WO2023062163A2 - Bacteries utiles dans la prevention et/ou le traitement de pathologies respiratoires - Google Patents

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WO2023062163A2 PCT/EP2022/078581 EP2022078581W WO2023062163A2 WO 2023062163 A2 WO2023062163 A2 WO 2023062163A2 EP 2022078581 W EP2022078581 W EP 2022078581W WO 2023062163 A2 WO2023062163 A2 WO 2023062163A2
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Jennifer PALOMO
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Institut National De Recherche Pour L'agriculture L'alimentation Et L'environnement
Institut National Des Sciences Et Industries Du Vivant Et De L'environnement
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    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
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    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/205—Bacterial isolates
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Definitions

  • the invention relates to three bacterial strains belonging to the genus Enterococcus, a composition comprising them and its use as a medicament, in particular in the treatment and/or prevention of respiratory diseases.
  • the human body has several microbiota such as the intestinal, oral, cutaneous, vaginal microbiota and more recently a pulmonary microbiota has been described. These microbiota gradually settle in from birth and guide immune maturation. Colonization by the digestive microbiota has a very important impact on immunity and health. Since then, many studies have described the bacteria present in human microbiota and used them for their beneficial effects on health, such as probiotics.
  • Enterococcus faecalis (E. faecalis) is one of the enterococci found in the human gastrointestinal tract. In humans E. faecalis is subdominant in the intestinal microbiota in healthy adults and dominant in children just after birth. It is a ubiquitous bacterium of humans and animals, which is found in the intestine as in the oral cavity, but also in the pulmonary microbiota. However, certain strains of the species are the cause of infections, in particular nosocomial.
  • E. faecalis has in particular been described for its important immunomodulatory properties for humans, in particular in the maturation of epithelial cells of the colon, in protection against relapses of chronic bronchitis, in dermatitis atopic, or in the susceptibility to developing asthma.
  • a specific strain has already been described in patent FR 1650656 for its beneficial effects in the treatment and/or prevention of respiratory diseases.
  • Chronic respiratory diseases such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), allergic rhinitis, rheumatoid arthritis, but also chronic inflammatory bowel disease (IBD) affect millions of people worldwide. world. These chronic diseases have a strong impact on the quality of life of patients for whom no curative treatment is available and whose prevalence is increasing sharply in Western countries. Therefore, these pathologies constitute a problem medical, social and economic major in the world.
  • the objective of current treatments is essentially symptomatic and aims to treat or possibly prevent attacks occurring periodically in order to improve the quality of life of patients.
  • An objective of the present invention is therefore to provide an alternative solution which is simple, more effective and economical for preventing and/or treating chronic inflammatory diseases, including respiratory diseases, and also making it possible to limit the undesirable effects associated with current treatments and thus reduce the prevalence of these diseases.
  • the inventors have identified, among the multitude of bacteria of the species E. faecalis, three new bacterial strains of E. faecalis deposited on June 16, 2021 with the National Collection of Microorganism Cultures (CNCM), 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, France under the number CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 and CNCM 1-5701, particularly useful to reduce inflammation, in particular in the prevention and/or treatment of respiratory pathologies.
  • CNCM National Collection of Microorganism Cultures
  • the three strains exhibit an anti-inflammatory effect in vitro on human cells of pulmonary origin (BEAS-2B) but also ex vivo on explants from the lungs of axenic mice. In particular, they reduce the release of IL-18, IL-2, IL- 5, TNF-a or IL-6.
  • the other strains of E. faecalis tested do not exhibit such properties.
  • the three strains according to the invention also exhibit an anti-inflammatory effect in vivo, in two preclinical models of allergic asthma. In particular, they make it possible to reduce the recruitment of eosinophils and the release of TH2 cytokines in the lungs.
  • the strain deposited under the number CNCM 1-5699 also exhibits a protective effect on respiratory function in the asthma model in adult mice.
  • the three strains according to the invention thus exhibit properties that are entirely advantageous and useful in the treatment and/or prevention of respiratory diseases.
  • the invention relates to three strains of the species of E. faecalis deposited, respectively, under the numbers CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 and CNCM 1-5701.
  • the strains deposited under the numbers CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 and CNCM 1-5701 have a chromosome, respectively, of 2843733 bp (base pair), 2937166 bp and 2982831 bp.
  • the size of the chromosome of the strains according to the invention is therefore smaller than that of the strain described in patent FR 1650656 filed under the number CNCM 1-4969, the size of which is 3056663 bp.
  • the invention also relates to the culture supernatant obtained from at least one of the bacterial strains chosen from the strains CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 and CNCM 1-5701.
  • the supernatant can be obtained from a mixture of strains CNCM 1-5699 and/or CNCM 1-5700 and/or CNCM 1-5701.
  • the invention also relates to a composition
  • a composition comprising (i) at least one bacterial strain according to the invention and/or (ii) the culture supernatant according to the invention and (iii) at least one excipient acceptable.
  • Said acceptable excipient preferably being a pharmaceutically acceptable excipient in the case of a product intended to be used as a medicament for human use or veterinary use.
  • the composition is then a pharmaceutical composition comprising a strain chosen from the strains CNCM 1-5699, CNCM 1-5700, CNCM 1-5701 and their mixture and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the invention is particularly suitable for using said bacterial strain, said supernatant or said composition according to the invention as a medicament.
  • the present invention is particularly suitable in the prevention and / or treatment of inflammatory diseases, in particular respiratory diseases, more particularly chronic conditions such as allergy, asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), or allergic rhinitis.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • Other chronic inflammatory pathologies are also of interest such as rheumatoid arthritis or chronic inflammatory bowel disease (IBD), excessive secondary inflammation caused by a primary infection, for example bacterial but also viral such as flu, infant bronchiolitis, or SARS.
  • the strains according to the invention are also useful for preventing and/or treating chronic inflammatory bowel diseases, more preferably Crohn's disease, or ulcerative colitis.
  • Figure 1 shows the anti-inflammatory properties of the strains according to the invention in particular the reduction of IL-8 induced by TNF-a in BEAS-2B cells.
  • Figure 2 shows the ex-vivo anti-inflammatory properties of the strains according to the invention, in particular the reduction of several cytokines responsible for inflammation in explants from the lungs of axenic mice.
  • Figure 3 represents the Heat map (or Heat Map in French) of the strains according to the invention on the production of cytokines by the lung explants.
  • FIG. 4 represents the protocol of the preclinical model of allergic asthma induced by HDM according to Example 3 in young mice (Panel A) and in adult mice (Panel B).
  • Figure 5 shows the protective effect of the strain deposited under number CNCM I-5699 against a drop in blood oxygenation in an asthma model induced by HDM in adult mice.
  • Figure 6 shows the protective effect of the strain deposited under the number CNCM I-5699 against the increase in pulmonary resistance in a model of asthma induced by HDM in adult mice.
  • bacteria within the meaning of the invention, is meant a unicellular microorganism capable of reproducing by cell division. Bacteria are classified by family, genus, species. Each bacterial species includes a diversity of bacterial strains. THE bacterial strains according to the invention belong to the family Enterococcaceae, to the genus Enterococcus and to the species faecalis.
  • bacterial strain or “strain” within the meaning of the invention, we therefore mean a specific bacterial strain but also all the bacteria derived from the strain or obtained from the strain or corresponding to the bacterial strain and having the same metabolic functions, for example, at least one bacterium taken from a colony derived from the strain.
  • bacterium(s) according to the invention within the meaning of the invention, is therefore also meant a bacterial strain according to the invention, in particular the strains deposited under the numbers CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 and CNCM 1-5701 as well as their derived strains.
  • derived strain within the meaning of the invention, is meant a bacterial strain having a strong similarity with at least one of the bacterial strains deposited under the number CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 or CNCM 1- 5701.
  • the chromosomal nucleotide sequence of the derived strain comprises a nucleotide sequence having at least 99.9% ANI identity, more preferably at least 99.91%, at least 99.92%, at least 99.93% , at least 99.94%, at least 99.95%, at least 99.96%, at least 99.97%, at least 99.98%, at least 99.99% ANI identity with the chromosomal nucleotide sequence of at least one of the CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 or CNCM 1-5701 strains.
  • ANI is meant in the sense of the invention the average percentage of identity of the nucleotides calculated from the two-by-two comparison of all the chromosomal sequences of the two bacterial strains.
  • the genomic DNA can be extracted from a pure bacterial culture derived from said strain of interest, followed by DNA sequencing using various well-known methods, for example Sanger, Roche 454, Illumina, Oxford Nanopore, then the sequenced genome is assembled by bioinformatics and the sequences obtained are analyzed. Finally, the sequences of the chromosomes of interest are compared two by two to calculate the ANI.
  • the culture supernatant of the bacterial strain according to the invention optionally comprising cellular compounds of said strain and / or cellular debris of said strain, and / or metabolites and/or molecules secreted by said strain.
  • Human within the meaning of the invention means a human patient.
  • Said human patient can belong to any age group, i.e. the patient can be a infant, baby, child, adolescent or adult. It is known that children, babies, infants and the elderly are more susceptible to respiratory diseases, especially asthma.
  • the invention is intended for human patients who are resistant and/or refractory to treatment with corticosteroids.
  • patient resistant and/or refractory to treatment with corticosteroids is meant within the meaning of the invention a patient to whom a treatment based on corticosteroids is administered, who does not respond to this treatment, that is that is, the patient does not observe a reversal of the progression of the inflammation or a reversal or regression of the progression of the disease.
  • prevention within the meaning of the invention, is meant the reduction to a lesser degree of the risk or the probability of occurrence of a given phenomenon, that is to say, in the context of the present invention of inflammation, preferably respiratory diseases, for example asthma.
  • treatment within the meaning of the invention, is meant a reduction in the progression of the disease, a stabilization, a reversal or regression, or even an interruption or inhibition of the progression of the inflammation, preferentially of respiratory diseases , for example asthma.
  • these terms also apply to one or more symptoms of said diseases of the present invention.
  • respiratory disease within the meaning of the invention, here is meant diseases of the respiratory system or causing breathing disorders.
  • acceptable excipient within the meaning of the invention is meant any compound making it possible to facilitate the shaping of the composition and not modifying the nature of the biological activity of the active principle.
