FR3115455A1 - Levure Saccharomyces Cerevisiae pour la prévention et/ou le traitement de parasitoses - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte au domaine de la prévention et/ou du traitement de parasitoses, et en particulier à la prévention et/ou du traitement de la cryptosporidiose chez l’homme et l’animal. L’invention concerne tout particulièrement les souches Saccharomyces cerevisiae déposées auprès de la CNCM sous le numéro I-4407, I-5129 et/ou I-5223, une levure vivante obtenue par culture desdites souches ou encore une composition les comprenant, pour leurs utilisations dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses.
Description
La présente invention se rapporte au domaine de la prévention et/ou du traitement de parasitoses, et en particulier à la prévention et/ou du traitement de la cryptosporidiose chez l’homme et l’animal.
Arrière-plan technologique
La cryptosporidiose est une maladie liée à un protozoaire particulier, leCryptosporidium. Il existe différentes espèces deCryptosporidiumdont certaines ne ciblent que certains animaux. A titre d’exemple,Cryptospor idium baileyi ou Cryptosporidium meleagridissont deux espèces qui touchent la volaille, alors queCryptosporidium parvumn’affecte pas la volaille mais plutôt les mammifères tels que l’homme ou les ruminants.
Particulièrement,l’espèceCryptosporidium parvumest un protozoaire parasite qui peut infecter un large éventail d'hôtes vertébrés, dont les humains et les ruminants. Chez les ruminants nouveau-nés, la cryptosporidiose est une infection très répandue et l’infection entraine une diarrhée abondante, des retards de croissance et des pertes de poids pouvant aller jusqu’à la mort des ruminants atteints.
En effet,le principal signe clinique associé à la cryptosporidiose est une diarrhée aigüe. Les autres signes cliniques associés sont notamment la déshydratation, une faiblesse intense, une perte de l’appétit et des coliques. Ces différents signes cliniques peuvent entraîner la mort, notamment cher les animaux les plus fragiles, tels que les nouveaux nés.
D’une manière générale, la cryptosporidiose a donc des conséquences économiques négatives très importantes dans les élevages, à cause de l’augmentation de la mortalité et des retards de croissance, du coût des interventions vétérinaires et des traitements qu’elle engendre, mais aussi de l’augmentation du temps de travail pour la gestion des animaux malades.
Actuellement, peu de traitement sont disponibles chez les animaux. Par exemple, l’halofuginone est le seul médicament possédant en France une autorisation de mise sur le marché pour la prévention et/ou le traitement de la cryptosporidiose chez le veau.
Toutefois, non seulement l’efficacité de l’halofuginone est partielle, mais elle présente une certaine toxicité et un risque de développement de résistance des cryptosporidies à ce composé a été reporté (voir Silverlas et al., Preventive Veterinary Medicine, 2009, 91 : 73-84).
Par ailleurs, aucun médicament n’est enregistré pour le traitement de la cryptosporidiose chez d’autres animaux, tels que le chevreau et l’agneau.
Comme mentionné précédemment, les espèces deCryptosporidiumpeuvent n’être spécifiques que de certains animaux complexifiant ainsi d’autant plus l’émergence de nouvelles solutions pour le traitement de la cryptosporidiose.
Chez les ruminants, une multitude de composés tels que l’Azithromycine, la Paromomycine, le Nitazoxanide, le Lactate d'halofuginone, ou encore le Decoquinate ont été testés contre la cryptosporidiose mais aucun d'entre eux n'a donné de résultats satisfaisants pour contrôler ou éliminer la cryptosporidiose de manière cohérente.
Dernièrement, l'utilisation de traitements alternatifs a considérablement augmenté en raison de l'augmentation mondiale de la résistance aux agents antimicrobiens, y compris les agents antiparasitaires (Dinler, C et al., 2017. Cryptosporidiosis in Ruminants: Update and Current Therapeutic Approaches. Am. J. Anim. Vet. Sci. 12, 96–103.).
Les données préliminaires obtenues à l'aide d'essais de cultures cellulaires et de souriceaux nouveau-nées infectées expérimentalement par la soucheCryptosporidium parvumIowa ont indiqué une efficacité prophylactique de certaines souches de la levure vivanteSaccharomyces cere visiae. Cependant, rien n’indique que les résultats obtenus en laboratoires avec des souriceaux sont transposables à l’échelle d’une exploitation chez des animaux, tels que le chevreau, le veau ou encore l’agneau.
Le document EP 13 818 279, dont la Demanderesse est titulaire, décrit la chitine ou des dérivés de chitine pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses. Particulièrement, il est décrit des compositions comprenant comme principe actif un agent de base choisi parmi la chitine ou un dérivé de la chitine tel que le chitosan, la N-acétyl-glucosamine ou la glucosamine. Les compositions peuvent également comprendre un agent pour stimuler l’immunité.
Ce document décrit également un exemple de traitement de la cryptosporidiose chez le chevreau par la mise en œuvre d’une composition à base d’écorces de levure, d’extrait de levures, de levure enrichie en sélénium, de levure vivante et d’un mélange d’huiles essentielles. La levure vivante correspond à la souche déposée par la Demanderesse à la CNCM sous le numéro I-4407 et est utilisée en tant qu’agent pour stimuler l’immunité. Dans les compositions de ce document le principe actif pour une utilisation dans le traitement des parasitoses est la chitine ou ses dérivés. Rien n’indique ni ne suggère que la levure vivante déposée à la CNCM sous le numéro I-4407 est efficace en tant que telle sans principe actif, et cela, aussi bien pour la prévention que pour le traitement de parasitoses telles que la cryptosporidiose.
Ainsi, bien que des solutions soient disponibles, il existe un réel besoin d’alternatives plus simples à mettre pour la prévention et/ou le traitement des parasitoses, et en particulier de la cryptosporidiose, notamment chez les animaux ruminants, et particulièrement chez les jeunes animaux ruminants. De préférence, ces solutions alternatives n’ont pas ou peu d’effets toxiques, reposent sur des composés d’origine naturelle dont l’innocuité chez l’animal est connue, et sont simples à préparer et à mettre en œuvre.
D’une façon générale, la présente invention repose sur la mise en évidence que, de manière tout à fait surprenante, l’utilisation de la souche vivante deSaccharomyces cerevisiaedéposée le 2 décembre 2010 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-4407 et/ou de la souche vivante deSaccharomyces cerevisiaedéposée le 31 août 2016 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5129 et/ou de la souche vivante deSaccharomyces cerevisiaedéposée le 30 août 2017 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5223, permettait de proposer une solution efficace dans la prévention et/ou le traitement des parasitoses répondant ainsi au besoin croissant de limiter les infections par protozoaires, notamment au sein des élevages.
Un premier objet de l’invention concerne la souche deSaccharomyces cerevisiaedéposée le 2 décembre 2010 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-4407 et/ou la souche deSaccharomyces cerevisiaedéposée le 31 août 2016 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5129 et/ou de la souche deSaccharomyces cerevisiaedéposée le 30 août 2017 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5223, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses.
