CN104870002B - 用于预防和/或治疗寄生虫病的甲壳素或其衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明的主题是甲壳质或甲壳质衍生物在预防和/或治疗寄生虫病，尤其是隐孢子虫病的用途。本发明还涉及包含至少一种选自甲壳质或甲壳质衍生物的主剂和至少一种选自刺激免疫力的试剂和抗寄生虫剂的次要试剂的组合物，以及所述组合物在预防和/或治疗寄生虫病，尤其是隐孢子虫病的用途。

Description

用于预防和/或治疗寄生虫病的甲壳素或其衍生物
技术领域
本发明涉及预防和/或治疗人和动物中的寄生虫病，尤其是隐孢子虫病的领域。
背景技术
隐孢子虫病是一种与原生动物隐孢子虫(Cryptosporidium)有关的疾病，由于死亡和生长延迟的增加、其产生的兽医护理和治疗的成本以及管理患病动物的工作时间的增加，其在家畜中具有非常明显的负面经济后果。
隐孢子虫病也影响人且可在免疫抑制患者尤其是患有HIV的患者和新生儿中具有严重的后果。与隐孢子虫病有关的主要临床体征是急性腹泻。与腹泻有关的其他临床体征尤其是脱水、极度虚弱、食欲不振和绞痛。这些各种临床体征可以导致死亡，尤其是幼小动物的死亡。
常山酮是在法国具有销售许可的用于预防和/或治疗牛犊的隐孢子虫病的唯一药物。
然而，不仅常山酮的功效是不完全的，而且它具有某种毒性，且已报道了隐孢子对该化合物耐药的风险(参见Silverlas等,Preventive Veterinary Medicine,2009,91:73-84)。
此外，没有注册用于治疗小山羊和羔羊的隐孢子虫病的任何药物。
在人类中，硝唑尼特和巴龙霉素已用于治疗隐孢子虫病。然而，迄今为止，这些分子仅在某些国家具有销售许可。例如，它们在法国不具有销售许可。
因此，不存在真正满意的用于预防和/或治疗隐孢子虫病的解决方案。
甲壳质和壳聚糖是生物相容、可生物降解、无毒的化合物，其特征在于带强负电荷。甲壳质和壳聚糖用于众多非常不同的应用中，从食品加工到水处理，且包括分析技术、化妆品行业和医学领域(参见Shahidi等,Trends in Food Science&Technology,1999,10:37-51)。
由于其抗菌和抗真菌性质，甲壳质和壳聚糖尤其用作防腐剂和制备保护性食品薄膜。
在医学领域，壳聚糖例如用作疫苗佐剂、止血剂、抗凝血剂、抗血栓形成剂、用于产生组织(皮肤、骨、软骨、肝、神经、血管)的基质、用于促进烧伤愈合和用于治疗烧伤的试剂、用于输送、固定和包封分子的支架，例如用于控释药物。
例如，Alvarez等(European Journal of Pharmaceutical Sciences,2012,47:215-227)测试了包含二氯尼特糠酸酯和环化糊精的络合物作为药物的基于壳聚糖和聚乙烯醇的微球对于被微小隐孢子虫(C.parvum)感染的肠内细胞的体外作用。作者指出微球体外附着至肠内细胞可以抑制微小隐孢子虫附着至肠内细胞并作为药物释放系统。然而，没有阐明体内施用后这些微球附着肠内细胞的能力。
因此，真实需要用于预防和/或治疗寄生虫病，尤其是隐孢子虫病的替代方案。优选地，这些替代方案几乎没有或没有毒性作用，基于天然来源的化合物，其在人和/或动物中的无害是已知的，且制备和使用是简单的。
发明简述
本发明总体上基于阐明，完全原型(original)的甲壳质或甲壳质衍生物用作唯一的活性成分可以有效预防和/或治疗寄生虫病。
本文中术语“寄生虫病”意欲指与原生动物有关的疾病，例如就隐孢子虫病来说与隐孢子虫有关。
本发明的主题尤其是甲壳质或甲壳质衍生物用作预防和/或治疗隐孢子虫病的唯一的活性成分。
本发明也涉及组合作为活性成分的甲壳质和/或甲壳质衍生物和一种或多种其他天然来源的化合物的原型组合物，用于治疗和/或预防寄生虫病尤其是隐孢子虫病。
根据本发明的原型组合物尤其可以降低幼小动物的死亡率和/或减少腹泻。
此外，这些组合物具有仅包含天然来源的化合物的优点，所述天然来源的化合物以推荐的剂量使用在人和/或动物中已知是无害的。
因此这些原型组合物几乎没有或没有毒性作用。
制备这些组合物的方法是易于进行的，仅需要简单混合各种化合物。
这些原型组合物还具有能够整合入食品组合物中的优点，不管它们是固体或液体。
因此本发明的第一个主题涉及一种组合物，包含：
-至少一种主剂，选自甲壳质或甲壳质衍生物，和
-作为次要试剂的用于刺激免疫力的试剂和/或抗寄生虫剂。
甲壳质衍生物优选选自壳聚糖、N-乙酰氨基葡糖或葡糖胺。
优选的主剂是壳聚糖和N-乙酰氨基葡糖。
用于刺激免疫力的试剂优选选自酵母壳(yeast hulls)、酵母提取物、硒、微生物、或其组合。
抗寄生虫剂选自精油、活性炭、月桂酸、或其组合。
优选的抗寄生虫剂包含精油。
所述组合物可以是食品组合物、食品增补剂或药物组合物。
本发明的第二个主题涉及如上定义的组合物用作药物。
本发明的第三个主题涉及甲壳质、甲壳质衍生物或如上定义的组合物用作尤其在人或动物中预防和/或治疗寄生虫病优选隐孢子虫病的药物。
本发明的某些优选的实施方式的更加详细的说明如下。
发明详述
如之前所指出，本发明涉及基于甲壳质和/或甲壳质衍生物的组合物，所述甲壳质和/或甲壳质衍生物用作活性成分且在本文中称为主剂(base agents)。
这些组合物还可以包含其他化合物，优选天然来源的化合物，在本文中称为次要试剂(secondary agents)。
次要试剂选自用于刺激免疫力的试剂和抗寄生虫剂。
因此本发明的主题是一种组合物，包含：
-至少一种主剂，选自甲壳质或甲壳质衍生物，和
-用于刺激免疫力的试剂和/或抗寄生虫剂。
甲壳质是可以在例如节肢动物的外骨骼、头足类动物的内骨骼和真菌的细胞壁中发现的组分。
甲壳质是主要由通过β(1-4)键彼此连接的N-乙酰氨基葡糖单体组成的直链多糖。
甲壳质通常借助于包括对甲壳纲动物的外皮或壳脱蛋白和任选的脱矿质的步骤，通常随后脱色步骤的方法获得。
脱蛋白步骤通常是碱性处理步骤(例如用氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾或磷酸钠)。