  • An acceptable excipient can be a solvent, buffer, saline solution, plasticizer, lubricant, dispersing medium, agents delaying absorption, flow agent, isotonic agent.
  • they are pharmaceutically acceptable excipients which are chosen according to the pharmaceutical form and the desired mode of administration, from the usual excipients known to those skilled in the art and suitable for human and/or veterinary use. The excipient will thus be chosen according to the route of administration, for example suitable for oral, nasal, intravenous, intramuscular, topical administration, etc.
  • the present invention therefore relates to a bacterial strain of E. chosen faecalis from the strains deposited under the numbers CNCM 1-5699, CNCM 1-5700, CNCM 1-5701 and their mixture.
  • the inventors have discovered and characterized these bacterial strains of E. faecalis from human donors, or from cheeses and have demonstrated, in in vitro models, anti-inflammatory effects, in particular the reduction in the production of IL-8 induced by a pro-inflammatory molecule, TNF-a .
  • the anti-inflammatory properties of the strains according to the invention have also been characterized on a model of lung explants which is closer to pulmonary physiology than the existing cell lines.
  • the different strains were thus co-incubated with ex vivo axenic mouse lung explants in ex vivo culture and also show an anti-inflammatory effect, in particular they reduce the release of IL-18, IL-2, l IL-5, TNF-a or IL-6.
  • the invention relates at least to one bacterial strain of E. faecalis chosen from the strains deposited under the numbers CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 and CNCM 1-5701.
  • the sequence of the 16S RNA gene of the CNCM 1-5699 strain, of the CNCM I-5701 strain and of the CNCM 1-5700 strain are identical and of SEQ ID NO:1.
  • 16S ribosomal RNA (16S rRNA) is the ribosomal RNA constituting the small subunit of the ribosomes of prokaryotes.
  • the genes encoding this RNA are called 16S rDNA.
  • the 16S rDNA sequence is widely used in phylogeny because of its highly conserved structure which makes it possible to reconstruct the evolutionary history of organisms and in particular prokaryotes and bacteria.
  • the 16S rDNA sequence does not always make it possible to differentiate between two strains of the same species which nevertheless have different properties, for example anti-inflammatory properties, such as a different cytokine profile. This results in a different effectiveness for each strain. Consequently, the person skilled in the art given his general knowledge is able to characterize a bacterial strain according to other parameters such as the calculation of phylogenetic distance based on the nucleotide sequence of the chromosome (ANI) or its size.
  • ANI nucleotide sequence of the chromosome
  • the CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 and CNCM 1-5701 strains have chromosomes whose respective sizes are 2843733 bp, 2937166 bp and 2982831 bp.
  • the size of the chromosome of the strains according to the invention is therefore smaller than that of the strain described in FR 1650656 deposited under the number CNCM 1-4969, the size of which is 3056663 bp.
  • the invention also relates to strains derived from at least one of the bacterial strains deposited under the numbers CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 or CNCM 1-5701 which make it possible to maintain or improve the capacities described strains according to the invention.
  • Said derived strains can be produced naturally or intentionally, by mutagenesis methods known in the state of the art.
  • the mutagenesis methods that can be implemented in the context of the present invention are the growth of the original microorganism in the presence of mutagenic or stress-producing agents, or by genetic engineering aimed at modifying genes specific or not such as directed mutagenesis or random mutagenesis.
  • said derived strain comprises a nucleotide sequence having at least 99.9% identity of ANI ("Average Nucleotide Identity", Average Nucleotide Identity in French) with the chromosomal nucleotide sequence of one of the bacterial strains deposited under the numbers CNCM 1-5699 or CNCM 1-5700 or CNCM 1-5701.
  • ANI Average Nucleotide Identity
  • the derived strain comprises a nucleotide sequence of at least 99.91%, at least 99.92%, at least 99.93%, at least 99.94%, at least 99.95%, at least 99 .96%, at least 99.97%, at least 99.98%, at least 99.99% identity of ANI with the chromosomal nucleotide sequence of at least one of the strains CNCM 1-5699, or CNCM 1 -5700 or CNCM 1-5701.
  • the invention relates to the strain of E. faecalis filed under number CNCM 1-5699.
  • the strains according to the invention can be produced by culture, for example, in a growth medium known to those skilled in the art (for example, a BHI medium: "Brain-Heart Infusion”) from 8 hours to 3 days, at a temperature of 30-37°C, with or without pH adjustment.
  • the fermentation broth containing the bacterial cells is collected.
  • the broth can be used as is, concentrated or freeze-dried.
  • the bacteria will be collected, for example by centrifugation then resuspended in an appropriate buffer, for example PBS (“phosphate buffered saline”).
  • Bacterial concentration can be established using a flow cytometer or other equivalent method.
  • the strain according to the invention is particularly advantageous in that it causes a reduction in inflammation.
  • the bacterium of the invention makes it possible to attenuate the effects of inflammatory diseases, in particular respiratory diseases.
  • Another object of the invention relates to the culture supernatant obtained from one of the bacterial strains according to the invention, but also a strain derived from these.
  • the culture supernatant comprises at least one of the constituents chosen from a bacterial cell compound, a bacterial cell debris, a metabolite and/or one (the) molecule(s) secreted by the strain and/or the derived strain , or a mixture thereof.
  • the cellular compounds and/or cellular debris can be wall components, nucleic acids, membrane components, proteins, lipids, etc.
  • the metabolites or molecules secreted can be any molecule produced or modified by the bacterium due to its metabolic activity during its growth, its use in technological processes (for example, but not limited to, production of food or medicine).
  • the metabolites or molecules can be proteins, amino acids, enzymes, lipids, nucleic acids, etc.
  • metabolite and/or one (of) molecule(s) secreted by the strain and/or the derived strain is meant a molecule produced and exported or released outside the bacterium by the bacterium.
  • the invention also relates to the culture supernatant obtained from one of the bacterial strains according to the invention or their mixture.
  • strain(s) according to the invention or derived strain(s) and/or the culture supernatant described above and the bacteria derived from said strains are advantageously administered in a composition.
  • the invention relates to a composition
  • a composition comprising: (i) at least one bacterial strain according to the invention and/or (ii) a supernatant according to the invention and (iii) at least one acceptable excipient.
  • the composition may also comprise a physiologically acceptable medium, that is to say a medium which is compatible with the body of the individual to whom said composition is to be administered. It can be, for example, a non-toxic solvent such as water, buffer, saline solutions. In particular, said medium is compatible with oral administration.
  • the composition comprises at least one bacterial strain chosen from one of the strains deposited under the number CNCM 1-5699, the number CNCM 1-5700, the number CNCM 1-5701 and their mixture; and/or the culture supernatant obtained from said strains and at least one acceptable excipient and/or a physiologically acceptable medium.
  • the composition comprises the strain deposited under the number CNCM 1-5699.
  • the composition comprises the strain deposited under the number CNCM 1-5699 and the strain deposited under the number CNCM 1-5700 and the strain deposited under the number CNCM 1-5701.
  • the bacterial strain according to the invention may be present in any form producing the expected effects and the efficacy described in the present application.
  • the strain can be in living form (cultivable or not), dead, semi-living, attenuated or inactivated.
  • the dead, semi-living, attenuated or inactivated form induces the same effects as the live strain and therefore also has anti-inflammatory properties, allowing in particular the prevention and/or treatment of respiratory diseases.
  • semi-living is meant a bacterium with low physiological activity whose ability to proliferate is reduced, temporarily or permanently.
  • inactivated designates a bacterium which is no longer capable, temporarily or permanently, of proliferating.
  • dead designates a bacterium which is no longer capable, definitively, of proliferating.
  • Dead or inactivated bacteria may have intact or ruptured cell membranes.
  • inactivated also designates the extracts and lysates of bacteria obtained. It is particularly advantageous to use such forms in the pharmaceutical compositions of the invention.
  • composition according to the invention may also comprise at least one additional compound.
  • the additional compound can be an ingredient, a molecule, an active principle, a microorganism, a bacterium or a mixture of bacteria.
  • the additional compound is an anti-inflammatory agent, more preferably a corticosteroid, even more preferably budesonide.
  • the additional compound may be a probiotic and/or a prebiotic.
  • composition according to the invention is in any form acceptable for administration to a patient, preferably a human or animal (non-human) patient.
  • a patient preferably a human or animal (non-human) patient.
  • the composition according to the invention is also aimed at veterinary uses.
  • composition according to the invention is in solid, liquid or freeze-dried form.
  • composition when in liquid form, it may in particular comprise bacterial strains according to the invention and/or the derived strain and/or a physiologically acceptable culture medium for said bacteria which makes it possible to preserve them, such as example BHI medium, or an equivalent medium containing no product derived from animal origin.
  • bacterial strains according to the invention and/or the derived strain and/or a physiologically acceptable culture medium for said bacteria which makes it possible to preserve them, such as example BHI medium, or an equivalent medium containing no product derived from animal origin.
  • the bacterial strains according to the invention and/or the derived strain may be present in lyophilized form, and may also comprise excipients such as, for example, microcrystalline cellulose. , lactose, sucrose, fructose, levulose, starches, stachyose, raffinose, amylum, calcium lactate, magnesium sulfate, sodium citrate, calcium stearate, polyvinylpyrrolidone, maltodextrin , galactooligosaccharides, fructooligosaccharides, pectins, beta-glucans, lactoglobulins, isomaltooligosaccharides, polydextroses, mannitol, sorbitol, glycerol, silica dioxide, magnesium stearate, cysteine, mannose, galactose, anhydrous glucose, glucose monohydrate and/or mixtures thereof.
  • excipients such as, for example, microcrystalline cellulose.
  • the composition according to the invention is in a form suitable for administration by the oral, nasal, parenteral, rectal, sublingual, ocular, auricular, intramuscular, intravenous, inhaled or cutaneous route, more preferably by the nasal or inhaled route using a nebulizer device.
  • composition can be in any suitable form.
  • the composition according to the invention may be in a form chosen from a powder, powder to be nebulized, microencapsulated powder, microencapsulated powder to be nebulized, capsule, capsule, tablet, pastille, granules, solution, solution to be nebulized, emulsion, emulsion nebuliser, suspension, nebuliser suspension, ampule, suppository, inhaler and a syrup, more preferably in the form of an inhaler such as a nebuliser device.