L’invention concerne également des compositions utilisant comme seul principe actif des souches spécifiques deSaccharomyces cerevisiaepour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses. Ainsi, un second objet de l’invention concerne une composition comprenant une souche deSaccharomyces cerevisiaedéposée le 2 décembre 2010 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-4407 et/ou une souche deSaccharomyces cerevisiaedéposée le 31 août 2016 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5129 et/ou une souche deSaccharomyces cerevisiaedéposée le 30 août 2017 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5223, pour une utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses.
Ces compositions selon l’invention permettent notamment de réduire la mortalité chez les jeunes animaux et/ou la diarrhée. De plus, ces compositions ne contenant que les souches selon l’invention qui sont des composés d’origine naturelle, l’innocuité chez l’animal est connue aux doses conseillées d’utilisation. Par conséquent, ces compositions n’ont que peu ou pas d’effets toxiques.
Enfin, ces compositions présentent également l’avantage de pouvoir être intégrées dans des compositions alimentaires, notamment liquides, pour une utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitose, notamment chez des animaux tels des ruminants, et particulièrement chez les jeunes animaux comme les chevreaux par exemple.
Un troisième aspect de l’invention concerne une méthode de traitement de parasitoses comprenant l’administration, à un patient, d’une dose efficace de la souche deSaccharomyces cerevisiaedéposée par la Société demanderesse le 2 décembre 2010 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-4407 et/ou de la souche deSaccharomyces cerevisiaedéposée le 31 août 2016 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5129 et/ou de la souche vivante deSaccharomyces cerevisiaedéposée le 30 août 2017 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5223.
A la connaissance des inventeurs, c’est la première fois que de telles souches sont utilisées vivantes et seules et que l’effet sur la prévention et/ou le traitement de parasitose est obtenu sans la présence d’un ou plusieurs principes actifs connus.
La soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée sous le numéro I-4407 a précédemment été décrite dans la demande EP13818279, dont la Demanderesse est titulaire. Comme développée précédemment, il n’était cependant ni connu ni suggéré que cette souche puisse avoir un effet dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses même lorsqu’elle est utilisée seule, sans la présente d’aucun autre principe actif.
Description détaillée
Un premier objet de l’invention concerne donc la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée par la Société demanderesse le 2 décembre 2010 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-4407 et/ou la souche deSaccharomyces cerevisiaedéposée le 31 août 2016 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5129 et/ou la souche deSaccharomyces cerevisiaedéposée le 30 août 2017 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5223, pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses.
D’une manière tout à fait surprenante, et à l’inverse de ce qui était jusqu’alors connu, les souches selon l’invention sont utilisées seules pour la prévention et/ou le traitement de parasitoses. Par conséquent, il n’est donc pas nécessaire d’ajouter un quelconque principe actif comme la chitine ou ses dérivés tels que le chitosan, la N-acétyl-glucosamine ou la glucosamine.
La Demanderesse a donc notamment mis au point un moyen plus simple à mettre à œuvre pour la prévention et/ou le traitement de parasitoses.
L’expression « souche de levure » désigne une population relativement homogène de cellules de levure. Une souche de levure est obtenue à partir de l’isolement d’un clone, un clone étant une population de cellules obtenue à partir d’une seule cellule de levure.
La culture d’une souche de levure peut s’effectuer par n’importe quelle méthode appropriée. Les procédés de culture de levure sont connus dans l’art, et l’homme du métier sait optimiser les conditions de culture pour chaque souche en fonction de sa nature. Une levure est obtenue par culture d’une souche de levure dans un milieu de culture, par exemple comme décrit dans le livre de référence « Yeast Technology », 2ème édition, 1991, G. Reed et T.W. Nagodawithana, publié par Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
Ainsi, par exemple, à l’échelle industrielle, des cellules de levure utilisables dans le contexte de la présente invention, peuvent être obtenues par un procédé comprenant les étapes suivantes :
- culture de la soucheSaccharomyces cerevisiaeI-4407 et/ou de la souche deSaccharomyces cerevisiaeI-5129 et/ou de la soucheSaccharomyces cerevisiaeI-5223, dans un milieu de culture en plusieurs stades, d’abord en semi-anaérobiose, puis en aérobiose (milieu/atmosphère riche en oxygène) pour obtenir une multiplication des cellules de levure de départ ; et
- séparation, par centrifugation, des cellules de levure ainsi produites pour obtenir une crème de levure liquide contenant entre 12% et 25% de matière sèche levure.
- culture de la soucheSaccharomyces cerevisiaeI-4407 et/ou de la souche deSaccharomyces cerevisiaeI-5129 et/ou de la soucheSaccharomyces cerevisiaeI-5223, dans un milieu de culture en plusieurs stades, d’abord en semi-anaérobiose, puis en aérobiose (milieu/atmosphère riche en oxygène) pour obtenir une multiplication des cellules de levure de départ ; et
- séparation, par centrifugation, des cellules de levure ainsi produites pour obtenir une crème de levure liquide contenant entre 12% et 25% de matière sèche levure.
La levure ainsi obtenue est une levure vivante.
Selon un mode de réalisation, la présente invention porte sur la levureSaccharomyces cerevisiaeobtenue par culture de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la CNCM sous le numéro I-4407 et/ou la levureSaccharomyces cerevisiaeobtenue par culture de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5129 et/ou la levureSaccharomyces cerevisiaeobtenue par culture de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5223, pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses.
Dans la présente invention, on utilisera indifféremment les expressions « levure obtenue par culture de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée à la CNCM sous le numéro I-4407 ", "levure obtenue par culture de la souche I-4407 " et "levure Sc I-4407 ", ces trois termes ayant la même signification telle que donnée ci-dessus.
De même, les expressions « levure obtenue par culture de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée à la CNCM sous le numéro I-5129 ", "levure obtenue par culture de la souche I-5129 " et "levure Sc I-5129 ", ces trois termes ayant la même signification telle que donnée ci-dessus.
De même, les expressions « levure obtenue par culture de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée à la CNCM sous le numéro I-5223 ", "levure obtenue par culture de la souche I-5223 " et "levure Sc I-5223 ", ces trois termes ayant la même signification telle que donnée ci-dessus.
Selon l’invention, la levure Sc I-4407 et/ou la levure Sc I-5129 et/ou la levure Sc I-5223 sont utilisées vivantes dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses.
Pour la suite de la description, par « levure vivante selon l’invention », il est fait référence à la levure Sc I-4407, la levure Sc I-5129, la levure Sc I-5223 ou leurs mélanges à moins que le contexte ne permette d’identifier clairement qu’il s’agisse de l’une ou l’autre desdites levures.
Par levure vivante au sens de la présente invention, on entend une levure dont le métabolisme est actif ou réactivable ou capable de se multiplier, par opposition à une levure morte pour laquelle le métabolisme a été irrémédiablement arrêté.
Selon un mode de réalisation, la levure vivante selon l’invention peut se présenter sous la forme d’une levure vivante sèche ou d’une levure vivante fraîche, de préférence sous la forme d’une levure vivante sèche.
Selon un mode de réalisation préféré, la levure sèche selon l’invention est choisie par exemple parmi la levure sèche active, la levure sèche active instantanée, et la levure sèche à humidité intermédiaire surgelée ou non, de préférence la levure sèche est une levure sèche active instantanée.
On entend par levure sèche, toute levure ayant un taux de matière sèche supérieur à 90%, de préférence allant d’environ 92 à 96%. Un avantage d’une levure sèche est sa longue durée de conservation.