脱矿质步骤通常是酸性处理步骤(例如用盐酸、硝酸、硫酸、乙酸或甲酸)。
脱色步骤例如通过用氧化剂处理来进行。
甲壳质的乙酰化度(DA)大于50％。
乙酰化度是100个单体的N-乙酰氨基葡糖单元的平均数。
也可以使用脱乙酰化度(DDA)，其等于100-DA(作为百分比)。
术语“甲壳质衍生物”意欲指可以从甲壳质获得、尤其借助于一种或多种水解、脱乙酰、羧甲基化、琥珀酰化或酸化步骤获得的任何化合物。
甲壳质衍生物的一个实例是壳聚糖。
壳聚糖是由随机分布且通过β(1-4)键彼此连接的葡糖胺单体和N-乙酰基葡糖胺单体组成的直链多糖。
壳聚糖的乙酰化度(DA)小于50％。
用于本发明组合物的壳聚糖优选的乙酰化度为小于40％，更优选小于30％，甚至更优选小于20％，例如小于或等于10％。
壳聚糖可通过将甲壳质化学脱乙酰(例如通过在浓缩氢氧化钠溶液中处理)、热化学脱乙酰或酶促脱乙酰而获得。
由此获得的壳聚糖通常在酸性水溶液(尤其在pH低于6)中不溶。
可以使用本领域技术人员众所周知的方法使得壳聚糖溶于酸性水溶液(尤其在pH低于6)。
例如，可溶性壳聚糖可通过用盐酸处理而获得。
本发明组合物可以包含可溶性壳聚糖和/或不溶性壳聚糖。
因此，在本发明的上下文中，壳聚糖的不溶性或可溶性通过测量其在酸性水溶液(尤其是pH低于6)中的溶解度来确定。
在优选的本发明组合物中，所使用的壳聚糖是可溶性壳聚糖。
壳聚糖衍生物的另一个实例是N-乙酰氨基葡糖，又名N-乙酰基-D-葡糖胺或NAG。
N-乙酰氨基葡糖例如通过将甲壳质或壳聚糖完全水解，例如通过酶促或酸水解，或通过葡糖胺的N-乙酰化来获得。
甲壳质衍生物的又一个实例是葡糖胺，又名D-葡糖胺。
葡糖胺例如通过将壳聚糖完全水解，例如通过酶促或酸水解来获得。
本发明的主题尤其是如上定义的组合物，其特征在于甲壳质衍生物选自壳聚糖、N-乙酰氨基葡糖或葡糖胺。
优选用于本发明组合物的甲壳质衍生物是壳聚糖和N-乙酰氨基葡糖。
根据本发明的优选的组合物包含单一主剂。
当组合物仅包含一种主剂时，所述主剂优选是壳聚糖或N-乙酰氨基葡糖，更优选壳聚糖。
在一个有利的实施方式中，本发明组合物包含至少两种主剂。
例如，本发明的另一个优选组合物可以包含两种主剂。
当本发明组合物包含两种主剂时，这两种主剂优选是壳聚糖和N-乙酰氨基葡糖。
在本发明的另一个实施方式中，组合物包含至少三种主剂，例如三种主剂、四种主剂或更多。
根据本发明的优选组合物包含作为主剂的壳聚糖和任选的N-乙酰氨基葡糖。
用于刺激免疫力的试剂优选是天然来源的化合物或天然来源的化合物的组合。
因此本发明的主题尤其是如上定义的组合物，其特征在于用于刺激免疫力的试剂选自酵母壳、酵母提取物、硒、微生物、或其组合。
用于刺激免疫力的试剂例如可以包含以下的组合：
-酵母壳和酵母提取物，
-酵母壳和硒，
-酵母壳和微生物，
-酵母提取物和硒，
-酵母提取物和微生物，
-硒和微生物，
-酵母壳、酵母提取物和硒，
-酵母壳、酵母提取物和微生物，
-酵母壳、硒和微生物，
-酵母提取物、硒和微生物，和
-酵母壳、酵母提取物、硒和微生物。
酵母壳对应于酵母的不溶性级分，即酵母壁和酵母质膜。
酵母提取物对应于酵母的可溶性级分。
用于制备酵母壳和/或酵母提取物的酵母优选选自酵母(Saccharomyces)属，优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)或贝酵母(Saccharomyces bayanus)；有孢圆酵母(Torulaspora)属，优选德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)；毕赤酵母(Lindnera)属，例如杰丁毕赤酵母(Lindnerajadinii)；和克鲁维酵母(Kluyveromyces)属，优选乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。
优选的用于制备酵母壳和/或酵母提取物的酵母是酿酒酵母。
通常，酵母壳或酵母提取物通过包括酵母自溶步骤继之以分离可溶性级分和不溶性级分的步骤的方法来获得，分离的不溶性级分对应于酵母壳，可溶性级分对应于酵母提取物。
然后可以干燥不溶性级分和/或可溶性级分。
在一个有利的实施方式中，酵母壳根据包括以下步骤的方法来获得：
-在发酵桶中产生酵母以获得酵母乳，
-在pH1-5下酸化酵母乳，
-在45℃-70℃之间固定或变化的温度下自溶，任选在蛋白水解酶存在下，
-分离对应于酵母壳的不溶性级分(10％-14％的干物质)，
-冷却到4℃，
-任选地，干燥。
酵母壳可以为液体形式、干燥形式或粘性形式。据认为当它们的干物质含量按重量计为至少85％、优选至少90％、甚至更优选至少94％时，它们为干燥形式。相反，如果它们的干物质含量按重量计小于20％，据认为它们为液体形式。在干物质按重量计为20％至85％时，据认为酵母壳为粘性形式。
酵母壳主要包含主要由β-葡聚糖和甘露聚糖组成的碳水化合物(按重量计干物质的40％-60％的碳水化合物)。
它们还包含按重量计干物质的10％-30％，尤其约15％-30％的蛋白质。
酵母壳优选以干燥形式使用。
在一个有利的实施方式中，酵母提取物根据包括以下步骤的方法来获得：
-在发酵桶中产生酵母以获得酵母乳，
-在pH1-5下酸化酵母乳，
-在45℃-70℃之间固定或变化的温度下自溶，任选在蛋白水解酶存在下，
-分离对应于酵母提取物的可溶性级分，
-冷却到4℃，
-任选地，干燥。
酵母提取物可以为干燥形式，优选为水溶性细粉形式、液体形式或糊状物形式。
据认为当酵母提取物的干物质含量按重量计为至少85％、优选至少90％、甚至更优选至少94％时，它为干燥形式。如果它的干物质含量按重量计小于70％，据认为它为液体形式。在干物质按重量计为70％至85％时，据认为酵母提取物为糊状物形式。
所使用酵母提取物优选为干燥形式，更优选为水溶性细粉形式。
酵母提取物主要包含蛋白质，优选至少55％的蛋白质。
硒是矿物形式或有机形式的硒，优选有机形式。