  • composition according to the invention may optionally be in a gastro-resistant form, for example a coated tablet containing microencapsulated bacteria.
  • the composition comprises at least 10 3 colony-forming units (CFU) of bacteria per daily dose of composition to be administered, preferably from 10 4 to 10 9 CFU, more preferably from 10 5 to 10 7 CFU .
  • CFU colony-forming units
  • this corresponds to a daily dose of bacteria to be administered, regardless of the weight of the person or the animal.
  • this dose is administered all at once.
  • the useful composition then comprises at least 10 3 , preferably from 10 4 to 10 9 CFU, even more preferably from 10 5 to 10 7 CFU of bacteria per daily dose to be administered.
  • Said bacteria are a mixture of bacteria corresponding to or derived from one of the strains according to the invention, including the derived strains.
  • CFU Cold Forming Unit
  • UFC Coldy Forming Unit
  • the daily dose is measured per gram or milliliter of the composition according to the final invention.
  • the composition according to the invention comprises a mixture of live bacteria or not, said mixture comprising at least live bacteria
  • the composition preferably comprises at least 1% of live bacteria (by number), more preferably at least 10% of live bacteria (by number), even more preferably at least least 50% live bacteria (by number).
  • the live bacteria are a mixture of bacteria corresponding to one of the strains according to the invention, including the derived strains.
  • the composition according to the invention including it may in particular comprise a content of between 0.1 and 99% by weight. , in particular from 5 to 95% by weight, in particular from 10 to 90% by weight and more particularly from 15 to 85% by weight, relative to the total weight of the composition.
  • a composition according to the invention may comprise a content of between 0.1 and 99% by weight, in particular from 5 to 95%, in particular from 10 to 90% by weight, more particularly from 15 to 85% by weight, of supernatant relative to the total weight of the composition.
  • the composition When the composition is intended for therapeutic use, the composition comprises at least one pharmaceutically acceptable excipient, the composition according to the invention is then a pharmaceutical composition.
  • pharmaceutically acceptable excipient here means an excipient whose administration to an individual is not accompanied by significant deleterious effects.
  • Pharmaceutically acceptable excipients are well known to those skilled in the art.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the ingredient(s) included in the composition according to the invention and according to any of the embodiments described above.
  • Said pharmaceutical composition is a medicine.
  • composition according to the invention may be in the form of a food product, a drink, a nutraceutical, a food additive, a food supplement or a dairy product.
  • composition according to the invention when included in a food supplement for oral administration, it may be in the form of capsules, gelatin capsules, soft capsules, tablets, sugar-coated tablets, pills, pastes, lozenges, gums, drinkable solutions or emulsions, syrup or gel.
  • a food supplement according to the present invention may further comprise a sweetener, a stabilizer, an antioxidant, an additive, a flavoring agent and/or a colorant.
  • the formulation thereof is carried out by means of the usual methods for producing sugar-coated tablets, capsules, gels, hydrogels for controlled release, emulsions, tablets or capsules.
  • a composition according to the present invention can also be in the form of a nutritional composition.
  • a nutritional composition according to the present invention may be in the form of a yogurt, a fermented food, a cereal bar, a breakfast cereal, a dessert, a frozen food, a chilled food, a frozen food, a soup, pet food, liquid suspension, powder, tablet, gum or candy.
  • a nutritional composition according to the present invention may also comprise at least one ingredient chosen from: antioxidants, fish oils, vegetable oils, DHA, EPA, vitamins, minerals, phytonutrients, a protein, a lipid , probiotics, prebiotics, postbiotics and combinations thereof.
  • composition according to the invention is useful as a medicament for use in human or veterinary health.
  • the composition according to the invention is intended to prevent and/or treat inflammation and thus be used in the treatment and/or prevention of inflammatory diseases, more preferably respiratory diseases and/or inflammatory diseases of the bowel and/or rheumatoid arthritis and/or inflammatory diseases associated with viral or bacterial infection.
  • inflammatory diseases more preferably respiratory diseases and/or inflammatory diseases of the bowel and/or rheumatoid arthritis and/or inflammatory diseases associated with viral or bacterial infection.
  • asthma asthma
  • bronchial allergic, intrinsic, extrinsic, induced by exercise, of drug origin (including aspirin and nonsteroidal anti-inflammatory drugs - NSAIDs) and dust-induced asthma, steroid-resistant asthma, bronchitis, including infectious and eosinophilic bronchitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), such as COPD (chronic obstructive pulmonary disease), cystic fibrosis, pulmonary fibrosis including cryptogenic fibrosing alveolitis, idiopathic pulmonary fibrosis, idiopathic interstitial pneumonia, fibrosis complicating antineoplastic therapy and chronic infection, including tuberculosis and aspergillosis and others fungal infections; complications of lung transplantation; vasculitis and thrombotic disorders of the pulmonary vascular system and pulmonary arterial hypertension (including pulmonary arterial hypertension
  • composition according to the invention also targets respiratory pathologies having “immune dysregulations” common with those observed in asthma, such as the induction of certain cytokines (IL-6, TSLP, IL-8, IL-5, IL-13, IL-17) and mucosal dysregulation (hyper production of mucus).
  • cytokines IL-6, TSLP, IL-8, IL-5, IL-13, IL-17
  • mucosal dysregulation hyper production of mucus
  • the uses and compositions of the present invention encompass the prevention and treatment of chronic respiratory diseases, for example asthma, COPD and rhinitis. Even more particularly, the uses and compositions of the present invention relate to the prevention and treatment of asthma.
  • strains according to the invention are particularly effective in preventing asthma when they are administered before the appearance of all the symptoms of the disease.
  • the use of the strain of the invention and the composition comprising it can in particular be used effectively to prevent the onset of asthma in patients known for their predisposition for this pathology (for example, patients with a predisposition family to the development of asthma).
  • composition according to the invention is also useful in a disease chosen from Crohn's disease, ulcerative colitis, ulcerative-hemorrhagic recto-colitis, diverticulitis, esophagitis, gastritis , pancreatitis, peptic ulcer and irritable bowel syndrome.
  • composition according to the invention is of particular interest when humans or the animal is resistant and/or refractory to corticosteroids.
  • Example 1 Anti-inflammatory effect of the strains according to the invention.
  • BEAS-2B cells were co-incubated with TNF-a (lpg/ml) alone or with E. faecalis bacteria according to the invention (CNCM 1-5699, CNCM 1-5700, CNCM 1-5701 ) or non-inventive (CNCM 1-4969, E. faecalis 1 or E. faecalis 2) MOI 250:1.
  • concentration of IL-8 was measured in the supernatant.
  • the inventors have observed that the three strains of E. faecalis according to the invention (CNCM 1-5699, CNCM 1-5700, CNCM 1-5701) exhibit a strong "anti-IL-8" effect, respectively of 93%, 75% and 70% compared to the strain CNCM 1- 4969 and two other strains of E. faecalis.
  • the CNCM I-4969 strain certainly has an effect, but it is weaker than the three strains according to the invention.
  • the E. faecalis strains according to the invention exhibit useful anti-inflammatory properties (FIG. 1).
  • Example 2 Ex-vivo anti-inflammatory effect of the strains according to the invention.
  • the inventors continued their work by comparing the 3 strains according to the invention with 5 other strains of E. faecalis (CNCM 1-4969, E. faecalis 1, E. faecalis 2, E. faecalis 3, E. faecalis 4).
  • the lung explants are 200-250 ⁇ m cultured sections of lungs from axenic mice.
  • the explants are co-incubated or not with 50 CFU (colony forming units) of bacteria: strains of E. faecalis.
  • CFU colony forming units
  • the culture supernatants are sampled and the quantity of cytokines measured by Luminex.
  • the inventors have thus characterized the anti-inflammatory effects on a model of lung explants which is closer to pulmonary physiology in comparison with cell lines.
  • the different strains of E. faecalis were co-incubated with explants of axenic mouse lungs in ex vivo culture. These explants have a basal production of different cytokines, which can be modified by the presence of immunomodulatory elements.
  • E. faecalis have an anti-inflammatory effect on mouse lung explants. They reduce in particular the release of IL-18, IL-2, IL-5, TNF-a or even IL-6 ( Figures 2 and 3).
  • the CNCM I-4969 strain exhibits a significantly weaker effect than the three strains according to the invention and the 4 other strains tested (E. faecalis 1, E. faecalis 2, E. faecalis 3, E. faecalis 4) have effects neutral or pro-inflammatory (Figure 3).
  • Baby mice were sensitized by intranasal administration of HDM (House Dust Mite) (lpg) on D0 (Sensitization) then with lOpg from D7 to Dll (Challenges).
  • the strains according to the invention were administered intranasally at 10 6 CFU every 2 days from D-2 to D10 (FIG. 4 Panel A).
  • the inventors analyzed the growth monitoring, carried out a bronchoalveolar lavage (BAL) and analyzed the cells and the cytokines of the lung tissue.
  • BAL bronchoalveolar lavage
  • mice were also sensitized by intranasal administration of HDM (House Dust Mite - dust mite) (25 ⁇ g) on D0 and D7 (Sensitization) then with lOpg from D14 to D16 (Challenges).
  • the strains according to the invention were administered intranasally at 10 6 CFU every 2 days from D-2 to D16.
  • budesonide was administered intranasally (3mg/kg) from D14 to D16 ( Figure 4 Panel B).
  • the inventors On D17, the inventors analyzed the growth monitoring, carried out a bronchoalveolar lavage of the cells and analyzed the cytokines found in the lavage and in the lung tissue.
  • the immune cells found in the BAL, the TH2 cytokines present in the lungs and the BAL, as well as the histopathology are markers of the development of asthma common to mouse models of asthma and to human patients.
  • the data in Table 2 come from an experiment with 8 and 10 animals per group, in mice and in adults, respectively. They indicate the protective (positive values) or aggravating (negative values) effects of the administration of strains of E. faecalis according to the invention (CNCM 1-5699, CNCM 1-5700, CNCM 1-5701) and outside the invention (CNCM 1-4969) in comparison with the groups of animals treated only with HDM. In the protocol used in adult mice, the effects were compared to those of budesonide, a reference steroid in the clinic. In the mouse protocol, this comparison was not made.