Une levure sèche active ou une levure sèche active instantanée selon l’invention comprend un taux de matière sèche levure supérieur à 90%, de préférence un taux de matière sèche compris de 92% à 96%.
La levure sèche instantanée présente la particularité de ne pas nécessiter de réhydratation avant d’être incorporée dans un produit. Elle provient de la déshydratation par l’action d’un gradient d’air chaud qui permet de transformer un produit pâteux (levure pressée ou liquide) en de fins vermicelles tout en restant active.
La levure sèche active peut être obtenue par déshydratation de la levure pressée ou liquide par l’action conjointe de la chaleur (à basse température) et d’une activité mécanique, qui permettent de transformer un produit pâteux (levure pressée ou liquide) en un produit sec, sous forme de sphérules, en ménageant sa viabilité.
Par exemple, la levure sèche active peut être obtenue par extrusion et séchage en lit fluidisé d’une levure pressée ou d’une levure liquide.
La levure sèche active se présente principalement sous forme de sphérules dont le diamètre peut être généralement compris de 0,1 µm à 2,5 mm et une teneur en H2O de 4% à 8% en masse.
La levure sèche active instantanée peut quant à elle être obtenue par déshydratation de la levure pressée ou liquide par l’action d’un gradient d’air chaud qui permet de transformer un produit pâteux (levure pressée ou liquide) en de fins vermicelles secs. La levure sèche instantanée doit ensuite, pour rester stable, être conditionnée en absence d’oxygène.
La levure sèche à humidité intermédiaire surgelée ou non comprend par exemple de 70% à 85% de matière sèche levure.
Selon un mode de réalisation particulier, la levure vivante selon l’invention pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses, se présentent sous forme de levure sèche active ou sous forme de levure sèche instantanée.
Les levures vivantes Sc I-4407 et/ou Sc I-5129 et/ou Sc I-5223 pour leur utilisation selon l’invention sont efficaces en tant que seul principe actif dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses. Par conséquent, les levures vivantes selon l’invention sont utilisées seules sans la présence de chitine ou des dérivés de chitine tels que le chitosan, la N-acétyl-glucosamine ou la glucosamine.
Selon un mode de réalisation préféré, les levures vivantes selon l’invention sont utilisées dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses chez l’animal. De préférence, les levures vivantes sont utilisées dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses chez le ruminant, de préférence chez le jeune ruminant, et de préférence encore, dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses chez le chevreau, le veau et l’agneau.
Selon l’invention, la levure vivante Sc I-4407 et/ou Sc I-5129 et/ou Sc I-5223 pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitose est mise en oeuvre à raison d’une dose quotidienne comprise de 1x107à 1x1011Unité Formant Colonie (UFC)/animal. De préférence, la dose quotidienne est comprise de 1x109à 1x1011UFC/animal.
Par « parasitose », on entend au sens de la présente invention une maladie liée à un protozoaire.
Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, la parasitose est la cryptosporidiose. Selon une variante de ce mode de réalisation, la cryptosporidiose est causée par le protozoaireCryptosporidium ,et de préférence par le protozoaireCryptosporidium parvum.
Ainsi, selon ce mode de réalisation, l’invention concerne la souche deSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-4407 et/ou la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5129 et/ou la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5223, pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement de la cryptosporidiose, de préférence la cryptosporidiose causée parCryptosporidium.
Selon une première variante de ce mode de réalisation, l’invention concerne la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-4407, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de la cryptosporidiose, de préférence la cryptosporidiose causée parCryptosporidium.
Selon une deuxième variante de ce mode réalisation, l’invention concerne la souche deSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5129, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de la cryptosoridiose, de préférence la cryptosporidiose causée par le protozoaireCryptosporidium.
Selon une troisième variante de ce mode réalisation, l’invention concerne la souche deSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5223, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de la cryptosoridiose, de préférence la cryptosporidiose causée par le protozoaireCryptosporidium.
Selon ce mode de réalisation particulier, l’animal est choisi parmi les ruminants, de préférence parmi les jeunes ruminants, et de préférence encore, parmi le veau, l’agneau et le chevreau.
Un second objet de l’invention concerne une composition comprenant une levure vivante Sc I-4407 et/ou une levure vivante Sc I-5129 et/ou une levure vivante Sc I-5223, pour une utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses.
La composition selon l’invention peut être une composition pharmaceutique, un complément nutritionnel à effet santé ou éventuellement une composition alimentaire.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition comprenant la levure vivante selon l’invention, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses comprend également au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Comme mentionnée précédemment, l’effet sur la prévention et/ou le traitement de parasitoses est obtenu par la seule présence des levures vivantes selon l’invention. Par conséquent, la composition selon l’invention est exempte de tout autre composé ou principe actif, à l’exception des excipients pharmaceutiquement acceptables. Ainsi, la composition pour son utilisation selon l’invention est notamment exempte de chitine ou des dérivés de chitine tels que le chitosan, la N-acétyl-glucosamine ou la glucosamine.
Selon un mode de réalisation particulier, la parasitose est la cryptosporidiose. Selon une variante de ce mode de réalisation, la cryptosporidiose est causée par le protozoaireCryptosporidium ,et de préférence par le protozoaireCryptosporidium parvum.
Ces compositions utilisées selon l’invention permettent notamment de réduire la mortalité chez les jeunes animaux et/ou la diarrhée. De plus, ces compositions ne contenant que les souches selon l’invention qui sont des composés d’origine naturelle, l’’innocuité chez l’animal est connue aux doses conseillées d’utilisation. Par conséquent, ces compositions n’ont que peu ou pas d’effets toxiques.
Enfin ces compositions présentent également l’avantage de pouvoir être intégrées dans des compositions alimentaires, notamment liquides, pour une utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitose, notamment chez des animaux tels des ruminants, et particulièrement chez les jeunes ruminants, comme par exemple le chevreau, le veau ou l’agneau.
Un troisième aspect de l’invention concerne une méthode de traitement de parasitoses comprenant l’administration, à un patient, d’une dose efficace de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-4407 et/ou de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5129 et/ou de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-5223.
Les levures vivantes Sc I-4407, Sc I-5129 et Sc I-5223 sont telles que définies précédemment.
De préférence, le patient est un animal. De préférence encore, l’animal est choisi parmi un jeune ruminant, et tout préférentiellement, le jeune ruminant est le chevreau, l’agneau ou le veau.
Selon un mode de réalisation particulier, la parasitose est la cryptosporidiose. Selon une variante de ce mode de réalisation, la cryptosporidiose est causée par le protozoaireCryptosporidium, et de préférence parCryptosporidium parvum.
Brève description des figures
D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à l’analyse des figures annexés, sur lesquels :
Fig. 1
Fig. 2
Fig. 3
Fig. 4
Fig. 5
Fig. 6
Fig. 7
Fig. 8
Fig. 9
Fig. 10
Fig. 11
Fig. 12
Exemples
Exemple
1 : Inhibition
i
n
v
itro
de la charge parasitaire
induite par
C.
p
arvum.
Cet exemple a pour objectif de démontrer via un modèle cellulaire l’efficacité des souches selon l’invention pour la diminution de la charge parasitaire induite parC. parvum.