有机形式的硒例如是硒代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸、硒亚砜、S-(甲基硒代)半胱氨酸、Se-甲基硒代半胱氨酸、Se-腺苷高半胱氨酸、硒代羊毛硫氨酸、硒代胱氨酸、丙氨酸丁氨酸硒醚、γ-谷酰基-Se-甲基硒代半胱氨酸、二甲基硒、二甲基二硒、二乙基硒、(S)-2-氨基-4-(甲基硒基(selanyl))丁酸、R,S-2-羟基-4-甲基硒代丁酸、或其混合物。
有机形式的硒例如以富含硒的酵母、完全或部分从酵母提取的硒、或其组合的形式提供。
富含硒的酵母可以通过在硒的存在下增殖酵母而获得。
优选地，富含硒的酵母是酿酒酵母。
富含硒的酵母优选为灭活酵母形式，所述酵母例如通过热处理灭活。
富含硒的酵母例如包含至少2000mg硒/kg干物质，其中97％-99％的硒为有机形式且总硒的63％为硒代甲硫氨酸形式。
富含硒的酵母优选以粉末形式使用。
因此本发明的主题尤其是如上定义的化合物，其特征在于硒为富含硒的酵母、完全或部分从酵母提取的硒、或其组合的形式。
在本发明优选的组合物中，硒为富含硒的酵母形式。
可用于本发明组合物的微生物是细菌或酵母。
微生物优选选自杆菌属(Bacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、片球菌属(Pediococcus)或乳球菌属(Lactococcus)的细菌、或酵母属或克鲁维酵母属的酵母、或其组合。
杆菌属的微生物例如选自种类枯草杆菌(Bacillus subtilis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、解洋菜芽孢杆菌(Bacillusagglomerans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)或蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)。
乳酸杆菌属的微生物例如选自种类约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副乾酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)或唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)。
双歧杆菌属的微生物例如选自种类乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)或adolescensis双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescensis)。
肠球菌属的微生物例如选自屎肠球菌种(Enterococcus faecium)。
丙酸杆菌属的微生物例如选自种类费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)或詹氏丙酸杆菌(Propionibacterium jensenii)。
乳球菌属的微生物例如选自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)或嗜热乳球菌(Lactococcus thermophilus)。
酵母属的微生物例如选自种类酿酒酵母、巴氏酵母或贝酵母。
克鲁维酵母属的微生物例如选自乳酸克鲁维酵母或马克斯克鲁维酵母。
片球菌属的微生物例如选自乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、糊精片球菌(Pediococcus dextrinicus)或戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。
在本发明优选的组合物中，微生物是杆菌属细菌，更优选枯草杆菌。
在本发明另一个优选的组合物中，微生物是乳酸杆菌属细菌，更优选约氏乳酸杆菌。
在本发明又一个优选的组合物中，微生物是杆菌属细菌和乳酸杆菌属细菌的组合，更优选枯草杆菌和约氏乳酸杆菌的组合。
微生物可以是活的或失活的。
术语“失活”或者“灭活”意欲指死的微生物，即其代谢不能恢复地停止的微生物。
失活微生物可以通过本领域技术人员众所周知的技术获得，例如热处理、使微生物经受若干连续冻融循环的处理、辐射处理、喷雾干燥处理或这些处理的组合。
优选地，本发明组合物包含失活微生物。
抗寄生虫剂优选为天然来源的化合物或天然来源的化合物的组合。
抗寄生虫剂例如选自精油、活性炭、月桂酸、或其组合。
优选的抗寄生虫剂由精油或精油混合物和任选的活性炭和/或月桂酸组成。
精油是具有高浓度的挥发性植物芳族化合物的液体。
术语“精油”和术语“植物香精”同义。
用于从植物获得精油的方法是本领域技术人员所众所周知的。
精油例如可以通过水蒸馏法获得，即蒸汽蒸馏、用挥发性溶剂萃取、冷压萃取或超临界CO2萃取。
本发明的主题尤其是如上定义的组合物，其特征在于精油选自大蒜精油、香茅精油、肉桂精油、百里香精油、牛至精油、茶树精油、柠檬精油、桉树精油、或其组合。
大蒜精油富含蒜素且可以从大蒜(Allium sativum)获得。
香茅精油富含柠檬醛和citrannal且可以从香蜂草(Melissa Officinalis)获得。
肉桂精油富含肉桂醛和乙酯肉桂酯且可以从肉桂(Cinnamomum zeylanicum)获得。
百里香精油富含麝香草酚且可以从麝香草(Thymus vulgaris)获得。
牛至精油富含麝香草酚和香芹酚且可以从牛至草(Origanum vulgare)获得。
茶树精油富含γ-萜品烯、萜品烯-4-醇和α萜品醇且可以从茶树(Melaleucaalternifolia)获得。
柠檬精油富含柠檬油精且可以从柠檬(Citrus limon)获得。
桉树精油富含1,8-桉树脑且可以从蓝桉树(Eucalyptus globulus)或澳洲尤加利(Eucalyptus radiata)获得。
优选地，抗寄生虫剂包含或由至少两种精油、优选至少三种精油、甚至更优选四种精油的混合物组成。