  • mice were sensitized by intranasal administration of HDM (25 ⁇ g) on D0 and D7 then at 10 ⁇ g from D14 to D16 (FIG. 4 Panel B).
  • the CNCM I-5699 strain was administered intranasally at 10 6 CFU every 2 days from D-2 to D16.
  • Budesonide was administered intranasally (3mg/kg) from D14 to D16.
  • Pulmonary function was measured every other day using a pulse oximeter on D-2 before the first treatment, then every 2 days until the end of the experiment. The measurement makes it possible to obtain the level of oxygen saturation of the blood, which can be affected in the event of impaired respiratory function, in particular during the development of asthma.
  • the inventors carried out a measurement of the pulmonary dynamic resistance.
  • bronchial hyperreactivity which is particularly observed in asthma, and which results in an increase in pulmonary resistance.
  • the general principle of this bronchial provocation test consists of the administration by inhalation of increasing doses of methacholine, a substance indirectly inducing the contraction of bronchial smooth muscle, with the consequences of changes in the caliber of the airways, an increase in their resistance and a decrease in the gas flow through it.
  • the mice were anesthetized and intubated. Increasing concentrations of aerosolized methacholine were administered. Resistance was recorded with a plethysmograph.

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Abstract

L'invention concerne trois souches bactériennes appartenant au genre Enterococcus, une composition comprenant au moins l'une d'elles et ses utilisations utiles, en particulier comme médicament dans le traitement et/ou la prévention de maladies respiratoires.

Description

BACTERIES UTILES DANS LA PREVENTION ET/OU LE TRAITEMENT DE PATHOLOGIES RESPIRATOIRES
[0001] Domaine technique
[0002] L'invention concerne trois souches bactériennes appartenant au genre Enterococcus, une composition les comprenant et son utilisation comme médicament, en particulier dans le traitement et/ou la prévention des maladies respiratoires.
[0003] Etat de l'art
[0004] Le corps humain possède plusieurs microbiotes tels que le microbiote intestinal, oral, cutané, vaginal et plus récemment un microbiote pulmonaire a été décrit. Ces microbiotes s'installent progressivement à partir de la naissance et orientent la maturation immunitaire. La colonisation par le microbiote digestif a un impact très important sur l'immunité et la santé. Dès lors, de nombreux travaux ont décrit les bactéries présentes dans les microbiotes humains et les ont utilisées pour leurs effets bénéfiques sur la santé, tels que les probiotiques.
[0005] Enterococcus faecalis (E. faecalis) fait partie des entérocoques retrouvés dans le tractus gastro-intestinal humain. Chez l'homme E. faecalis est sous-dominant dans le microbiote intestinal chez l'adulte sain et dominant chez l'enfant juste après la naissance. Il s'agit d'une bactérie ubiquiste de l'homme et des animaux, qui se retrouve dans l'intestin comme dans la cavité orale, mais aussi dans le microbiote pulmonaire. Toutefois, certaines souches de l'espèce sont à l'origine d'infections, notamment nosocomiales.
[0006] L'espèce E. faecalis a notamment été décrite pour ses propriétés immuno-modulatrices importantes pour l'être humain, en particulier dans la maturation des cellules épithéliales du colon, dans la protection contre les rechutes de bronchite chronique, dans la dermatite atopique, ou encore dans la susceptibilité à développer l'asthme. Une souche spécifique à déjà été décrite dans le brevet FR 1650656 pour ses effets bénéfiques dans le traitement et/ou la prévention des maladies respiratoires.
[0007] Les maladies respiratoires chroniques telles que l'asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), la rhinite allergique, l'arthrite rhumatoïde, mais encore les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) touchent des millions de personnes dans le monde. Ces maladies chroniques ont un impact fort sur la qualité de vie des patients pour lesquels aucun traitement curatif n'est disponible et dont la prévalence augmente fortement dans les pays occidentaux. Dès lors ces pathologies constituent un problème médical, social et économique majeur dans le monde. L'objectif des traitements actuels est essentiellement symptomatique et visent à traiter ou éventuellement prévenir les crises survenant par période afin d'améliorer la qualité de vie des patients.
[0008] Les traitements actuels sont notamment basés sur des modulateurs de l'immunité à large spectre, tels que les corticostéroïdes. Ces derniers sont certes très efficaces en traitement ponctuel, mais peuvent entraîner des effets secondaires délétères lors d'une prise régulière. Par exemple, les corticoïdes inhalés peuvent causer un retard de croissance chez l'enfant, la suppression de l'axe hypothalamique pituitaire surrénalien et un risque accru d'ostéoporose. Plus récemment, certains médicaments ciblant des médiateurs clés de l'inflammation, tels que le Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-a), l'lnterleukine-1 (IL-1) ou l'lnterleukine-5 (IL-5) ont été développés. Toutefois, les pathologies inflammatoires ne répondent pas toutes au(x) même(s) inhibiteur(s) de cytokines. Enfin, certains patients sont encore réfractaires aux traitements existants, qu'il s'agisse de corticostéroïdes ou d'inhibiteurs spécifiques.
[0009] Il existe donc un besoin médical fort pour de nouvelles solutions thérapeutiques permettant soit de traiter et/ou de prévenir ses affections, telles que les pathologies respiratoires, soit de diminuer les doses de traitement anti-inflammatoire nécessaires et/ou d'augmenter leur efficacité.
[0010] Un objectif de la présente invention est donc d'apporter une solution alternative qui soit simple, plus efficace et économique pour prévenir et/ou traiter les maladies chroniques inflammatoires dont les maladies respiratoires, et permettant également de limiter les effets indésirables associés aux traitements actuels et ainsi faire reculer la prévalence de ces maladies.
[0011] Résumé de l'invention
[0012] Pour répondre à cet objectif, les inventeurs ont identifié, parmi la multitude de bactéries de l'espèce E. faecalis, trois nouvelles souches bactériennes d'E. faecalis déposées le 16 Juin 2021 auprès la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France sous le numéro CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 et CNCM 1-5701, particulièrement utiles pour réduire l'inflammation, en particulier dans la prévention et/ou le traitement des pathologies respiratoires.
[0013] En effet, les trois souches présentent un effet anti-inflammatoire in vitro sur des cellules humaines d'origine pulmonaire (BEAS-2B) mais également ex vivo sur des expiants de poumons de souris axéniques. Elles réduisent en particulier la libération de l'IL-18, l'IL-2, l'IL- 5, le TNF-a ou encore l'IL-6. Les autres souches d’E.faecalis testées ne présentent pas de telles propriétés. Les trois souches selon l'invention présentent également un effet antiinflammatoire in vivo, dans deux modèles précliniques d'asthme allergique. Elles permettent de réduire en particulier le recrutement d'éosinophiles et la libération de cytokines TH2 dans les poumons.
[0014] Enfin, la souche déposée sous le numéro CNCM 1-5699 présente également un effet protecteur de la fonction respiratoire dans le modèle d'asthme chez la souris adulte. Les trois souches selon l'invention présentent ainsi des propriétés tout à fait avantageuses et utiles dans le traitement et/ou la prévention de maladies respiratoires.
[0015] Ainsi, l'invention a pour objet trois souches de l'espèce d'E. faecalis déposées, respectivement, sous les numéros CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 et CNCM 1-5701.
[0016] Les souches déposées sous les numéros CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 et CNCM 1-5701 possèdent un chromosome, respectivement, de 2843733 pb (paire de base), de 2937166 pb et de 2982831 pb. La taille du chromosome des souches selon l'invention est donc inférieure à celui de la souche décrite dans le brevet FR 1650656 déposée sous le numéro CNCM 1-4969 dont la taille est de 3056663 pb.
[0017] L'invention vise aussi le surnageant de culture obtenu à partir d'au moins une des souches bactériennes choisie parmi les souches CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 et CNCM 1-5701. Selon une variante, le surnageant peut-être obtenu à partir d'un mélange des souches CNCM 1-5699 et/ou CNCM 1-5700 et/ou CNCM 1-5701.
[0018] Selon un autre objet, l'invention vise également une composition comprenant (i) au moins une souche bactérienne selon l'invention et/ou (ii) le surnageant de culture selon l'invention et (iii) au moins un excipient acceptable. Ledit excipient acceptable étant préférentiellement un excipient pharmaceutiquement acceptable lorsqu'il s'agit d'un produit destiné à être utilisé comme médicament pour un usage humain ou un usage vétérinaire. La composition est alors une composition pharmaceutique comprenant une souche choisie parmi les souches CNCM 1-5699, CNCM 1-5700, CNCM 1-5701 et leur mélange et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
[0019] Enfin, l'invention est particulièrement adaptée pour utiliser ladite souche bactérienne, ledit surnageant ou ladite composition selon l'invention comme médicament. En effet, la présente invention est particulièrement adaptée dans la prévention et/ou le traitement des maladies inflammatoires, en particulier des maladies respiratoires, plus particulièrement chroniques telles que l'allergie, l'asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), ou la rhinite allergique. D'autres pathologies inflammatoires chroniques sont également d'intérêts telles que l'arthrite rhumatoïde ou les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin ( M ICI ), l'inflammation excessive secondaire provoquée par une primoinfection, par exemple bactérienne mais également virale telle que la grippe, la bronchiolite du nourrisson, ou les SRAS.
[0020] Selon une variante, les souches selon l'invention sont également utiles pour prévenir et/ou traiter les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, plus préférentiellement la maladie de Crohn, ou la colite ulcéreuse.
[0021] D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l'invention, des exemples et des figures qui vont suivre.
[0022] Brève description des Figures
[0023] La Figure 1 représente les propriétés anti-inflammatoires des souches selon l'invention en particulier la réduction d'IL-8 induite par le TNF-a dans les cellules BEAS-2B.
[0024] La Figure 2 représente les propriétés anti-inflammatoires ex-vivo des souches selon l'invention en particulier la réduction de plusieurs cytokines responsables de l'inflammation dans des expiants de poumons de souris axéniques.