Matériel et méthodes
Parasites :
Les oocystes deC. parvum(souche Iowa, Waterborne Inc., New Orleans, Louisiane, USA) ont été utilisés dans cette étude.
Produits testés
:
La levure vivante obtenue par culture de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la CNCM sous le numéro I-4407 (Sc I-4407) a été testée pour cet exemple, et se présente sous la forme d’une levure sèche instantanée.
Le sulfate de paromomycine (Olon S.p.A., Milano, Italie), considéré comme une molécule de référence pour son effet « anti-cryptosporidien » (Schupfner et al., 2013), a été utilisé dans cette étude comme « témoin positif ».
Ces deux produits ont été testés à la concentration de 500 µg/mL, équivalent à 1010CFU/g de produit.
M
ode
O
pératoire
:
Les cultures cellulaires ont été effectuées dans des plaques de culture de 12 puits (Nunc, France). Deux types d’expériences ont été réalisés :
A.Effet de la levure vivante sur des cellules infectées parCryptosporidium: Les cultures cellulaires ont été toutes infectées avec 104oocystes deC. parvumlorsqu’elles étaient à 70 % de confluence.
La confluence doit s’entendre pour le pourcentage de la surface couverte par les cellules en culture/surface totale du puit de culture.
Après 48 heures d’incubation, à l’exception du témoin négatif de l’action « anti-cryptosporidienne », la levure vivante Sc I-4407 a été testée à différentes concentration : 250, 500 et 1000 µg/mL.
B.Effet direct de la levure vivante pré-incubée avec des oocystes deC. parvum: 104oocystes deC. parvumont été incubés avec 500 µg/mL de levure vivante Sc I-4407.
Pour les deux expériences (A et B), et après 48 heures d’incubation, les formes intracellulaires deCryptosporidiumont été marquées avec un anticorps polyclonal spécifique conjugué à la fluorescéine (Sporo-Glo, Waterborne inc., New Orleans, LA, USA).
La numération des cryptosporidies a été faite sur 6 lignes horizontales (chaque ligne horizontale correspond à 50 champs microscopiques aléatoires).
Les témoins négatifs ont été définis comme étant 100 % du développement parasitaire. Le pourcentage moyen de formes intracellulaires a été utilisé pour montrer l'intensité de l'infection.
Analyse statistique :
L'analyse statistique a été réalisée avec GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, CA, USA) pour l'étude de l'effet « anti-cryptosporidien » de la levure vivante Sc I-4407in vitroetin vivo. Le t test de Student ou le test de Mann-Whitney a été utilisé pour comparer l’intensité d’infection entre le témoin et les différents produits (Sulfate de paromomycine et la levure vivante Sc I-4407). Une différence a été considérée comme significative pourP<0,05.
Résultats
Comme le montre la , la levure vivante Sc I-4407 réduit significativement (P = 0,0016) de 55 % le pourcentage de cryptosporidies intracellulaires par rapport au témoin, tout comme le sulfate de paromomycine.
Cet exemple démontre bien l’effet anti-cryptosporidien de la levure Sc I-4407 selon l’invention et par conséquent, son efficacité dans le traitement de la cryptosporidiose.
Exemple 2 : Inhibition
in vivo
chez la souris de la charge parasitaire induite par
C.
p
arvum.
Matériel et méthodes
Parasites :
Les oocystes deC. parvum(souche Iowa, Waterborne Inc., New Orleans, Louisiane, USA) ont été utilisés dans cette étude.
Produits testés :
La levure vivante obtenue par culture de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la CNCM sous le numéro I-4407 (Sc I-4407) a été testée pour cet exemple. Le sulfate de paromomycine (Olon S.p.A., Milano, Italie), considéré comme une molécule de référence pour son effet « anti-cryptosporidien » (Schupfner et al., 2013), a été utilisé dans cette étude comme « témoin positif ».
Ces deux produits ont été testés à la concentration de 1 mg (5,3.104CFU)/ inoculation/animal.
Mode opératoire
Les souris CD-1 (Charles River, France) utilisées dans cette étude ont été maintenues dans des isolateurs durant toutes les expériences. Ces expérimentations ont été approuvées par le Comité d'éthique régional français numéro 16 Anses / ENVA / UPEC (Projet numéro 14/04 / 15-4B) et par le Ministère de l'Éducation Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche de France.
Le modèle de souriceau CD-1 est un modèle extrapolable à l’infection naturelle des ruminants domestiques nouveau-nés (agneaux, chevreaux et veaux) (Martín-Gómez et al., Parasitol Res (2006) 99: 1. https://doi.org/10.1007/s00436-005-0055-12006).
Les souriceaux âgés de 5 jours ont été infectés expérimentalement par gavage œsophagien avec 105oocystes/animal deC. parvum, en utilisant des tubes d'alimentation en plastique (Phymep 22-25, France).
Les souriceaux ont été inoculés avec 1 mg de levure vivante Sc I-4407 par gavage à J-1, J+1 et J+4 post-infection (PI). Le sulfate de paromomycine a été utilisé comme témoin positif à la même dose (1 mg / inoculation).
Le lot témoin non traité a été inoculé avec le diluant dans lequel les produits ont été dispersés (eau désionisée). Les animaux ont été euthanasiés par dislocation cervicale à J+8 PI. Le tractus intestinal, du duodénum au rectum, de chaque animal a été retiré individuellement, entièrement ouvert par une excision longitudinale et son contenu a été suspendu dans une solution de PBS (Phosphate Buffered Saline).
L’intensité d’infection a été mesurée par deux techniques :
(1). Par comptage du nombre d’oocystes dans l’intestin en utilisant le kit Merifluor®Cryptosporidium / Giardia(Meridian Bioscience, Milan, Italie).
(2). Par le comptage de formes intracellulaires deCryptosporidiumà partir de coupes histologiques d’iléon enrobées dans la paraffine en utilisant le kit (Sporo-Glo, Waterborne inc., New Orleans, LA, USA).
(1). Par comptage du nombre d’oocystes dans l’intestin en utilisant le kit Merifluor®Cryptosporidium / Giardia(Meridian Bioscience, Milan, Italie).
(2). Par le comptage de formes intracellulaires deCryptosporidiumà partir de coupes histologiques d’iléon enrobées dans la paraffine en utilisant le kit (Sporo-Glo, Waterborne inc., New Orleans, LA, USA).
Analyse statistique :
L'analyse statistique a été réalisée avec GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, CA, USA) pour l'étude de l'effet « anti-cryptosporidien » de la levure vivante Sc I-4407in vitroetin vivo. Le t test de Student ou le test de Mann-Whitney a été utilisé pour comparer l’intensité d’infection entre le témoin et les différents produits (Sulfate de paromomycine et la levure vivante Sc I-4407). Une différence a été considérée comme significative pourP<0,05.
Résultats
Comme le montre la , la levure vivante Sc I-4407 réduit significativement (P < 0,0001) le pourcentage d’oocystes de C. parvum dans l’intestin par rapport au témoin de 60%.
A partir de la , la levure Sc I-4407 réduit significativement (P < 0,0001) de 57 % le pourcentage de formes intracellulaires des cryptosporidies par rapport au témoin.