在一个特别有利的实施方式中，将精油或精油混合物包封于酵母壳中。
然后使用术语包封的精油或包封的精油混合物。
用于将油包封于酵母壳中的方法是本领域技术人员所众所周知的(例如参见文献EP 0 242 135或Normand等,Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53:7532-7543)。
通常，包封于酵母壳中的精油或包封于酵母壳中的精油混合物通过将待包封的所述精油或所述精油混合物与包含酵母壳的悬浮液接触的步骤，然后任选的干燥步骤来获得。
所使用的酵母壳如上所定义。
它们优选是酿酒酵母的酵母壳。
本发明的主题尤其是如上所定义的组合物，其特征在于抗寄生虫剂包含大蒜精油、香茅精油、肉桂精油和百里香精油。
在一个优选的实施方案中，大蒜、香茅、肉桂和百里香精油以这四种精油的混合物形式提供。
大蒜、香茅、肉桂和百里香精油的所述混合物优选包封于酵母壳中。
本发明优选的精油混合物包含3％-7％的大蒜精油、7％-13％的香茅精油、59％-69％的肉桂精油和21％-32％的百里香精油，所述百分比以相对于混合物重量的重量表示。
在另一个有利的实施方式中，将上述精油混合物包封于酿酒酵母的酵母壳中且这种包封的精油混合物包含按重量计相对于总重量10％-30％的精油，优选按重量计相对于总重量20％-30％的精油。
活性炭，也称为活性的炭或活性木炭，是基本上由具有多孔结构的碳基材料组成的黑色的轻质粉末，其特征在于非常大的比表面积。
活性炭可以由任何富含碳的植物有机物通过本领域技术人员众所周知的方法来制备。
月桂酸，也称为十二烷酸，是由12个碳原子组成的中链脂肪酸。
本发明组合物的一种实施例包含或由以下组成：
-作为主剂的壳聚糖和/或N-乙酰氨基葡糖，优选壳聚糖，
-用于刺激免疫力的试剂，包含或由以下组成：
-酵母壳，
-酵母提取物，
-硒，优选以富含硒的酵母形式，和
-任选的微生物，选自枯草杆菌、约氏乳酸杆菌、酿酒酵母或其组合，
-抗寄生虫剂，包含或由以下组成：
-百里香精油、香茅精油、肉桂精油和大蒜精油，优选以包封的精油混合物形式，
-任选的活性炭，和
-任选的月桂酸。
优选的本发明组合物包含或由以下组成：
-2％-15％的壳聚糖，优选4％-10％的壳聚糖，更优选6％-10％的壳聚糖，和/或2％-30％的N-乙酰氨基葡糖，优选2％-20％的N-乙酰氨基葡糖，更优选4％-10％的N-乙酰氨基葡糖，作为主剂(优选壳聚糖和任选的N-乙酰氨基葡糖)，
-用于刺激免疫力的试剂，包含或由以下组成：
-25％-85％的酵母壳，优选30％-70％的酵母壳，更优选40％-60％的酵母壳，
-1％-15％的酵母提取物，优选2％-10％的酵母提取物，更优选2％-5％的酵母提取物，
-0.002％-0.02％的硒，优选0.004％-0.01的硒，更优选0.004％-0.006的硒，或1％-10％的富含硒的酵母，优选2％-5％的富含硒的酵母，更优选2％-3％的富含硒的酵母，
-任选地，100g组合物中105CFU-1012CFU选自枯草杆菌、约氏乳酸杆菌、酿酒酵母或其组合的微生物，优选105CFU-1011CFU，更优选105CFU-1010CFU，优选106CFU-109CFU，更优选106CFU-108CFU，
-抗寄生虫剂，包含或由以下组成：
-0.4％-20％的精油，优选0.4％-12％，更优选1％-6％，甚至更优选1.5％-4％，所述精油优选为包封的百里香、香茅、肉桂和大蒜精油混合物形式，或2％-65％的包封精油，优选2％-40％，更优选5％-20％，甚至更优选8％-12％，所述包封精油优选为包封的百里香、香茅、肉桂和大蒜精油混合物形式，
-任选的2％-25％的活性炭，优选4％-15％，更优选4％-8％，和
-任选的5％-40％的月桂酸，优选5％-30％，更优选6％-20％。
百分比以相对于100g组合物的g表示。
一个CFU对应于一个菌落形成单位。
在上述组合物中，酵母壳的百分比不包含任选的用作包封精油的包封剂的酵母壳。
本发明组合物通过混合各种其成分的简单步骤，任选随后的干燥步骤而获得。
通常，各种成分的混合物提供干燥形式的组合物，无需随后的干燥步骤。
如上定义的组合物优选为干燥形式，尤其为粉末形式。
本发明组合物还可以为液体形式。
液体组合物通常通过溶解如上定义的干燥形式的组合物而获得。
本发明组合物例如是实施例3所描述的组合物A、B、C和D。
本发明的主题还是如上定义的组合物，其特征在于所述组合物是食品组合物、食品增补剂或药物组合物。
食品组合物可以是用于喂养人或动物的组合物。
食品组合物表示任何种类的食品、饮料或糖果产品。
当食品组合物用于喂养人时，食品组合物可以例如是饮料、压块干粮、口香糖、巧克力、乳制品例如发酵乳制品或植物来源的发酵制品。
优选地，食品组合物用于动物。
用于动物的食品组合物例如还可以包含选自乳清、奶粉、乳清蛋白、玉米面筋饲料、大豆饼、矿物和维生素的预混物和油例如棕榈油或椰子油的化合物。
用于动物的食品组合物例如是饮用水、初乳或乳、尤其是适于动物和其年龄的乳。
术语“食品增补剂”表示食品，其目的是补充正常饮食。
食品增补剂构成单独或组合具有营养或生理效应的营养物或其他物质的浓缩来源。
食品增补剂以剂量形式销售，即表现形式例如凝胶胶囊、锭剂、片剂、丸剂和其他类似的形式、粉末囊、液体瓶、配备有点滴器的瓶子和其他意欲以低量的测量单元摄取的液体或粉末制剂的类似的形式。
本发明药物组合物优选用于口服施用。
例如作为适于口服途径的形式的组合物，可以提及片剂、胶囊、凝胶胶囊、囊片、粉末、霜剂、糖浆、糊剂、凝胶或小瓶。
药物组合物可作为与固体或液体食品(例如幼小动物中的乳)的混合物施用。
除主剂和次要试剂之外，药物组合物可以包含至少一种生理学上可接受的载体或赋形剂。
生理学上可接受的载体或赋形剂可以是适于人和/或动物施用的载体或赋形剂。
例如，载体或赋形剂选自通常适于口服形式制剂使用的那些。
本发明的药物组合物也可以包含至少一种额外的药物活性成分(即，除主剂和次要试剂之外)。
术语“药物活性成分”意欲指其施用对施用其的患者或受试者的健康或总体情况具有治疗学作用或有益影响的任何化合物或物质。