[0025] La Figure 3 représente la Heat map (ou Carte de Chaleur en Français) des souches selon l'invention sur la production de cytokines par les expiants de poumon.
[0026] La Figure 4 représente le protocole du modèle préclinique d'asthme allergique induit par HDM selon l'Exemple 3 chez le souriceau (Panel A) et chez la souris adulte (Panel B).
[0027] La Figure 5 représente l'effet protecteur de la souche déposée sous le numéro CNCM I- 5699 contre une baisse d'oxygénation du sang dans un modèle d'asthme induit par HDM chez la souris adulte.
[0028] La Figure 6 représente l'effet protecteur de la souche déposée sous le numéro CNCM I- 5699 contre l'augmentation de la résistance pulmonaire dans un modèle d'asthme induit par HDM chez la souris adulte.
[0029] Description détaillée de l'invention
[0030] Définition
[0031] Par « bactérie » au sens de l'invention, on entend un microorganisme unicellulaire capable de se reproduire par division cellulaire. Les bactéries sont classées par famille, genre, espèce. Chaque espèce bactérienne comprend une diversité de souches bactériennes. Les souches bactériennes selon l'invention appartiennent à la famille Enterococcaceae, au genre Enterococcus et à l'espèce faecalis.
[0032] Par « souche bactérienne » ou « souche » au sens de l'invention, on entend donc une souche bactérienne spécifique mais également toutes les bactéries issues de la souche ou obtenues à partir de la souche ou correspondant à la souche bactérienne et ayant les mêmes fonctions métaboliques, par exemple, au moins une bactérie prélevée d'une colonie issue de la souche. Par « bactérie(s) selon l'invention », au sens de l'invention, on entend donc également une souche bactérienne selon l'invention, en particulier, les souches déposées sous les numéros CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 et CNCM 1-5701 ainsi que leurs souches dérivées.
[0033] Par « souche dérivée » au sens de l'invention, on entend une souche bactérienne ayant une forte similarité avec au moins l'une des souches bactériennes déposées sous le numéro CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 ou CNCM 1-5701. Préférentiellement, la séquence nucléotidique chromosomique de la souche dérivée comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 99,9% d'identité d'ANI, plus préférentiellement au moins 99,91%, au moins 99,92%, au moins 99,93%, au moins 99,94%, au moins 99,95%, au moins 99,96%, au moins 99,97%, au moins 99,98%, au moins 99,99% d'identité d'ANI avec la séquence nucléotidique chromosomique d'au moins une des souches CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 ou CNCM 1-5701.
[0034] Par « ANI », on entend au sens de l'invention le pourcentage d'identité moyen des nucléotides calculé à partir de la comparaison deux-à-deux de toutes les séquences chromosomiques des deux souches bactériennes. Selon les connaissances générales bien connues de l'Homme du métier, à partir de ladite souche d'intérêt déposée, par exemple auprès de la CNCM, l'ADN génomique peut être extrait à partir d'une culture bactérienne pure issue de ladite souche d'intérêt, suivi du séquençage de l'ADN selon différentes méthodes bien connues, par exemple Sanger, Roche 454, Illumina, Oxford Nanopore puis le génome séquencé est assemblé par bio-informatique et les séquences obtenues sont analysées. Enfin, les séquences des chromosomes d'intérêt sont comparées deux à deux pour calculer l'ANI.
[0035] Par « surnageant » au sens de l'invention, on entend, le surnageant de culture de la souche bactérienne selon l'invention comprenant éventuellement des composés cellulaires de ladite souche et/ou débris cellulaires de ladite souche, et/ou des métabolites et/ou des molécules sécrétées par ladite souche.
[0036] Par « Homme » au sens de l'invention, on entend un patient humain. Ledit patient humain peut appartenir à n'importe quelle classe d'âge, c'est-à-dire le patient peut être un nourrisson, un bébé, un enfant, un adolescent ou un adulte. Il est connu que les enfants, les bébés, les nourrissons et les personnes âgées sont plus sensibles aux maladies respiratoires, notamment l'asthme. Préférentiellement, l'invention s'adresse aux patients humains résistants et/ou réfractaires aux traitements par corticostéroïdes.
[0037] Par « patient résistant et/ou réfractaire aux traitements par corticostéroïdes », on entend au sens de l'invention un patient à qui l'on administre un traitement à base de corticostéroïdes, qui ne répond pas à ce traitement, c'est-à-dire que l'on n'observe pas chez le patient une inversion de la progression de l'inflammation ou une inversion ou régression de la progression de la maladie.
[0038] Par « prévention » au sens de l'invention, on entend la réduction à un degré moindre du risque ou de la probabilité d'occurrence d'un phénomène donné, c'est-à-dire, dans le contexte de la présente invention de l'inflammation, préférentiellement des maladies respiratoires, par exemple l'asthme.
[0039] Par « traitement » au sens de l'invention, on entend une diminution de la progression de la maladie, une stabilisation, une inversion ou régression, voire une interruption ou inhibition de la progression de l'inflammation, préférentiellement des maladies respiratoires, par exemple l'asthme. Dans le contexte de l'invention, ces termes s'appliquent également sur un ou plusieurs symptômes desdites maladies de la présente invention.
[0040] Par « maladie respiratoire » au sens de l'invention, on entend ici les maladies de l'appareil respiratoire ou provoquant des troubles de la respiration.
[0041] Par « excipient acceptable » au sens de l'invention on entend tout composé permettant de faciliter la mise en forme de la composition et ne modifiant pas la nature de l'activité biologique du principe actif. Un excipient acceptable peut être un solvant, tampon, solution saline, plastifiant, lubrifiant, milieu de dispersion, agents retardant l'absorption, agent d'écoulement, agent isotonique. Préférentiellement, il s'agit d'excipient pharmaceutiquement acceptable qui sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité, parmi les excipients habituels et connus de l'homme du métier et apte à un usage humain et/ou vétérinaire. L'excipient sera ainsi choisi en fonction de la voie d'administration, par exemple approprié pour une administration orale, nasale, intraveineuse, intramusculaire, topique etc.
[0042] Souche bactérienne ou surnageant selon l'invention
[0043] La présente invention a donc pour objet une souche bactérienne d'E. faecalis choisie parmi les souches déposées sous les numéros CNCM 1-5699, CNCM 1-5700, CNCM 1-5701 et leur mélange.
[0044] Les inventeurs ont découvert et caractérisé ces souches bactériennes d'E. faecalis à partir de donneurs humains, ou de fromages et ont démontré, dans des modèles in vitro, des effets anti-inflammatoires, en particulier la réduction de la production d'IL-8 induite par une molécule pro-inflammatoire, le TNF-a.
[0045] Les propriétés anti-inflammatoires des souches selon l'invention ont également été caractérisées sur un modèle d'explants de poumons qui est plus proche de la physiologie pulmonaire que les lignées cellulaires existantes. Les différentes souches ont ainsi été co- incubées avec des expiants de poumons de souris axéniques en culture ex vivo et présentent également un effet anti-inflammatoire, en particulier elles réduisent la libération de l'IL-18, l'IL-2, l'IL-5, le TNF-a ou encore l'IL-6.
[0046] Ces premiers résultats, en particulier sur les expiants de poumons de souris axéniques confirment l'intérêt clinique des souches selon l'invention comme médicament en particulier dans la prévention et/ou le traitement des maladies respiratoires.
[0047] Ainsi, l'invention se rapporte au moins à une souche bactérienne d'E. faecalis choisie parmi les souches déposées sous les numéros CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 et CNCM 1-5701.
[0048] La séquence du gène de l'ARN 16S de la souche CNCM 1-5699, de la souche CNCM I- 5701 et de la souche CNCM 1-5700 sont identiques et de SEQ ID NO:1.
[0049] L'ARN ribosomique 16S (ARNr 16S) est l'ARN ribosomique constituant la petite sous- unité des ribosomes des procaryotes. Les gènes codant de cet ARN sont appelés ADNr 16S (16S rDNA en anglais). La séquence ADNr 16S est très utilisée en phylogénie du fait de sa structure très conservée qui permet de reconstruire l'histoire évolutive des organismes et en particulier des procaryotes et bactéries.
[0050] Or, la séquence d'ADNr 16S ne permet pas toujours de différencier deux souches d'une même espèce ayant pour autant des propriétés différentes, par exemple des propriétés antiinflammatoires, telles qu'un profil cytokinique différent. Il en résulte une efficacité différente pour chaque souche. Par conséquent, l'Homme du métier étant donné ses connaissances générales est en mesure de caractériser une souche bactérienne selon d'autres paramètres tels que le calcul de distance phylogénétique basé sur la séquence nucléotidique du chromosome (ANI) ou de sa taille.
[0051] Ainsi, les souches CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 et CNCM 1-5701 possèdent des chromosomes dont les tailles respectives sont de 2843733 pb, 2937166 pb et 2982831 pb. La taille du chromosome des souches selon l'invention est donc inférieure à celui de la souche décrite dans FR 1650656 déposée sous le numéro CNCM 1-4969 dont la taille est de 3056663 pb.
[0052] De plus, la distance phylogénétique basé sur la séquence du chromosome (ANI) a également été calculée. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-après.
[0053] [Tableau 1]
Figure imgf000009_0001
[0054] L'invention se rapporte également aux souches dérivées d'au moins l'une des souches bactériennes déposées sous les numéros CNCM 1-5699, CNCM 1-5700 ou CNCM 1-5701 qui permettent de maintenir ou d'améliorer les capacités décrites des souches selon l'invention. Lesdites souches dérivées peuvent être produites naturellement ou intentionnellement, par des méthodes de mutagénèse connues dans l'état de la technique. A titre d'exemple les méthodes de mutagénèse pouvant être mises en œuvre dans le cadre de la présente invention sont la croissance du micro-organisme original en présence d'agents mutagènes ou producteurs de stress, ou par le génie génétique visant à modifier des gènes spécifiques ou non telle que la mutagénèse dirigée ou la mutagénèse aléatoire.