Cet exempleinvivo sur le modèle des souriceaux CD-1 confirme les résultatsin vitrode l’exemple 1. La mise en œuvre de la levure Sc I-4407 selon l’invention permet ainsi de réduire la charge parasitaire des souriceaux traités et ce modèle est extrapolable à d’autres animaux tels que l’agneau, le chevreau ou le veau.
Cet exemple démontre ainsi l’effet de levures vivantes Sc I-4407 selon le traitement de la cryptosporidiose chez les animaux.
Exemple
3
:
test
in vivo
de l’effet des souches
Saccharomyces cerevisiae
pour la prévention de la cryptosporidiose induite chez le chevreau
.
L'objectif de cet exemple de mettre en évidence l'efficacité clinique et microbiologique de la supplémentation en levure vivante deSaccharomyces cerevisiaecontre l'infection expérimentale parC. parvumchez le chevreau.
Le modèle expérimental des chevreaux est un modèle de choix pour l'étude de la cryptosporidiose pour plusieurs raisons :
- ils sont petits comparativement à d’autres modèles tels que le veau ; ils peuvent tous être regroupés en un seul groupe, exprimant ainsi un grand nombre de comportements sociaux.
- Contrairement au modèle murin qui reste asymptomatique, ce modèle reproduit exactement les signes cliniques observés chez l'homme et le veau.
- Les nouveau-nés ont l'avantage majeur d'être moins coûteux à utiliser comme modèle pour produire un grand nombre d'oocystes et pour illustrer la pathogenèse des infections cryptosporidiennes.
Ainsi, ce modèle a été recommandé et utilisé pour évaluer le potentiel thérapeutique ou prophylactique (Petermann et al., 2014. Efficacy of halofuginone lactate against experimental cryptosporidiosis in goat neonates. Vet. Parasitol. 202, 326–329).
- ils sont petits comparativement à d’autres modèles tels que le veau ; ils peuvent tous être regroupés en un seul groupe, exprimant ainsi un grand nombre de comportements sociaux.
- Contrairement au modèle murin qui reste asymptomatique, ce modèle reproduit exactement les signes cliniques observés chez l'homme et le veau.
- Les nouveau-nés ont l'avantage majeur d'être moins coûteux à utiliser comme modèle pour produire un grand nombre d'oocystes et pour illustrer la pathogenèse des infections cryptosporidiennes.
Ainsi, ce modèle a été recommandé et utilisé pour évaluer le potentiel thérapeutique ou prophylactique (Petermann et al., 2014. Efficacy of halofuginone lactate against experimental cryptosporidiosis in goat neonates. Vet. Parasitol. 202, 326–329).
Matériel et méthodes
Parasites :
Les oocystes deC. parvum(souche Iowa, Waterborne Inc., New Orleans, Louisiane, USA) ont été utilisés dans cet exemple. Ils ont été purifiés à partir de veaux infectés et utilisés dans les 4 mois suivant leur purification.
Souches
utilisée
s :
Deux souches vivantes deSaccharomyces c erevisiaeont été utilisées :
La souche vivante Sc I-4407 à une concentration de 1,2x1010CFU/animal.
La souche vivante Sc I-5129 à une concentration de 1,94x1010CFU/animal.
Protocole expérimental :
Toutes les expériences ont été réalisées conformément à la directive européenne (2010/63/UE), et approuvées par le comité d'éthique du Val de Loire (CEEA Val de Loire n° 19, dossier n° 2017120708306306306.V3 - 12556). Du matériel d'enrichissement a été mis à la disposition des chevreaux pour assurer leur bien-être.
Quarante chevreaux mâles français âgés d'un jour ont été sélectionnés au hasard dans des élevages connus pour ne pas avoir présenté d’épisode de cryptosporidiose dans les années précédant l’essai.
La présence fécale d'oocystes deCryptosporidiuma été vérifiée à l'aide des techniques d’immunofluorescence et de PCR quantitatives (qPCR) décrites ci-dessous à partir des matières fécales des chèvres mères le jour de la séparation avec leur chevreau sélectionné pour l’essai.
Les chevreaux ont été séparés de leur mère immédiatement après la naissance et nourris trois fois avec du colostrum chauffé 1h à 56°C pour prévenir l'arthrite-encéphalite virale caprine (CAEV).
Les chevreaux âgés d’un jour ont été transportés dans les locaux expérimentaux (Plateforme d'infectiologie expérimentale de niveau de biosécurité 3, UE-1277-PFIE de l'INRA de Nouzilly) où ils ont été répartis au hasard en 4 groupes (n=10 dans chaque groupe) au sein de la même pièce mais dans des enclos séparés :
Groupe 1 (contrôle) : chevreaux non infectés parC. parvum,
Groupe 2 : chevreaux infectés avecC. parvum,
Groupe 3 : chevreaux infectés parC. parvumet supplémentés avec la souche vivante I-5129,
Groupe 4 : chevreaux infectés parC. parvumet supplémentés avec la souche vivante I-4407.
Les animaux ont été nourrisad libitumavec un lait commercial non médicamenteux (Nectagneau® : 150g pour 850 ml d'eau) pendant toute la durée de l'expérience.
Au cours de la première semaine, les chevreaux ont été entraînés à l'alimentation artificielle. Les chevreaux des groupes 3 et 4 ont reçu 1 g de levure vivante diluée dans 5 ml de lait non médicamenteux individuellement, par voie orale à l'aide d'une seringue 4 heures avant l'infection (J0).
Les chevreaux des groupes non traités par les souches de levures vivantes selon l’invention (groupes 1 et 2) ont reçu individuellement un placebo de 5 ml du lait non médicamenteux selon le même mode d’administration.
Pour l’infection, àJ0,les chevreaux des groupes 2, 3 et 4 ont reçu par voie orale individuellement 106oocystes de la souche C.parvumIowa (diluée dans 5 mL d'eau stérile).
En tant que contrôle, les chevreaux du groupe 1 ont reçu à J0, par voie orale et individuellement, 5 mL d'eau distillée.
La supplémentation avec la levure vivante (groupes 3 et 4) a été répétée tous les jours durant toute la durée de l’expérience (J25).
Examen clinique, notation et échantillonnage :
Des enregistrements continus et individuels de la température interne des chevreaux ont été effectués par la capsule Anipill® pendant toute la durée de l'expérience. Cette méthode de mesure est non-invasive pour les chevreaux. Les chevreaux ont reçu la capsule par voie orale dès leur arrivée sur la plate-forme à J0.
Les données sur l'état de santé général et l’état d'hydratation ont été enregistrées pendant toute la durée de l'étude sur une base quotidienne à partir de la grille de notation décrite chez le veau (Stebbins, E., et al. 2018. Clinical and microbiologic efficacy of the piperazine-based drug lead MMV665917 in the dairy calf cryptosporidiosis model. PLoS Negl. Trop. Dis. 12) et adaptée comme suit:
1. Normal,
2. moyennement déprimé/déshydraté,
3. sévèrement déprimé/déshydraté.
Le poids et le taux de mortalité ont été enregistrés lors de l'examen clinique quotidien. Les chevreaux comateux ou en très mauvaise santé générale ont été euthanasiés.
Les excréments de chaque chevreau ont été recueillis quotidiennement à l'aide d'un système de culotte conçu à partir d'un sac en plastique que les chevreaux portaient en permanence.