因此，额外的药物活性成分可以对隐孢子虫病和/或相关的临床体征例如腹泻、脱水、虚弱、食欲不振和绞痛具有活性。
可以存在于本发明组合物中的药物活性成分的实例包括但不限于抗隐孢子虫剂(cryptosporidiostatic agent)、消炎药、抗生素、退热剂、抗呕吐剂、抗组胺剂、维生素、解痉剂等。
在一个有利的实施方式中，本发明药物组合物不包含直接对抗隐孢子虫的额外的药物活性成分，例如抗隐孢子虫剂。
在另一个有利的实施方式中，本发明药物组合物不包含额外的药物活性成分。
本发明药物组合物可以使用能有效获得期望的治疗学效果的任何剂量和施用途径的组合来施用。
待施用的准确量可以取决于其年龄、重量、总体情况和预防性或治疗性治疗的种类在不同患者或动物之间变化。
本发明的主题还是如上定义的组合物用作药物。
尤其是，本发明的主题是如上定义的组合物用作预防和/或治疗寄生虫病的药物。
如之前所指出，这是首次描述了使用甲壳质或甲壳质衍生物作为唯一的活性成分用于预防和/或治疗寄生虫病，尤其是预防和/或治疗隐孢子虫病。
因此，本发明的主题还是甲壳质和/或甲壳质衍生物用作预防和/或治疗寄生虫病的药物。
本发明的主题尤其是如上定义的甲壳质、甲壳质衍生物或组合物用作预防和/或治疗寄生虫病的药物，其特征在于所述寄生虫病是隐孢子虫病。
引起隐孢子虫病的微生物是隐孢子虫，优选选自种类微小隐孢子虫(C.parvum)、牛隐孢子虫(C.bovis)、赖氏隐孢子虫(C.ryanae)、安氏隐孢子虫(C.andersoni)、鹿隐孢子虫(C.cervine)、人隐孢子虫(C.hominis)、火鸡隐孢子虫(C.meleagridis)、猫隐孢子虫(C.felis)、小鼠隐孢子虫(C.muris)、猪隐孢子虫(C.suis)、贝氏隐孢子虫(C.baileyi)和犬隐孢子虫(C.canis)。
甲壳质衍生物如上定义。
用作预防和/或治疗寄生虫病的药物的甲壳质衍生物优选选自壳聚糖、N-乙酰氨基葡糖或葡糖胺。
本发明的主题尤其是如上定义的甲壳质、甲壳质衍生物或组合物用作预防和/或治疗人或动物中的寄生虫病优选隐孢子虫病的药物。
预防和/或治疗动物中的隐孢子虫病涉及相当特别的反刍动物，尤其是牛、绵羊族、山羊族和鹿科成员、以及猪、家禽和兔。
预防和/或治疗动物中的隐孢子虫病涉及相当特别的幼小动物，例如小牛、小山羊和羔羊。
在一个有利的实施方式中，本发明的主题是如上定义的甲壳质、甲壳质衍生物或组合物用作预防和/或治疗人或动物中的寄生虫病优选隐孢子虫病的药物，甲壳质、甲壳质衍生物或组合物的施用在初乳期(colostral phase)进行。
当在初乳期施用所述组合物时，所述组合物优选不包含活细菌，更通常不包含活微生物。
本发明的主题也是用于预防性或治疗性治疗隐孢子虫病的方法，包括向患病的人或动物受试者施用如上定义的壳聚糖、壳聚糖衍生物或组合物的步骤。
日剂量取决于人或动物、其年龄和预防性或治疗性治疗的种类。
例如，人的日剂量对应于施用10g-25g的本发明组合物，优选15g-20g的组合物。
日剂量可以以一次、两次或三次摄入来施用。
同样例如，动物的日剂量可以是：
-对于活重3kg-5kg的动物，每天2g-10g的本发明组合物，连续7天，
-对于活重30kg-50kg的动物，每天5g-15g的本发明组合物，连续7天，
-对于活重大于50kg的动物，每天10g-20g的本发明组合物，连续7天。
在测试剂量，动物中没有观察到本发明组合物的副作用。
本发明的其他特征和优点将通过阅读以下执行实施例而变得更加清晰，所述实施例非限制性地阐明本发明，且为了理解所述实施例，将参照附图。
具体实施方式
实施例1：短棒状杆菌体外增殖的抑制
实验在Alfort Ecole Nationale Vétérinaire[国家兽医学校]与UnitéMixte deRecherche[组合研究机构]Biologie moléculaire et Immunologie Parasitaire etfongique(BIPAR)[分子生物学和寄生和真菌免疫学]的“parasites transmis par lesaliments”[“食品-传播的寄生虫”]团队合作进行。
材料和方法
(i)细胞系
测试两种细胞模型：HCT-8细胞(人回盲肠腺癌细胞)和Caco-2细胞(人结肠腺癌细胞)。
(ii)测试化合物：壳聚糖、NAG、巴龙霉素
可溶性壳聚糖是壳聚糖盐酸盐，其脱乙酰化度大于或等于90％和粘度为5.5mPas(20℃下在0.5％蒸馏水溶液中测量的动态粘度)(Kraeber&Co GMBH,Germany)。
NAG(N-乙酰氨基葡糖)来自Kraeber&Co GMBH,Germany。
巴龙霉素(硫酸巴龙霉素100％，Antibioticos SPA,Italy)是用于治疗隐孢子虫病的抗菌药物，其可以降低卵囊排泄。
(iii)微小隐孢子虫
爱荷华州微小隐孢子虫菌株(Waterborne inc.,New Orleans,LA,USA)用于该测试。
(iv)细胞感染
感染在24-孔平板中胶原蛋白包被的盖玻片上的单层中培养的70％-80％融合的细胞上进行。
单层细胞上清液用3ml添加有1×104个微小隐孢子虫卵囊的培养基替换。在37℃和5％CO2的湿润孵育器中孵育3小时后，上清液用3ml培养基替换并在37℃、5％CO2和80％湿度的湿润孵育器中孵育48小时。
(v)预孵育测试
在平板的每个孔中，将1×104个卵囊与500μg/ml的巴龙霉素、壳聚糖或NAG接触。
将平板在37℃和5％CO2的湿润孵育器中孵育24小时。
然后如上文所指出感染细胞。
(vi)直接测试
感染细胞的培养基用1ml随后添加有最终浓度为500μg/ml的测试化合物的培养基替换。
将平板在37℃和5％CO2的湿润孵育器中孵育48小时。
(vii)染色并计数胞内卵囊
用甲醇固定细胞后，将胞内卵囊染色。使用特异性结合的多克隆抗体(Sporo-Glo20X Waterborne inc.,New Orleans,LA,USA)进行标记。然后将盖玻片固定在载片上。用荧光显微镜计数胞内卵囊。