[0055] Préférentiellement, ladite souche dérivée comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 99,9% d'identité d'ANI (« Average Nucleotide Identity », Identité Nucléotidique Moyenne en français) avec la séquence nucléotidique chromosomique d'une des souches bactériennes déposées sous les numéros CNCM 1-5699 ou CNCM 1-5700 ou CNCM 1-5701. Plus préférentiellement, la souche dérivée comprend une séquence nucléotidique d'au moins 99,91%, au moins 99,92%, au moins 99,93%, au moins 99,94%, au moins 99,95%, au moins 99,96%, au moins 99,97%, au moins 99,98%, au moins 99,99% d'identité d'ANI avec la séquence nucléotidique chromosomique d'au moins une des souches CNCM 1-5699, ou CNCM 1-5700 ou CNCM 1-5701.
[0056] Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne la souche d'E. faecalis déposée sous le numéro CNCM 1-5699.
[0057] Les souches selon l'invention peuvent être produite par culture, par exemple, dans un milieu de croissance connu de l'homme du métier (par exemple, un milieu BHI : « Brain-Heart Infusion ») de 8 heures à 3 jours, à une température de 30-37°C, avec ou sans ajustement du pH. Le bouillon de fermentation contenant les cellules bactériennes est recueilli. Le bouillon peut être utilisé tel quel, concentré ou lyophilisé. Avantageusement, les bactéries seront recueillies, par exemple par centrifugation puis remises en suspension dans un tampon approprié, par exemple du PBS (« phosphate buffered saline »). La concentration bactérienne peut être établie en utilisant un cytomètre de flux ou un autre procédé équivalent. La souche selon l'invention est particulièrement avantageuse en ce qu'elle entraine une diminution de l'inflammation. Ainsi, la bactérie de l'invention permet d'atténuer les effets des maladies inflammatoires, notamment respiratoires.
[0058] Un autre objet de l'invention se rapporte au surnageant de culture obtenu depuis l'une des souches bactériennes selon l'invention, mais également une souche dérivée de celles-ci. Préférentiellement, le surnageant de culture comprend au moins un des constituants choisis parmi un composé cellulaire bactérien, un débris cellulaire bactérien, un métabolite et/ou une(des)molécule(s) sécrété(s) par la souche et/ou la souche dérivée, ou leur mélange.
[0059] Ainsi, les composés cellulaires et/ou débris cellulaires peuvent être des composants de la paroi, des acides nucléiques, des composants membranaires, des protéines, lipides etc. Les métabolites ou molécules sécrété(s) peuvent être toute molécule produite ou modifiée par la bactérie en raison de son activité métabolique au cours de sa croissance, de son utilisation dans des procédés technologiques (par exemple, mais sans s'y limiter, des procédés de production d'aliments ou de médicaments). A titre d'exemple, les métabolites ou molécules peuvent être des protéines, acides aminées, enzymes, lipides, acides nucléiques etc. Par « métabolite et/ou une(des)molécule(s) sécrété(s) par la souche et/ou la souche dérivée », on entend une molécule produite et exportée ou libérée à l'extérieur de la bactérie par la bactérie. Ainsi l'invention se rapporte également au surnageant de culture obtenu depuis l'une des souches bactériennes selon l'invention ou leur mélange.
[0060] Composition
[0061] La ou les souches selon l'invention ou souche(s) dérivée(s) et/ou le surnageant de culture précédemment décrit et les bactéries issues desdites souches, sont avantageusement administrées dans une composition.
[0062] Ainsi, l'invention concerne une composition comprenant : (i) au moins une souche bactérienne selon l'invention et/ou (ii) un surnageant selon l'invention et (iii) au moins un excipient acceptable. [0063] La composition peut également comprendre un milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire un milieu qui est compatible avec l'organisme de l'individu auquel ladite composition doit être administrée. Il peut s'agir, par exemple, d'un solvant non toxique tel que l'eau, de tampon, solutions salines. En particulier, ledit milieu est compatible avec une administration orale.
[0064] Ainsi, de façon préférentielle, la composition comprend au moins une souche bactérienne choisie parmi l'une des souches déposées sous le numéro CNCM 1-5699, le numéro CNCM 1-5700, le numéro CNCM 1-5701 et leur mélange ; et/ou le surnageant de culture obtenu depuis lesdites souches et au moins un excipient acceptable et/ou un milieu physiologiquement acceptable.
[0065] Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la composition comprend la souche déposée sous le numéro CNCM 1-5699.
[0066] Selon une variante, la composition comprend la souche déposée sous le numéro CNCM 1-5699 et la souche déposée sous le numéro CNCM 1-5700 et la souche déposée sous le numéro CNCM 1-5701.
[0067] La souche bactérienne selon l'invention peut être présente sous toute forme produisant les effets escomptés et l'efficacité décrite dans la présente demande. En particulier, la souche peut être sous forme vivante (cultivable ou non), morte, semi-vivante, atténuée ou inactivée. La forme morte, semi-vivante, atténuée ou inactivée induit les mêmes effets que la souche vivante et possède donc elle aussi des propriétés anti-inflammatoires, permettant notamment la prévention et/ou le traitement des maladies respiratoires.
[0068] Ces formes peuvent être obtenues par différentes techniques bien connues de l'homme du métier. On citera par exemple les techniques suivantes : irradiation, inactivation thermique ou lyophilisation, en particulier par la chaleur, l'exposition à un pH approprié, aux UV, aux rayons gamma, aux rayons X ou à la mise sous haute pression.
[0069] Par « semi-vivante » on entend une bactérie à faible activité physiologique dont la capacité à proliférer est réduite, temporairement ou définitivement. Le terme « inactivé » désigne une bactérie qui n'est plus capable, temporairement ou définitivement, de proliférer. Le terme « morte » désigne une bactérie qui n'est plus capable, définitivement, de proliférer. Les bactéries mortes ou inactivées peuvent avoir les membranes cellulaires intactes ou rompues. Ainsi le terme « inactivé » désigne également les extraits et lysats de bactéries obtenues. [0070] Il est particulièrement avantageux d'utiliser de telles formes dans les compositions pharmaceutiques de l'invention.
[0071] La composition selon l'invention peut comprendre en outre au moins un composé additionnel. Le composé additionnel peut être un ingrédient, une molécule, un principe actif, un microorganisme, une bactérie ou un mélange de bactéries. Préférentiellement, le composé additionnel est un agent anti-inflammatoire, plus préférentiellement un corticostéroïde, encore plus préférentiellement le budésonide. Selon une variante, le composé additionnel peut-être un probiotique et/ou un prébiotique.
[0072] La composition selon l'invention se présente sous toute forme acceptable pour être administrée à un patient, préférentiellement un patient humain ou animal (non-humain). Ainsi, la composition selon l'invention vise également les usages vétérinaires.
[0073] De façon préféré, la composition selon l'invention se présente sous forme solide, liquide ou lyophilisée.
[0074] Lorsque la composition se présente sous forme liquide, elle peut notamment comprendre des souches bactériennes selon l'invention et/ou de la souche dérivée et/ou un milieu de culture physiologiquement acceptable pour lesdites bactéries qui permet de les conserver, comme par exemple le milieu BHI, ou un milieu équivalent ne contenant pas de produit dérivé d'origine animale.
[0075] Lorsque la composition selon l'invention se présente sous forme solide, les souches bactériennes selon l'invention et/ou de la souche dérivée peuvent être présentes sous forme lyophilisée, et peuvent comprendre également des excipients tels que par exemple la cellulose microcristalline, le lactose, le saccharose, le fructose, le lévulose, les amidons, le stachyose, le raffinose, l'amylum, le lactate de calcium, le sulfate de magnésium, le citrate de sodium, le calcium stearate, la polyvinylpyrrolidone, la maltodextrine, les galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les pectines, les béta-glucanes, les lactoglobulines, les isomaltooligosaccharides, les polydextroses, le mannitol, le sorbitol, le glycérol, le dioxide de silice, le stéarate de magnésium, la cystéine, le mannose, le galactose, le glucose anhydre, le monoydrate de glucose et/ou leurs mélange.
[0076] L'homme du métier saura choisir au mieux les voies et modes d'administration de la composition selon l'invention, ainsi que les posologies et formes galéniques optimales, selon les critères généralement pris en compte dans la fabrication d'un médicament ou l'établissement d'un traitement pharmaceutique ou vétérinaire. De préférence, la composition selon l'invention est sous une forme adaptée à une administration par voie orale, nasale, parentérale, rectale, sublinguale, oculaire, auriculaire, intramusculaire, intraveineuse, inhalée ou cutanée, plus préférentiellement par voie nasale ou inhalée à l'aide d'un appareil de nébulisation.
[0077] La composition peut se présenter sous toute forme adaptée. Ainsi, la composition selon l'invention peut se présenter sous une forme choisie parmi une poudre, poudre à nébuliser, poudre microencapsulée, poudre microencapsulée à nébuliser, gélule, capsule, comprimé, pastille, granulés, solution, solution à nébuliser, émulsion, émulsion à nébuliser, suspension, suspension à nébuliser, ampoule, suppositoire, inhalateur et un sirop, plus préférentiellement sous une forme d'inhalateur tel qu'un appareil de nébulisation.
[0078] La composition selon l'invention peut éventuellement se présenter sous une forme gastro-résistante, par exemple un comprimé enrobé contenant des bactéries microencapsulées.
[0079] De façon particulièrement préférée, la composition comprend au moins 103 unités formant des colonies (UFC) de bactéries par dose quotidienne de composition à administrer, préférentiellement de 104 à 109 UFC, plus préférentiellement de 105 à 107 UFC.
[0080] Préférentiellement cela correspond à une dose quotidienne de bactéries à administrer, quel que soit le poids de la personne ou de l'animal. Ainsi et de façon préférée, cette dose est administrée en une seule fois. La composition utile comprend alors au moins 103, préférentiellement de 104 à 109 UFC, encore plus préférentiellement de 105 à 107 UFC de bactéries par dose quotidienne à administrer.
[0081] Lesdites bactéries sont un mélange de bactéries correspondant ou issu d'une des souches selon l'invention, y compris les souches dérivées.
[0082] Le terme CFU (Colony Forming Unit) ou UFC (Unité Formant Colonie) est une unité permettant de dénombrer le nombre de bactéries capables de donner naissance à une colonie lors de la propagation, c'est-à-dire des bactéries viables. Il faut comprendre que des bactéries non viables peuvent également être présentes dans les compositions et qu'en général, elles ne devraient pas avoir d'effet négatif sur les propriétés des bactéries vivantes de la composition.