Les sacs ont été enlevés et remplacés dès lors qu’il y avait suffisamment de matières fécales. Chaque sac a été clairement identifié (groupe / chevreau / jour).
Les échantillons de fèces prélevés ont été conservés jusqu'à leur utilisation soit à 4°C pour évaluer la charge parasitaire, soit à -80°C pour étudier le microbiote fécal.
Consistance fécale et excrétion d'oocystes :
La consistance fécale a été évaluée sur une échelle de 0 à 4. 0 : selle normale, sans mucus ; 1 : pâteuse et épaisse, moulée ou non, glacé ; 2 : crémeuse ; 3 : semi-fluide ; 4 : liquide. Un score moyen de consistance fécale a été calculé quotidiennement pour chaque groupe.
0,25 g de fèces de chaque chevreau ont été analysés pour déterminer l'excrétion quotidienne d'oocystes deC. parvum.Cette quantité a été mise soit en suspension directement dans 10 mL de tampon PBS, soit concentrée via une concentration éther diéthylique - PBS telle que décrite précédemment (Castro-Hermida, J.A et al., 2005. Prevalence of Giardia duodenalis and Cryptosporidium parvum in goat kids in western France. Small Rumin. Res. 56, 259–264) et dont le culot a été remis en suspension dans l'eau distillée jusqu'à 400 µL.
Les oocystes deCryptosporidiumont été détectés à partir de 10 µL de solution d'oocystes non concentrée par un dosage d’immunofluorescence directe (IFA) en utilisant le dosage d’immunofluorescence commercial MerifluorCryptosporidium/Giardia(Meridian Diagnostics, Inc., Milano, Italie) suivant les recommandations du fabricant et avec quelques modifications telles que décrites par Mohamed Mammeri et al., 2018 (Cryptosporidiumimmunolabeling in paraffin-embedded ileum of CD-1 neonatal mice. Global science research journals 6, 197–202).
Les lames colorées ont été examinées au microscope fluorescent Leica à l'aide du logiciel Leica Application Suite (version 4.5.0 ; Leica Microsystems ; Inc., Suisse).
La technique PCR quantitative (qPCR) a également été utilisée pour quantifier la charge parasitaire des chevreaux à J0 post-infection (PI), de J+2 à J+13 PI, à J+15 PI et à J+20 PI.
L'ADN génomique a été extrait à partir de 200 μL des oocystes concentrés ou des oocystes non concentrés à l'aide du QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen, France) selon les instructions du fabricant.
Brièvement, les échantillons ont été suspendus dans le tampon de lyse et les oocystes ont été rompus en les soumettant à une étape initiale supplémentaire de 10 cycles de congélation-décongélation (congélation dans l'azote liquide pendant 1 minute et chauffage au bain-marie à 90˚C pendant 1 minute) avant de procéder à l'extraction d'ADN. L'ADN a ensuite été stocké à -20°C jusqu'à ce qu'il soit utilisé en analyse moléculaire. Ensuite, le gène COWP a été amplifié par qPCR.
La charge parasitaire a été évaluée en calculant le nombre d'oocystes deCryptosporidiumpar gramme de fèces (OPG) qui a été obtenu en multipliant le nombre total d'oocystes par le facteur de dilution.
Analyse génétique d'une souche de l'Iowa :
La caractérisation moléculaire de la soucheC. parvumIowa a été effectuée avant l'utilisation et après chaque passage sur au moins trois chevreaux de chaque groupe infecté (groupes 2, 3 et 4).
Cette caractérisation moléculaire garantit que les animaux n'ont pas été infectés par une autre espèce deCryptosporidiumou une autre souche deC. parvum. L'ADN génomique a également été extrait de la soucheC. parvumIowa utilisée pour infecter les chevreaux, comme décrit ci-après.
L'ADN génomique extrait soit d'oocystes utilisés pour infecter les chevreaux, soit de chevreaux infectés 5 jours post-infection (3 animaux pour chacun des groupes 2, 3 et 4) a été analysé par PCR nichée en ciblant la sous-unité du fragment du gène 18S rRNA comme décrit précédemment ( Xiao, L. et al., 1999, Genetic Diversity within Cryptosporidium parvum and Related Cryptosporidium Species. Appl. Environ. Microbiol. 65, 3386–3391). Les produits d'amplification ont ensuite été visualisés par électrophorèse dans des gels d'agarose à 2 % colorés au bromure d'éthidium.
Des espèces deCryptosporidiumont été détectées à partir de produits 18S SSU-rRNA positifs par analyse du polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP) en utilisant deux endonucléases SspI et MboII (New England BioLabs, France) comme décrit précédemment (Feng, Y. et al., 2007. Wide geographic distribution of Cryptosporidium bovis and the deer-like genotype in bovines. Vet. Parasitol. 144, 1–9.).
Les produits d'amplification ont ensuite été visualisés par électrophorèse sur gels d'agarose à 3 % (MetaPhor - Ozyme, France) colorés au bromure d'éthidium.
Les échantillons deC. parvumont été sous-typés par analyse de séquence PCR nichée du locus glycoprotéine 60 kDa (gp60) comme décrit précédemment (Gatei, W et al., 2006. Development of a multilocus sequence typing tool for Cryptosporidium hominis. J. Eukaryot. Microbiol. 53 Suppl 1, S43-48). Les produits d'amplification ont ensuite été visualisés par électrophorèse dans des gels d'agarose à 2% colorés au bromure d'éthidium.
Dans chaque réaction PCR, un échantillon témoin positif et un échantillon témoin négatif ont été inclus.
Le témoin positif était de l'ADN extrait de 106oocystes de la soucheC. parvum Iowa(Waterborne Inc., New Orleans, Louisiane, Etats-Unis). Le témoin négatif était de l'eau purifiée.
Analyse de séquence d'ADN :
Les produits de PCR des deux gènes cibles (ARNr 18S et gp60) ont été séquencés dans les deux directions par Eurofins Genomics (France) et Genoscreen (France).
Les séquences consensuelles ont été éditées à l'aide du logiciel BioEdit Sequence Alignment Editor puis ont été comparées entre elles et avec les séquences publiées dans GenBank disponibles dans le Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) via le National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Les sous-types deC. parvumont été reconnus en fonction du nombre de répétitions de trinucléotides (TCA ou TCG) ou de rares répétitions (R) dans la séquence de glycoprotéines 60 kDa comme décrit précédemment (Sulaiman et al., 2005).
Examen
h
istopathologique :
À la fin de l'expérience, des chevreaux ont été tués par injection intraveineuse d'une dose létale de pentobarbital (10 mL par animal) après une injection intramusculaire de zoletil®50 à raison de 20 mg/kg. Des échantillons d’iléon pour l’examen histopathologique ont été prélevés immédiatement après la mort naturelle ou l'euthanasie des chevreaux.
Les échantillons ont été fixés dans du formol neutre tamponné à 10 % pendant une semaine, puis stockés dans de l'éthanol à 70 % avant d'être traités par des méthodes histologiques de routine.
Brièvement, les échantillons ont été enrobés de paraffine et les blocs ont été coupés en sections de 5 μm. Pour chaque portion, deux lames contenant 3 sections espacées de 1 cm ont été réalisées : une lame a été colorée avec de l'hématoxyline classique et de l'éosine (HES) puis examinée au microscope optique selon les procédures standards.