在各载片上，计数在载片的整个表面积内任意选择的6×50个区域。
(viii)统计学分析
获得的结果是重复三次的平均值。数据通过ANOVA分析。认为p值小于或等于0.05是显著的。
结果
(i)细胞毒性
初步测试可以测定由HCT-8和Caco-2细胞耐受的最佳剂量，并导致选择500μg/ml的剂量作为测试各个化合物。
(ii)感染之前将测试化合物与微小隐孢子虫卵囊一起预孵育的作用
在体外感染之前将剂量为500μg/ml的测试化合物与微小隐孢子虫卵囊一起孵育24小时。
获得的结果提供于表1(HCT-8细胞)和表2(Caco-2细胞)。
巴龙霉素能够显著抑制HCT-8细胞和Caco-2细胞上寄生虫的发育(p<0.001)：巴龙霉素将HCT-8细胞上寄生虫发育降低99.5％，将Caco-2细胞上的寄生虫发育降低97.1％。
对于壳聚糖和NAG来说也是这样。
可溶性壳聚糖分别将HCT-8细胞上寄生虫发育降低95.7％和将Caco-2细胞上的寄生虫发育降低97.6％(p<0.001)。
NAG分别将HCT-8细胞上寄生虫发育降低99.0％和将Caco-2细胞上的寄生虫发育降低97.4％(p<0.001)。
表1
T+:感染细胞/T-:非感染细胞
表2
T+:感染细胞/T-:非感染细胞
(iii)在直接添加至感染细胞期间测试化合物对微小隐孢子虫的作用
各种化合物以500μg/ml的剂量进行测试。结果提供于表33(HCT-8细胞)和4(Caco-2细胞)。
表3
T+:感染细胞/T-:非感染细胞
巴龙霉素、NAG和壳聚糖诱导了两种细胞系中寄生虫发育的显著降低(p<0.005)：
-HCT-8细胞上分别为44.6％、88.4％和93.6％，和
-Caco-2细胞上分别为33.6％、35.2％和68％。
因此，NAG和壳聚糖对于HCT-8细胞比巴龙霉素更有效，和壳聚糖对于Caco-2细胞更有效。
表4
T+:感染细胞/T-:非感染细胞
实施例2：体外肠上皮细胞中微小隐孢子虫附着或复制
材料和方法
(i)测试的细胞系和卵囊
所使用的微小隐孢子虫卵囊从已经用实验方法感染的小牛粪便(大便)(通过Tours的INRA[French National Institute for Agricultural Research])分离。
测试在包含10％FCS(胎牛血清)的完全培养基中培养的CMT-93鼠科细胞系(不含支原体)上进行。
(ii)测试的化合物
不溶性壳聚糖是干物质含量为6.43％和脱乙酰化度为95.5％的聚-(N-脱乙酰基-D-葡糖胺)(Federal Laboratories Chemical Corp,NY,USA)。
可溶性壳聚糖是脱乙酰化度大于或等于90％和粘度为5.5mPas(20℃下在0.5％蒸馏水溶液中测量的动态粘度)的壳聚糖盐酸盐(Kraeber&Co GMBH,Germany)。
NAG(N-乙酰氨基葡糖)来自Kraeber&Co GMBH,Germany。
还测试以下：
-酵母壳(Safmannan,Lesaffre)，
-富含硒的酵母(Selsaf,Lesaffre)，
-活性炭，
-大蒜精油，
-精油混合物(包含6％大蒜精油、10％-13％香茅精油、59％-72％肉桂精油和23％-32％百里香精油)，
-活酿酒酵母(Actisaf,Lesaffre)。
10ng/ml的干扰素-γ用作阳性对照。这是因为已经描述了在该细胞因子作用下肠细胞中微小隐孢子虫增殖被部分抑制。
(iii)化合物对于微小隐孢子虫发育的作用的测试
以3.6×105个细胞每孔的比例接种CMT-93细胞系。
8小时后添加测试化合物。孵育16小时后，在测试化合物存在下以不影响细胞活力大于15％的选定剂量用微小隐孢子虫卵囊进行感染(5个卵囊/细胞的比例)。
24小时后，将细胞用胰岛素溶解并用荧光性植物血凝素(VVL-FITC)标记，以能够用荧光显微镜发现感染细胞。人工计数感染细胞数目。该技术较繁重，但被证明比通过流式细胞仪计数寄生虫感染的细胞更准确。
结果
与非处理对照相比，以18μg/ml测试的可溶性壳聚糖和NAG分别将CMT-93细胞系中的寄生虫增殖降低了31％和43％。
这些降低与阳性对照干扰素-γ中观察到的相似。
18μg/ml的不溶性壳聚糖允许较小的寄生虫增殖的降低，其中与非处理对照的50％感染细胞相比，大约为40％的感染细胞。
与非处理对照相比，18μg/ml剂量的活性炭将寄生虫增殖降低了36％。在该剂量，活性碳的作用仍然类似于干扰素-γ。
与非处理对照相比，3.3μg/ml或30μg/ml剂量的精油混合物(包含6％大蒜精油、10％-13％香茅精油、59％-72％肉桂精油和23％-32％百里香精油)也允许寄生虫增殖降低30％，且与干扰素-γ中观察到的类似。
测试剂量的其他化合物对于寄生虫增殖无效。
实施例3：上皮细胞和树突状细胞的免疫应答
(i)测试的细胞系和卵囊
所使用的微小隐孢子虫卵囊从已经用实验方法感染的小牛粪便(大便)(通过Tours的INRA[French National Institute for Agricultural Research])分离。
测试在包含10％FCS(胎牛血清)的完全培养基中培养的CMT-93鼠科细胞系(不含支原体)上或在定期添加至培养基的GM-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)的存在下在来源于骨髓(未成熟)的树突状细胞上进行9天。
(ii)测试的化合物
在上皮细胞上测试的产品是：
-NAG(N-乙酰氨基葡糖)(Kraeber&Co GMBH,Germany)。
-酵母壳(Safmannan,Lesaffre)，
-活酿酒酵母(Actisaf,Lesaffre)，
-灭活的约氏乳酸杆菌菌株。
在树突状细胞上测试的产品是：
-酵母壳(Safmannan,Lesaffre)，
-活酿酒酵母(Actisaf,Lesaffre)，
-枯草杆菌菌株，
-活的约氏乳酸杆菌菌株，
-灭活的约氏乳酸杆菌菌株，
-大肠杆菌菌株。
(iii)上皮细胞和树突状细胞免疫应答测试
-上皮细胞