[0083] Préférentiellement, la dose quotidienne est mesurée par gramme ou millilitre de la composition selon l'invention finale.
[0084] Selon un autre objet préféré, lorsque la composition selon l'invention comprend un mélange de bactéries vivantes ou non, ledit mélange comprenant au moins des bactéries vivantes, la composition comprend préférentiellement au moins 1% de bactéries vivantes (en nombre), plus préférentiellement au moins 10% de bactéries vivantes (en nombre), encore plus préférentiellement au moins 50% de bactéries vivantes (en nombre).
[0085] Les bactéries vivantes sont un mélange de bactéries correspondant à l'une des souches selon l'invention, y compris les souches dérivées.
[0086] Dans le cas de la mise en œuvre d'un surnageant de l'une quelconque des souches bactériennes susmentionnées, la composition selon l'invention l'incluant peut notamment en comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de 5 à 95 % en poids, en particulier de 10 à 90 % en poids et plus particulièrement de 15 à 85 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
[0087] Ainsi, une composition selon l'invention peut comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de 5 à 95 %, en particulier de 10 à 90 % en poids, plus particulièrement de 15 à 85 % en poids, de surnageant par rapport au poids total de la composition.
[0088] Lorsque la composition est destinée à un usage thérapeutique, la composition comprend au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable, la composition selon l'invention est alors une composition pharmaceutique.
[0089] Par « excipient pharmaceutiquement acceptable », on entend ici un excipient dont l'administration à un individu ne s'accompagne pas d'effets délétères significatifs. Les excipients pharmaceutiquement acceptables sont bien connus de l'homme du métier.
[0090] Ainsi, l'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant le ou les ingrédients inclus dans la composition selon l'invention et selon l'un des quelconques modes de réalisation décrits précédemment. Ladite composition pharmaceutique est un médicament.
[0091] Selon un autre aspect, la composition selon l'invention peut se présenter sous la forme d'un produit alimentaire, d'une boisson, d'un nutraceutique, d'un additif alimentaire, d'un complément alimentaire ou d'un produit laitier.
[0092] Lorsque, la composition selon l'invention est comprise dans un complément alimentaire pour une administration par la voie orale, celle-ci peut être sous forme de capsules, de gélules, de capsules molles, de comprimés, de comprimés dragéifiés, de pilules, de pâtes, de pastilles, de gommes, de solutions ou émulsions buvables, de sirop ou de gel. [0093] Un complément alimentaire selon la présente invention peut comprendre en outre un édulcorant, un stabilisant, un antioxydant, un additif, un agent aromatisant et/ou un colorant. La formulation de celui-ci est effectuée au moyen des procédés usuels pour produire des comprimés dragéifiés, des gélules, des gels, des hydrogels pour libération contrôlée, des émulsions, des comprimés ou des capsules.
[0094] Une composition selon la présente invention peut également être sous la forme d'une composition nutritionnelle. Une telle composition nutritionnelle selon la présente invention peut être sous la forme d'un yaourt, un aliment fermenté, une barre de céréales, des céréales pour le petit-déjeuner, un dessert, un aliment congelé, un aliment réfrigéré, un aliment surgelé, une soupe, un aliment pour animaux de compagnie, une suspension liquide, une poudre, un comprimé, une gomme ou un bonbon.
[0095] Une composition nutritionnelle selon la présente invention peut comprendre en outre au moins un ingrédient choisi parmi : des antioxydants, des huiles de poisson, huiles végétales, DHA, EPA, des vitamines, des minéraux, des phytonutriments, une protéine, un lipide, des probiotiques, des prébiotiques, des postbiotiques et des combinaisons de ceux-ci.
[0096] Utilisation
[0097] La composition selon l'invention est utile comme médicament pour un usage dans la santé humaine ou vétérinaire.
[0098] Préférentiellement, la composition selon l'invention est destinée à prévenir et/ ou traiter l'inflammation et ainsi être utilisée dans le traitement et/ou la prévention des maladies inflammatoires, plus préférentiellement des maladies respiratoires et/ou des maladies inflammatoires de l'intestin et/ou l'arthrite rhumatoïde et/ou des maladies inflammatoires associées à une infection virale ou bactérienne.
[0099] On peut ainsi citer à titre d'exemple l'asthme (léger, modéré ou sévère), par exemple, bronchique, allergique, intrinsèque, extrinsèque, induit par l'exercice, d'origine médicamenteuse (y compris l'aspirine et aux anti-inflammatoires non stéroïdiens - AINS) et l'asthme induit par la poussière, l'asthme résistant aux stéroïdes, la bronchite, y compris la bronchite infectieuse et à éosinophiles, d'une maladie pulmonaire obstructive chronique (COPD), comme la BPCO (broncho-pneumopathie chronique obstructive), la fibrose cystique, la fibrose pulmonaire, y compris cryptogénique alvéolite fibrosante, la fibrose pulmonaire idiopathique, pneumonies interstitielles idiopathiques, la fibrose compliquant une thérapie antinéoplasique et chronique l'infection, y compris la tuberculose et l'aspergillose et d'autres infections fongiques; complications de la transplantation pulmonaire; vascularite et troubles thrombotiques du système vasculaire pulmonaire et hypertension artérielle pulmonaire (y compris l'hypertension artérielle pulmonaire); activité antitussive comprenant le traitement de la toux chronique associée à des affections inflammatoires et sécrétoires des voies respiratoires et la toux iatrogène; rhinite aiguë et chronique, y compris la rhinite médicamenteuse, et la rhinite vasomotrice; per annuelle et saisonnière rhinite allergique y compris la rhinite nerveuse (rhume des foins); polypose nasale; infection aiguë virale, y compris le rhume, et l'infection due au virus respiratoire syncytial (VRS), la grippe, les bronchopathies pulmonaires, les infections aux coronavirus (SRAS notamment) et l'adénovirus, un œdème pulmonaire, embolie pulmonaire, pneumonie, sarcoïdose pulmonaire, la silicose, poumon de fermier et les maladies apparentées; pneumopathie d'hypersensibilité, insuffisance respiratoire, syndrome de détresse respiratoire aiguë, l'emphysème, la bronchite chronique, la tuberculose et le cancer du poumon.
[0100] La composition selon l'invention vise également les pathologies respiratoires ayant des « dérégulations immunitaires » communes avec celles observées dans l'asthme comme l'induction de certaines cytokines (IL-6, TSLP, IL-8, IL-5, IL-13, IL-17) et des dérégulations mucosales (hyper production de mucus).
[0101] En particulier, les utilisations et les compositions de la présente invention englobent la prévention et le traitement des maladies respiratoires chroniques, par exemple l'asthme, la BPCO et la rhinite. Encore plus particulièrement, les utilisations et les compositions de la présente invention portent sur la prévention et le traitement de l'asthme.
[0102] Les inventeurs ont démontré que les souches selon l'invention sont particulièrement efficaces pour prévenir l'asthme lorsqu'elles sont administrées avant l'apparition de l'ensemble de symptômes de la maladie. Ainsi, l'utilisation de la souche de l'invention et la composition la comprenant pourront notamment être utilisées efficacement pour prévenir l'apparition de l'asthme chez des patients connus pour leur prédisposition pour cette pathologie (par exemple, des patients ayant une prédisposition familiale au développement de l'asthme).
[0103] Etant donné les voies inflammatoires communes, la composition selon l'invention est également utile dans une maladie choisie parmi la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse, la recto-colite ulcéro-hémorragique, la diverticulite, l'cesophagite, la gastrite, la pancréatite, l'ulcère gastro-duodénal et le syndrome du côlon irritable.
[0104] Enfin, la composition selon l'invention est particulièrement d'intérêt lorsque l'Homme ou l'animal est résistant et/ou réfractaire aux corticostéroïdes.
[0105] L'invention est à présent illustrée par des exemples non limitatifs de compositions selon l'invention et par des résultats.
[0106] Exemples
[0107] Exemple 1 - Effet anti-inflammatoire des souches selon l'invention.
[0108] Des cellules BEAS-2B ont été co-incubées avec du TNF-a (lpg/ml) seul ou avec des bactéries E. faecalis selon l'invention (CNCM 1-5699, CNCM 1-5700, CNCM 1-5701) ou hors invention (CNCM 1-4969, E. faecalis 1 ou E. faecalis 2) MOI 250:1. Après 6h d'incubation, la concentration d'IL-8 a été mesurée dans le surnageant. Les niveaux d'IL-8 sont exprimés en pourcentage du taux d'IL-8 induit par une stimulation de TNF-a de 6h. Les résultats correspondent à la médiane de 5 expériences, au moins n= 3-6 réplicats techniques par condition. * p<0.05 comparé avec le contrôle TNF-a.
[0109] Les inventeurs ont observé que les trois souches d'E. faecalis selon l'invention (CNCM 1-5699, CNCM 1-5700, CNCM 1-5701) présentent un effet « anti-IL-8 » fort, respectivement de 93%, 75% et 70% comparativement à la souche CNCM 1-4969 et à deux autres souches d'E. faecalis. La souche CNCM 1-4969 présente certes un effet, mais plus faible que les trois souches selon l'invention. Ainsi, les souches E. faecalis selon l'invention présentent des propriétés antiinflammatoires utiles (Figure 1).
[0110] Exemple 2 - Effet anti-inflammatoire ex-vivo des souches selon l'invention.
[0111] Les inventeurs ont poursuivi leurs travaux en comparant les 3 souches selon l'invention avec 5 autres souches d'E. faecalis (CNCM 1-4969, E. faecalis 1, E. faecalis 2, E. faecalis 3, E. faecalis 4).
[0112] Les expiants de poumons, ou PCLS (« Precision Cut Lung Slices »), sont des coupes en culture de 200-250pm, de poumons provenant de souris axéniques. Les expiants sont co- incubés ou non avec 50 UFC (unités formant des colonies) de bactéries : souches d'E. faecalis. Après 24h, les surnageants de culture sont prélevés et la quantité de cytokines mesurée par Luminex. Les résultats représentent le pourcentage de cytokine mesuré, comparé à la condition du milieu seul. Les données sont regroupées de 4 expériences, au moins n = 6 réplicats biologiques par condition. * p<0.05 comparé avec le contrôle milieu.
