胎儿无细胞DNA的母体样品；
询问来自第一染色体的两个或更多个核酸区域；
检测来自所述第一染色体的所述询问的核酸区域；
定量来自所述第一染色体的所述核酸区域的等位基因的相对频率；
询问来自第二染色体的两个或更多个选择的核酸区域；
检测来自所述第二染色体的所述询问的核酸区域；
定量来自所述第二染色体的所述核酸区域的等位基因的相对频率；
将来自所述第一染色体的所述核酸区域的所述相对频率与来自所述第二染色体的所述核酸区域的所述相对频率比较；
计算所述母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比；和
利用所述计算的所述母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比来提供胎儿非整倍性的存在或不存在的统计可能性；其中计算胎儿无细胞DNA百分比包括选择其中所述母体DNA和所述胎儿DNA在至少一个等位基因中不同的卵子供体提供信息的基因座。
18.根据权利要求17所述的测定系统，其中计算胎儿无细胞DNA百分比包括选择其中所述母体DNA和所述胎儿DNA在两个等位基因二者中不同的卵子供体提供信息的基因座。
19.根据权利要求17所述的测定系统，其中计算所述胎儿无细胞DNA百分比包括将低频率等位基因的相对频率与高频率等位基因和低频率等位基因两者的相对频率比较。
20.根据权利要求17所述的测定系统，其中计算所述胎儿无细胞DNA百分比包括：
将第一组固定序列寡核苷酸引入所述母体样品，其在允许所述固定的寡核苷酸与第一多态的核酸区域的互补区域特异地杂交的条件下进行；
将第二组固定序列寡核苷酸引入所述母体样品，其在允许所述固定的寡核苷酸与第二多态的核酸区域的互补区域特异地杂交的条件下进行；和
连接杂交的寡核苷酸以生成与所述核酸互补的连续的连接产物。
21.根据权利要求20所述的测定系统，其中所述固定序列寡核苷酸包含通用引物区域。
22.根据权利要求20所述的测定系统，其中所述第一组固定序列寡核苷酸和所述第二组固定序列寡核苷酸包含相同的通用引物区域。
23.根据权利要求20所述的测定系统，其中所述第一组固定序列寡核苷酸包含第一通用引物区域，并且所述第二组固定序列寡核苷酸包含第二通用引物区域。
24.根据权利要求20所述的测定系统，所述测定系统还包括利用所述通用引物区域来扩增所述连续的连接产物以生成扩增产物。
25.根据权利要求24所述的测定系统，其中所述扩增包括对连续的连接产物模板进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。
26.根据权利要求17所述的测定系统，其中所述母体样品为母体血浆或血清。
27.根据权利要求17所述的测定系统，其中计算胎儿无细胞DNA百分比包括询问两个或更多个选择的多态的核酸区域。
28.根据权利要求27所述的测定系统，其中询问两个或更多个选择的多态的核酸区域包括询问至少十个核酸区域。
29.根据权利要求28所述的测定系统，其中询问两个或更多个选择的多态的核酸区域包括询问至少二十个核酸区域。
30.根据权利要求29所述的测定系统，其中询问两个或更多个选择的多态的核酸区域包括询问至少四十个核酸区域。
31.根据权利要求30所述的测定系统，其中询问两个或更多个选择的多态的核酸区域包括询问至少九十个核酸区域。
32.根据权利要求31所述的测定系统，其中询问两个或更多个选择的多态的核酸区域包括询问至少三百个核酸区域。
33.根据权利要求17所述的测定系统，其中至少所述第一染色体为常染色体。
34.根据权利要求33所述的测定系统，其中所述第一和第二染色体两者为常染色体。
35.一种用于鉴定来自具有卵子供体妊娠的女性的样品中胎儿非整倍性的存在或不存在的方法，所述方法包括：
提供含有母体无细胞DNA和胎儿无细胞DNA的母体样品；
利用鉴定的卵子供体提供信息的基因座来计算所述样品中的胎儿无细胞DNA百分比；
证实所述样品包含高于阈值水平的胎儿无细胞DNA；
询问来自第一染色体的两个或更多个核酸区域；
询问来自至少第二染色体的两个或更多个核酸区域；
确定来自所述第一和至少第二染色体的所述询问的核酸区域的频率；
基于来自所述第一和至少第二染色体的所述核酸区域的确定的相对频率来鉴定胎儿非整倍性的存在或不存在。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述阈值在百分之1.0和百分之5.0之间。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述阈值在百分之1.5和百分之4.5之间。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述阈值在百分之2.0和百分之4.0之间。
39.根据权利要求35所述的方法，其中所述阈值为百分之3。
40.根据权利要求35所述的方法，其中所述阈值为百分之4。
41.根据权利要求35所述的方法，其中计算所述样品中的胎儿无细胞DNA百分比包括：
询问来自第一染色体的两个或更多个多态的核酸区域；
定量来自所述第一染色体的所述核酸区域的等位基因的相对频率；
询问来自第二染色体的两个或更多个选择的核酸区域；
定量来自所述第二染色体的所述核酸区域的等位基因的相对频率；
将来自所述第一染色体的所述核酸区域的所述相对频率与来自所述第二染色体的所述核酸区域的所述相对频率比较；
基于来自所述第一和第二染色体的所述等位基因的频率鉴定卵子供体提供信息的基因座；以及
基于所述卵子供体提供信息的基因座来计算所述样品中的胎儿无细胞DNA百分比。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述卵子供体提供信息的基因座包含在至少一个等位基因中不同的母体DNA和胎儿DNA。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述卵子供体提供信息的基因座包含在两个等位基因二者中不同的母体DNA和胎儿DNA。
44.根据权利要求35所述的方法，其中计算所述胎儿无细胞DNA百分比包括将低频率等位基因的相对频率与高频率等位基因和低频率等位基因两者的相对频率比较。
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