通过上皮细胞或其他肠内细胞产生趋化因子对于募集对抗初生儿中隐孢子虫病所需的炎症细胞是重要的。通过上皮细胞产生趋化因子在用各种化合物孵育CMT-93细胞24小时后通过定量RT-PCR(通过结合Sybr绿来定量)来测量。
-树突状细胞
测试在定期添加至培养基的GM-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)的存在下在来源于骨髓(未成熟)的树突状细胞上进行9天。
细胞因子IL-12p40的产生在添加各种稀释度的产品后24小时通过ELISA来测量。接种活的产品后4h添加抗生素。
结果
对于上皮细胞，能够吸引单核吞噬细胞的趋化因子(CXCL2、CCL3、CCL20、CXCL10、CCL2)通过上皮细胞体外响应测试化合物(但以少于寄生虫感染的量)来制备。发现NAG产品对于CXCL10和CCL20通常是最有效的，然后是酵母壳和活酵母(Actisaf)对于CCL3是最有效的。
对于树突状细胞，酵母壳、枯草杆菌菌株、乳酸杆菌、大肠杆菌和活酵母都诱导非常强的IL-12p40产生。该实验在体外分化的巨噬细胞上重复(在M-CSF的存在下进行6天)，且对于乳酸杆菌和活酵母获得非常强的应答。
实施例4：小山羊中诱导的隐孢子虫病的治疗
材料和方法
小山羊模型
(i)测试组合物
*小山羊每天喂养两次。
酵母壳是产品Safmannan(Lesaffre)。
酵母提取物是产品EXL2020(Biospringer)。
富含硒的酵母是产品(Lesaffre)。
活酵母对应于2010年12月2日以保藏号I-4407(Actisaf,Lesaffre,9×109CFU/g)保藏于Collection Nationale de Cultures de Microorganismes[国家微生物保藏中心](CNCM,Institut Pasteur,25Rue du Docteur Roux,F-75724 PARIS Cedex 15)的菌株。
精油混合物包含6％的大蒜精油、10％-13％的香茅精油、59％-72％的肉桂精油和23％-32％的百里香精油。
NAG来自Kraeber&Co GMBH,Germany。
可溶性壳聚糖是壳聚糖盐酸盐，其脱乙酰化度大于或等于90％和粘度为5.5mPas(20℃下在0.5％蒸馏水溶液中测量的动态粘度)(Kraeber&Co GMBH,Germany)。
不溶性壳聚糖是脱乙酰化度大于90％的壳聚糖(Federalabs,United States)。
组合物A、B、C和D为粉末形式。
(ii)试验1
将小山羊分为2到4天大的11只小山羊的4组：
-第1组：感染对照，不接受处理
-第2组：2.5g组合物A/小山羊，每天两次
-第3组：5g组合物A/小山羊，每天两次
-第4组：10g组合物A/小山羊，每天两次。
应注意小山羊都用剂量为0.1ml/kg的马波沙星每天一次皮下注射精准用药地(metaphylactically)处理，因为将其分为4组之前在死的小山羊中检测到肺炎病变。该处理不妨碍临床试验，因为马波沙星不能有效对抗隐孢子虫病。
使用注射器将106个重悬于水中的微小隐孢子虫卵囊(Waterborne Inc,NewOrleans,USA)用实验方法经口传染小山羊。
将组合物A悬浮于100ml乳(来自Sofivo group的Optiprim全脂牛奶代用品)后进行组合物的分配。就在分配之前即时溶解组合物。
为了方便，用瓶子单独分配混合物，每只小山羊接受100ml的混合物。
在早上和晚上分配处理，持续14天，并在实验性传染前半天开始施用。在用餐之前进行处理的分配，以确保良好的处理摄入。
(iii)试验2
将小山羊分为2到4天大的11只小山羊的4组：
-第1组：感染对照，不接受处理
-第2组：5g组合物B/小山羊，每天两次
-第3组：7.5g组合物C/小山羊，每天两次
-第4组：5g组合物D/小山羊，每天两次。
使用注射器将106个重悬于水中的微小隐孢子虫卵囊(Waterborne Inc,NewOrleans,USA)用实验方法经口传染小山羊。
将组合物B、C、D悬浮于100ml乳(来自Sofivo group的Optiprim全脂牛奶代用品)后进行组合物的分配。就在分配之前即时溶解组合物。
为了方便，用瓶子单独分配混合物，每只小山羊接受100ml的混合物。
在早上和晚上分配处理，持续14天，并在实验性传染前半天开始施用。在用餐之前进行处理的分配，以确保良好的处理摄入。
(iv)测量和数据收集
每天从每只小山羊取样粪便物，以通过Heine半定量法测量个体排泄。样品取自直肠。
对于每只小山羊指定排泄等级：
-0＝没有卵囊
-1＝少于1个卵囊
-2＝1-10个卵囊
-3＝11-20个卵囊
-4＝21-30个卵囊
-5＝31-40个卵囊。
对每只小山羊指定0到2的腹泻等级：
-0＝没有腹泻，
-1＝糊状腹泻和
-2＝液体腹泻。
卵囊排泄以及腹泻等级反映了测试组合物对寄生虫的功效。排泄降低可以降低传染压力，其通常伴有接近零的得分。因此从流行病学观点它们是有利的。
(v)统计学分析
使用Statistica软件分析结果。使用Chi2、ANOVA、重复测量ANOVA、Goodmanγ系数和Kruskal-Wallis检验。
结果
(i)试验1
组的分配
该试验用具有各种缺点的多种来源的小山羊进行：根据来源可变的微生物病(巴氏杆菌病、大肠杆菌病)，不同品种的小山羊(对于隐孢子虫病无效)和不同体型的小山羊(对于经历临床发作存活能力的潜在影响)。
在实验开始时各组包含11只小山羊。
实验性感染的确认
感染是确定的，因为感染后4天几乎100％的小山羊排泄卵囊。家畜1的小山羊早在感染后的第二天开始排泄卵囊，这证实在它们到达畜舍之前家畜中的感染。来源于家畜2和3的对照组的小山羊在实验性感染后3天开始排泄卵囊。感染后4天(小山羊的平均年龄：8天)，100％的对照小山羊排泄卵囊，且维持4天。
排泄的发展
排泄的发展在对照组和处理的第2、3和4组之间是类似的。
平均腹泻等级
在对照第1组中，从7天大开始平均腹泻得分增加，且与排泄同时15天后开始减少。
在第3和第4组，观察到腹泻的最大时期内平均腹泻得分的减少。
第3和第4组中活动物的平均腹泻时期短于对照第1组。