[0113] Les inventeurs ont ainsi caractérisé les effets anti-inflammatoires sur un modèle d'explants de poumons qui est plus proche de la physiologie pulmonaire en comparaison des lignées cellulaires. Les différentes souches d'E. faecalis ont été co-incubées avec des expiants de poumons de souris axéniques en culture ex vivo. Ces expiants ont une production basale de différentes cytokines, laquelle peut être modifiée par la présence d'éléments immunomodulateurs.
[0114] Les inventeurs ont mis en évidence que les 3 souches d'E. faecalis selon l'invention possèdent un effet anti-inflammatoire sur des expiants de poumons de souris. Elles réduisent en particulier la libération de l'IL-18, l'IL-2, l'IL-5, le TNF-a ou encore l'IL-6 (Figures 2 et 3). La souche CNCM 1-4969 présente un effet significativement plus faible que les trois souches selon l'invention et les 4 autres souches testées (E. faecalis 1, E. faecalis 2, E. faecalis 3, E. faecalis 4) ont des effets neutres ou pro-inflammatoires (Figure 3).
[0115] Exemple 3 - Etude sur des modèles précliniques d'asthme induit par HDM
[0116] Le protocole du modèle préclinique d'asthme allergique induit par HDM chez le souriceau est représenté dans la Figure 4, panel A.
[0117] Des souriceaux ont été sensibilisés par une administration intranasale d'HDM (House Dust Mite - acarien de poussière) (lpg) à J0 (Sensibilisation) puis à lOpg de J7 à Jll (Challenges). Les souches selon l'invention ont été administrées par voie intranasale à 106 UFC tous les 2 jours de J-2 à J10 (Figure 4 Panel A). A J12, les inventeurs ont analysé le suivi de croissance, procédé à un lavage bronchoalvéolaire (LBA) et analysé les cellules et les cytokines du tissu pulmonaire.
[0118] Le protocole du modèle préclinique d'asthme allergique induit par HDM chez la souris adulte est présenté dans la Figure 4, panel B.
[0119] Des souris adultes ont également été sensibilisées par une administration intranasale d'HDM (House Dust Mite - acarien de poussière) (25 pg) à J0 et J7 (Sensibilisation) puis à lOpg de J14 à J16 (Challenges). Les souches selon l'invention ont été administrées par voie intranasale à 106 UFC tous les 2 jours de J-2 à J16. Dans un des groupes contrôle, du budésonide a été administré par voie intranasale (3mg/kg) de J14 à J16 (Figure 4 Panel B). A J17, les inventeurs ont analysé le suivi de croissance, procédé à un lavage bronchoalvéolaire des cellules et analysé les cytokines retrouvées dans le lavage et dans le tissu pulmonaire.
[0120] Les résultats sont représentés dans le Tableau 2 ci-après.
[0121] [Tableau 2]
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en souligné : p<0.05
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[0122] Les cellules immunes retrouvées dans le LBA, les cytokines TH2 présentes dans les poumons et le LBA, ainsi que l'histopathologie sont des marqueurs du développement de l'asthme communs aux modèles souris d'asthme et aux patients humains. Les données du Tableau 2 proviennent d'une expérience avec 8 et 10 animaux par groupe, chez les souriceaux et chez les adultes, respectivement. Elles indiquent les effets protecteurs (valeurs positives) ou aggravants (valeurs négatives) de l'administration des souches d'E. faecalis selon l'invention (CNCM 1-5699, CNCM 1-5700, CNCM 1-5701) et hors invention (CNCM 1-4969) en comparaison avec les groupes d'animaux traités uniquement à l'HDM. Dans le protocole utilisé chez les souris adultes, les effets ont été comparés à ceux du budésonide, un co rti co stéroïde de référence en clinique. Dans le protocole chez les souriceaux, cette comparaison n'a pas été faite.
[0123] Les inventeurs ont ainsi montré que l'administration par voie intranasale des souches d'E. faecalis selon l'invention possèdent un effet anti-inflammatoire amélioré par rapport à la souche CNCM 1-4969 dans 2 modèles précliniques d'asthme chez la souris nouveau-né et adulte. Elles réduisent le recrutement de cellules retrouvées dans le LBA, ainsi que la libération de cytokines pro-inflammatoires dans les poumons, notamment l'IL-5, l'IL-4, l'IL-13 et l'IFN-y. [0124] Exemple 4 - Effet de la souche CNCM 1-5699 sur les fonctions respiratoires de souris adultes dans un modèle préclinique d'asthme induit par HDM
[0125] Des souris adultes ont été sensibilisées par une administration intranasale d'HDM (25pg) à J0 et J7 puis à 10pg de J14 à J16 (Figure 4 Panel B). La souche CNCM 1-5699 a été administrée par voie intranasale à 106 UFC tous les 2 jours de J-2 à J16. Du budésonide a été administré par voie intranasale (3mg/kg) de J14 à J16. La fonction pulmonaire a été mesurée tous les deux jours à l'aide d'un oxymètre de pouls à J-2 avant le premier traitement, puis tous les 2 jours jusqu'à la fin de l'expérience. La mesure permet d'obtenir le niveau de saturation en oxygène du sang, qui peut être affectée en cas d'altération de la fonction respiratoire, notamment lors du développement de l'asthme. A J17, les inventeurs ont procédé à une mesure de la résistance dynamique pulmonaire. Un test similaire est utilisé chez l'homme pour diagnostiquer l'hyperréactivité bronchique (HRB), qui est notamment observée dans l'asthme, et qui se traduit par une augmentation de la résistance pulmonaire. Le principe général de ce test de provocation bronchique consiste en l'administration par voie inhalée de doses croissantes de méthacholine, une substance induisant de façon indirecte la contraction du muscle lisse bronchique, avec pour conséquences des modifications du calibre des voies aériennes, une augmentation de leur résistance et une diminution du débit gazeux au travers de celle-ci. Les souris ont été anesthésiées et intubées. Des concentrations croissantes de méthacholine en aérosol ont été administrées. La résistance a été enregistrée avec un pléthysmographe.
[0126] Les résultats sont représentés dans les figures 5 et 6.
[0127] L'asthme allergique a été induit chez des souris C57BL/6J naïves par des administrations intranasales d'HDM (Figure 4 Panel B). La souche CNCM 1-5699 a été administrée tous les deux jours par voie intranasale à raison de 1.106 UFC/souris de J-2 à J16. L'oxymétrie de pouls a été mesurée tous les deux jours de J-2 à J16. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM de 10 souris par groupe. Après évaluation statistique des différences entre les groupes expérimentaux, les valeurs p inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives : + p<0,05, groupe PBS comparé au groupe HDM ; *p<0,05 groupe HDM comparé aux groupes traités (Figure 5).
[0128] L'asthme allergique a été induit chez des souris C57BL/6J naïves par des administrations intranasales d'HDM (Figure 4 Panel B). La souche CNCM 1-5699 a été administrée tous les deux jours par voie intranasale à raison de 1.106 UFC/souris de J-2 à J16. Les souris ont été euthanasiées à J17, 24 heures après la dernière provocation, et la résistance des voies respiratoires a été mesurée avec soustraction de la ligne de base du PBS. Les données sont représentées en tant que moyenne ± SEM de 10 souris par groupe. Après évaluation statistique des différences entre les groupes expérimentaux, les valeurs p inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives : + p<0,05, groupe PBS comparé au groupe HDM ; *p<0,05 groupe HDM comparé aux groupes traités (Figure 6).
[0129] Les inventeurs ont ainsi montré que l'administration par voie intranasale de la souche d'E. faecalis CNCM 1-5699 selon l'invention possède un effet protecteur de la fonction respiratoire dans un modèle préclinique d'asthme chez la souris. Ils ont observé une meilleure oxygénation du sang (Figure 5) et une meilleure contractibilité du poumon (Figure 6) en présence de la souche CNCM 1-5699, dans un modèle préclinique d'asthme induit par l'HDM.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Souche bactérienne de l'espèce d'Enterococcus faecalis déposée sous le numéro CNCM 1-5699 ou CNCM 1-5700 ou CNCM 1-5701.
[Revendication 2] Souche bactérienne selon la revendication 1, caractérisée en ce que la souche est la souche d'Enterococcus faecalis déposée sous le numéro CNCM 1-5699.
[Revendication 3] Surnageant de culture obtenu depuis la souche bactérienne selon l'une des revendications précédentes.
[Revendication 4] Composition comprenant (i) au moins une souche bactérienne selon l'une des revendications 1 ou 2 et/ou (ii) un surnageant selon la revendication 3 et (iii) au moins un excipient acceptable.
[Revendication 5] Composition selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle comprend les trois souches d' Enterococcus faecalis déposées respectivement sous les numéros CNCM 1-5699 ou CNCM 1-5700 ou CNCM 1-5701.
[Revendication 6] Composition selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que la bactérie est vivante, morte, atténuée ou inactivée.
[Revendication 7] Composition selon l'une des revendication 4 à 6, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme solide, liquide ou lyophilisée.
[Revendication 8] Composition selon l'une des revendications 4 à 7, caractérisée en ce que les bactéries vivantes représentent au moins 103 UFC.
[Revendication 9] Composition selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisée en ce que ladite composition comprend également un agent anti-inflammatoire, préférentiellement un corticostéroïde.
[Revendication 10] Composition selon l'une des revendication 4 à 9 pour son utilisation comme médicament chez l'Homme ou l'animal.
[Revendication 11] Composition selon la revendication précédente, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des maladies respiratoires et/ou des maladies inflammatoires de l'intestin et/ou l'arthrite rhumatoïde et/ou des maladies inflammatoires associées à une infection virale ou bactérienne.
[Revendication 12] Composition selon la revendication précédente, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une maladie choisie parmi l'asthme, la bronchite, la bronchiolite, la BPCO, la fibrose pulmonaire, la rhinite.
[Revendication 13] Composition selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que l'Homme ou l'animal est résistant aux corticostéroïdes.
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