Pour la vérification spécifique des cryptosporidies, la deuxième lame a été colorée par immunofluorescence (IF) en utilisant un anticorps monoclonal conjugué FITC commercial (Sporo-Glo™, Waterborne™ Inc, New Orleans, USA) comme décrit précédemment (Mammeri, M., et al., 2018. Cryptosporidium immunolabeling in paraffin-embedded ileum of CD-1 neonatal mice. Global Science Research Journals 6, 197–202).
Les coupes IF ont été utilisées pour compter les parasites endogènes tandis que les coupes HES ont été utilisées principalement pour observer les changements pathologiques.
Analyse des données et méthodes statistiques :
Les données ont été analysées et les graphiques ont été édités pour la préparation des figures à l'aide du logiciel GraphPad Prism version 5.00 (GraphPad Software, CA, USA). Les données ont été exprimées en moyenne ± écart-type.
Des analyses de variance (ANOVA), ou des tests de Bonferroni, de Student et de Kruskal-Wallis ont été utilisés pour analyser les données.
Les résultats de température ont été comparés en utilisant un modèle linéaire en données répétées (modèle mixte) ANOVA, suivi par un post-test afin de comparer les groupes entre eux.
La comparaison des courbes de survie a été effectuée à l'aide du test Mantel-Cox khi2. Les valeurs de P < 0,05 ont été jugées statistiquement significatives.
Résultats
Santé des
chevreaux
e
t caractérisation moléculaire de
Cryptosoridium
Des résultats négatifs ont été obtenus à partir d'excréments des chèvres mères par les techniques d’IF et de qPCR. De plus, aucun changement génétique de la souche de l'Iowa n'a été observé tout au long de l’essai sur les chevreaux.
Cette souche a été caractérisée comme espèce deC. parvumpar séquençage partiel de 18S rRNA et RFLP, et affectée au sous-genotype IIaA17G2R1 par séquençage d'un locus codant pour la glycoprotéine gp60. Aucune autre espèce deCryptosporidiumou une autre souche deC. parvumn'a été détectée.
Mortalité :
Des morts (euthanasiés en raison d'une maladie grave ou trouvés morts) ont été observés dans tous les groupes. Les taux de mortalité ( ) étaient inférieurs d'environ 10 % (1/10) pour le groupe témoin non infecté (groupe 1) et le groupe 4 (P = 0,9703) et d’environ 80 % (8/10) pour les groupes 2 et 3 (P = 0,6781) à la fin de l'expérience (J+26 PI).
Poids
:
Aucune différence statistique n'a été observée entre les différents groupes depuis le début de l'expérience (D0) jusqu'à J+6 PI (résultats non présentés).
Ensuite, le groupe témoin non infecté et le groupe 4 ont montré une croissance continue, tandis que le groupe 2 et le groupe 3 ont montré une perte de poids nette jusqu'au J+11 PI, puis ont repris leur croissance.
A la fin de l'expérience, le groupe non infecté et le groupe 4 présentaient le poids le plus élevé comparativement aux autres groupes.
Température :
La température physiologique a été enregistrée pour tous les groupes depuis le début de l'expérience jusqu’au J+25 PI. La température est restée normale pendant toute l'expérience pour les groupes 1 et 4, sans différence significative entre ces deux groupes.
En revanche, l'hypothermie a été enregistrée dans le groupe 2 avec une différence significative avec le groupe 1 du J+3 PI au J+8 PI, puis de J+14 PI à J+16 PI. La même observation a été faite avec le groupe 3 seulement au J+6 PI.
Score d'hydratation :
Pour le groupe témoin non infecté et le groupe 4, le score d'hydratation était normal sans différence significative entre ces deux groupes tout au long de l'expérience ( ). Pour le groupe infecté, ce score augmente du J+1 PI jusqu’au J+11 PI, puis au J+18 PI (différence significative avec le groupe témoin non infecté).
Dans le groupe 3, ce score augmente significativement par rapport à celui du groupe témoin non infecté seulement au J+6 PI, J+8 PI et au J+9 PI avant de diminuer.
Score fécal :
Les fèces sont rapidement devenues liquides dans les groupes infectés, avec des traces de mucus, et ont changé de couleur, passant du brun au jaune. Les résultats du score fécal ( ) montrent que la supplémentation par les souches vivantes selon l’invention a réduit la diarrhée dans les deux groupes traités.
Cette réduction était significative avec la souche I-4407 pendant presque toute l'expérience.
La diarrhée dure significativement plus longtemps dans les groupes infectés (2, 3 et 4) que dans le groupe témoin non infecté ( ). De plus, la durée de la diarrhée est moins importante (différence statistique) dans les deux groupes traités 3 et 4 que dans le groupe témoin infecté (groupe 2).
Cela indique que la supplémentation en levure vivante a réduit la durée de la diarrhée, avec un effet plus important de la souche I-4407.
Score de santé :
Les animaux du groupe témoin infecté avaient moins d'appétit et sont rapidement devenus léthargiques. Leur score de santé ( ) augmente du J+2 PI au J+11 PI, puis au J+15 PI, J+16 PI et au J+20 PI.
La même observation a été rapportée pour le groupe 3 où le score de santé a augmenté de façon significative (par rapport au groupe non infecté) du J+6 PI au J+11 PI. Un score normal a été rapporté pour le groupe 4 sans différence significative avec le groupe témoin non infecté tout au long de l'expérience.
Dynamique de l'infection
Les premiers résultats de la dynamique de l'infection ont été obtenus pendant toute l'expérience en utilisant la technique d’immunofluorescence à partir d'oocystes non concentrés ( ).
L'excrétion d'oocystes a commencé au J+4 PI dans le groupe témoin infecté avec un pic au J+5 PI, avant de devenir indétectable à partir du J+12 PI.
L'excrétion d'oocystes dans les groupes infectés et supplémentés en levure vivante a également commencé J+4 PI. Cependant, les chevreaux ont excrété significativement moins d'oocystes (jusqu'au J+9 PI) que dans le groupe témoin infecté.
Ensuite, l'excrétion des oocystes diminue dans tous les groupes infectés jusqu'au J+12 PI avant de devenir indétectable jusqu'à la fin de l'expérience. Letableau 1présente le pourcentage de réduction de l'infection dans ces groupes 3 et 4 par rapport au groupe témoin utilisant l’immunofluorescence.
| Oocystes non-concentrés | ||
| Jours post-infection (JPI) | Groupe 4 (%) | Groupe 3 (%) |
| 3 | 100 (n= 8**) | 100 (n= 9*) |
| 4 | 99,78 (n= 8**) | 90,62 (n= 10) |
| 5 | 97,26 (n= 8**) | 80,80 (n= 9) |
| 6 | 97,59 (n= 10) | 73,99 (n= 10) |
| 7 | 89,25 (n=10) | 66,27 (n= 7) |
| 8 | 83,18 (n=10) | 33,87 (n= 5*) |
| 9 | 93,82 (n=10) | 61,19 (n= 5) |
| 10 | 90 (n=10) | 99,48 (n= 4) |
| 11 | 92,44 (n=10) | 54 (n= 3) |
| 12 | 29,29 (n=9*) | 100 (n= 2) |
| 15 | 100 (n= 9) | 100 (n= 2) |
Les astérisques indiquent l’impossibilité d’obtenir des excréments de chevreaux. * : un chevreau manquant, ** : deux chevreaux manquants. Les données sont exprimées en pourcentages d’oocystes moyen par rapport au groupe non traité (100%).