第3组小山羊出现的腹泻体征晚于其他组，且水平较低。
发病率
发病率计算为出现腹泻(腹泻得分1或2)的小山羊相对于存在的小山羊总数的百分比。
在对照第1组中，超过60％的小山羊在8-15天出现腹泻，伴随有卵囊排泄增加。
第4组的发病率水平低于其他组。
此外，第3组中腹泻出现的延迟较长：尽管第2和第4组的超过60％的小山羊从8天大开始出现腹泻，该百分比仅在第3组11天大时到达。
死亡率
21只小山羊“自然”死亡且3只小山羊出于人道主义理由被安乐死。死亡小山羊在死亡时的年龄是5到17天。它们中的大部分在尸检时出现卵囊排泄、腹泻和显微镜体征，这与隐孢子虫病一致。该试验中一些小山羊没有死于隐孢子虫病。
没有要注意的施用组合物的主要作用。
结论
在该试验中，已经被引起肺病的病原体在家畜中的传播削弱的小山羊对运送且到达畜舍的耐受性可能很差，且5只小山羊在将其分批之前死亡。这可以解释为什么本发明组合物的结果比期待的不显著。
然而，与非处理组相比，组合物A对于小山羊的腹泻和发病率具有有利影响。
每天两次施用5g/小山羊的剂量给出最佳结果。
(ii)试验2
组的分配
试验2用相同来源的小山羊进行，结果其在年龄和重量方面非常均匀且没有间发的病理学病症。小山羊对实验性感染的极端敏感性证实之前没有感染隐孢子虫。各组在试验开始时包含11只小山羊。
实验性感染的有效性
对照第1组的所有小山羊从8天大开始大量排泄微小隐孢子虫卵囊(平均排泄等级：在0到5的范围中为4.5)，也就是实验性感染后4天。对照第1组唯一存活的小山羊连续排泄卵囊8天。
排泄的发展
在分别接受组合物B、C和D的第2、第3和第4组中卵囊排泄的发展是类似的。
第2、第3和第4组中排泄等级的最高平均值低于对照组。
在8-15天，第3组中的平均排泄比对照第1组和第2和第4组中低。
平均腹泻等级
第2、第3和第4组中腹泻的出现早于对照第1组，尤其在第3组，其中超过35％的小山羊在6天前出现腹泻。然后由隐孢子虫病引起的腹泻发作在第2、第3和第4组以及对照第1组之间是类似的。
应注意超过13天的与对照组的比较解释由于对照组中存在唯一存活的小山羊而变得不可能。
第2、第3和第4组出现腹泻的小山羊的百分比略低于对照第1组。
第2、第3和第4组中腹泻等级的最高平均值(分别为1.7、1.7和3.7)远低于对照组(4.5)。
第2、第3和第4组中活的小山羊中腹泻的持续时间低于对照组。
在12-18天大，第1组中腹泻等级明显(p<0.005)高于第2组；在16-17天，第1组中腹泻等级高于第3组；且在17-18天，第1组中腹泻等级高于第4组。
发病率
发病率计算为出现腹泻(腹泻得分1或2)的小山羊相对于存在的小山羊总数的百分比。在对照组中，超过80％的小山羊在7-12天大出现腹泻，伴随有卵囊排泄增加。
死亡率
14只小山羊“自然”死亡且13只小山羊出于人道主义理由被安乐死。在腹泻发作之后，在10-11天大时观察到包括所有组的死亡率峰值。
第1组的累积死亡率是91％，第2组是36％，第3组是64％和第4组是55％。
第1组的死亡率明显高于第2组。
如果排除没有死于隐孢子虫病的第4组的小山羊，则对照第1组的死亡率明显高于第4组。
第3组的死亡率降低。
应注意处理组中死亡时的平均年龄(第2组为13.5；第3组为11.7；第4组为16.4)高于对照组(10.7)。
结论
本发明组合物B、C和D可以改善畜牧学性能水平，降低腹泻并降低死亡率。
组合物C还可以降低卵囊排泄。
实施例5：幼鼠中诱导的隐孢子虫病的处理
(i)测试组合物
酵母壳(Safmannan,France)
(ii)化合物对微小隐孢子虫发育的作用的测试
用5×105个微小隐孢子虫卵囊接种幼鼠。
在微小隐孢子虫感染前一天，以及在感染后第2天和感染后第4天通过填喂C57BL/6只2-3天大的小鼠口服施用500μg酵母壳，下文也成为“壁”。
在接种后第6天计数经口排泄的存在于肠内容物中的卵囊。
幼鼠数目：
-实验1：n＝7-15只幼鼠
-实验2(每一批n＝13)。
通过将非处理批次与每一批比较进行统计学分析(非参数的Mann Whitney检验:**p<0.01)。
结果
感染后第6天，肠内寄生虫载荷可以评价与被感染但未处理动物相比获得的保护水平。
图表示2个独立实验的结果。两个实验中，施用壁诱导了卵囊的明显减少(p<0.01)。
解释：施用酵母壳可以明显降低卵囊排泄。

Claims (7)

1.一种组合物，包含：
-至少一种主剂，选自壳聚糖和/或N-乙酰氨基葡糖，和
-用于刺激免疫力的试剂，其是酵母壳、酵母提取物、硒和芽孢杆菌属的细菌的混合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于它进一步包含选自精油、活性炭、月桂酸或其组合的抗寄生虫剂。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于它进一步包含另一种用于刺激免疫力的试剂，其是选自乳酸杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、丙酸杆菌属、片球菌属或乳球菌属的细菌、或酵母属或克鲁维酵母属的酵母、或其组合的微生物。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述硒是富含硒的酵母、完全或部分从酵母提取的硒、或其组合的形式。
5.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述精油选自大蒜精油、香茅精油、肉桂精油、百里香精油、牛至精油、茶树精油、柠檬精油、桉树精油、或其组合。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于所述精油包含大蒜精油、香茅精油、肉桂精油和百里香精油。
7.壳聚糖、N-乙酰氨基葡糖或它们的组合物或根据权利要求1-6任一项所述的组合物在制备预防和/或治疗隐孢子虫病的药物中的用途。
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