Bien que la supplémentation avec la souche I-5129 soit efficace en ce qui concerne l’excrétion des oocystes, ces résultats montrent que la supplémentation avec la souche I-4407 a été encore plus efficace et réduit l’infection de plus de 90 % pendant toute la durée de l'expérience.
En ce qui concerne la période prépatente ( ), les animaux des groupes supplémentés (groupes 3 et 4) présentent une excrétion plus tardive des oocystes par rapport au groupe témoin infecté utilisant l’immunofluorescence à partir uniquement d'oocystes non concentrés.
De plus, pour le groupe 4, cette supplémentation réduit significativement la durée de l'excrétion des oocystes ( ).
Le nombre cumulé d'oocystes excrétés montre que l'excrétion est significativement réduite dans les groupes 3 et 4 ( ) au J+8 PI (où il y a au moins 3 animaux par groupe).
Comme présenté dans le tableau 2 ci-dessous, la supplémentation avec les deux levures vivantes selon l’invention réduit significativement le taux d'excrétion d'oocystes sur les 8 premiers jours de supplémentation (P<0,05).
| infection + supplémentation avec I-5129 | Infection + supplémentation avec I-4407 | ||
| Détection des oocystes |
NC + IF C + IF |
84% 87% |
96% 97% |
Discussion
L'objectif de cet exemple était l'effet préventif d'une supplémentation avec des levures vivantes selon l’invention chez des chevreaux expérimentalement infectés par 106oocystes deC. parvum(souche Iowa).
Seule la présence d'espèces deC. parvuma été détectée, et d'un seul sous-type également utilisé pour l’infection expérimentale des animaux. De plus, ceci confirme que les chevreaux étaient réellement exempts de cryptosporidiose (principalement la souche sauvage deC. parvum) avant d'être infectés lors du test expérimental.
L’exemple démontre que la supplémentation quotidienne en levure I-4407 ou I-5129 pendant la période de pré-sevrage du nouveau-né a modifié de façon significative l'évolution de la cryptosporidiose.
L'intensité de l'excrétion d'oocystes était plus faible. Il y avait moins de diarrhées dans les groupes supplémentés avec les deux souches vivantes selon l’invention et un taux de mortalité plus faible dans les groupes supplémentés avec la souche de levure vivante I-4407 comparativement au groupe témoin infecté et non supplémenté en souches vivantes.
De plus, dans les groupes supplémentés avec la souche de levure vivante I-4407 selon l’invention, l'excrétion des oocystes a commencé plus tardivement et la durée de l'excrétion a été plus courte que dans le groupe témoin.
Enfin, la supplémentation selon l’invention semble permettre un meilleur contrôle de la maladie et prévenir la reprise de l'excrétion parasitaire (phénomène de rebondissement).
La souche de levure vivante I-4407 également permis d’obtenir un gain de poids plus important chez les chevreaux en comparaison aux chevreaux infectés n’ayant pas reçu la supplémentation par lesdites souches vivantes.
A l’inverse de ce qui était jusqu’à présent connu pour le decoquinate (Mancassola, R., et al. 1997. Evaluation of decoquinate to treat experimental cryptosporidiosis in kids. Vet. Parasitol. 69, 31–37.) et le lactate d’halofuginone (Petermann, J., et al. Efficacy of halofuginone lactate against experimental cryptosporidiosis in goat neonates. Vet. Parasitol. 202, 326–329), l’administration des souches vivantes selon l’invention est bénéfique sur le gain de poids.
Les produits généralement utilisés dans la prévention de la cryptosporidiose présentent plusieurs inconvénients.
Par exemple, l'administration de nitazoxanide entraîne des effets secondaires dus à une toxicité aiguë ressemblant à des symptômes de cryptosporidiose (Viel, H et al. 2007. Efficacy of nitazoxanide against experimental cryptosporidiosis in goat neonates. Parasitol. Res. 102, 163–166.), un effet de rebond rapide (ré-excrétion d’oocystes) est observé après arrêt du traitement avec α-cyclodextrine (Castro-Hermida, J.A et al., 2004a. Efficacy of α-cyclodextrin against experimental cryptosporidiosis in neonatal goats. Vet. Parasitol. 120, 35–41). Ces inconvénients ne sont pas observés par l’utilisation des souches vivantes selon l’invention.
Contrairement à de nombreux produits inefficaces (Dinler, C., et al. 2017. Cryptosporidiosis in Ruminants: Update and Current Therapeutic Approaches. Am. J. Anim. Vet. Sci. 12, 96–103), l'utilisation des souches vivantes selon l’invention ne présente aucun risque de toxicité, lesdites souches pouvant être administrées pendant toute la période néonatale de risque de diarrhée (4 semaines).
Ainsi, l’administration des levures vivantes selon l’invention dans l'alimentation des ruminants se trouve être une alternative de choix pour réduire l'utilisation de drogues synthétiques dans le contrôle de la cryptosporidiose et pour maintenir les performances de croissance des animaux.
En plus d'être économiquement avantageux, le contrôle de la cryptosporidiose permet également de réduire les risques de transmission zoonotique par les ruminants chez l’homme.
En conclusion, l'efficacité de la supplémentation en souches vivantes selon l’invention présentée dans le présent exemple démontre bien que l’utilisation des souches vivantes I-4407 et I-5129 est une alternative appropriée et attrayante pour les agriculteurs pour la prévention et/ou le traitement de la cryptosporidiose chez les jeunes animaux.
L’exemple 3 a été reproduit dans les mêmes conditions mais en remplaçant la souche vivante I-5129 par la souche vivante I-5223. Les résultats obtenus (non présentés ici) avec la souche vivante I-5223 sont strictement identiques à ceux obtenus avec la souche I-5129 et permettent d’aboutir aux mêmes conclusions.
Claims (7)
- SoucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la CNCM sous le numéro I-4407 et/ou soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5129 et/ou soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5223, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses.
- Levure vivante obtenue par culture de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la CNCM sous le numéro I-4407 et/ou obtenue par culture de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5129 et/ou obtenue par culture de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5223, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses.
- Souche ou levure vivante la revendication 1 ou 2, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses chez l’animal.
- Souche ou levure vivante selon la revendication 3, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses chez un jeune ruminant, et de préférence chez le chevreau, le veau ou l’agneau.
- Souche ou levure vivante selon l’une des revendications 1 à 4, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de la cryptosporidiose.
- Souche ou levure vivante selon la revendication 5, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de la cryptosporidiose due au protozoaireCryptosporidum ,et de préférenceauprotozoaireCryptosporidum parvum.
- Composition comprenant une levure obtenue par culture de la SoucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la CNCM sous le numéro I-4407 et/ou obtenue par culture de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5129 et/ou obtenue par culture de la soucheSaccharomyces cerevisiaedéposée auprès de la CNCM sous le numéro I-5223, pour une utilisation dans la prévention et/ou le traitement de parasitoses.
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